INTRODUCCION El término cinética enzimática implica el estudio de la velocidad de una reacción catalizada por una enzima y los efectos que pueden tener factores como los inhibidores. Uno de los principales estudios que se realizan en una enzima es medir el efecto en la velocidad de la reacción cuando se modifican las concentraciones del sustrato y se mantienen constantes la concentración de enzima, el pH, la fuerza iónica del medio, la temperatura, entre otros. Se evalúa la influencia de estos factores en la reacción catalizada por enzimas con la finalidad de determinar los intermediarios en una reacción y el papel que juegan en la reacción enzimática, es decir, para predecir mecanismos de reacción. Es esencial entender estos mecanismos para desarrollar nuevas herramientas moleculares, por ejemplo, para combatir enfermedades en las que se conoce a la enzima que la produce. También es usual medir la actividad enzimática con diferentes sustratos para entender su especificidad o bien, medir la actividad de la enzima de diferentes tejidos u organismos para entender cómo las diferencias en actividad están relacionadas con la función y/o la fisiología del organismo del que proceden.
OBJETIVOS
Comprobar la reacción sobre el peróxido de hidrógeno por acción de la enzima catalasa, presente en tejidos animales y vegetales determinando los productos de reacción.
Estudiar algunos factores que afectan la actividad enzimática, como la temperatura, el pH, la concentración del sustrato y de la enzima y la presencia de inhibidores.
Confrontar los conocimientos teóricos adquiridos en clases con las actividades experimentales en el laboratorio.
MATERIALES Y REACTIVOS
Tubos de ensayo
Vasos de precipitado de 250 ml
Estufa
Agitadores
Papel tornasol o indicador de pH
Ácido clorhídrico 0.1 N
Hidróxido de sodio 0.1 N
Mortero y mango
Hígado de res
Papa cruda
Cuchilla
Solución de peróxido de hidrógeno
Cebada en remojo
Hielo
Almidón
MARCO TEORICO Los enzimas son biomoléculas especializadas en la catálisis de las reacciones químicas que tienen lugar en la célula. Son muy eficaces como catalizadores ya que son capaces de aumentar la velocidad de las reacciones químicas mucho más que cualquier catalizador artificial conocido, y además son altamente específicos ya que cada uno de ellos induce la transformación de un sólo tipo de sustancia y no de otras que se puedan encontrar en el medio de reacción. FACTORES QUE AFECTAN A LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA Diferentes factores ambientales pueden afectar a la actividad enzimática. Destacaremos dos: el pH y la temperatura. EFECTO DEL pH: El pH es otro factor que influye en la actividad enzimática, debido a que el pH influye en la ionización de los grupos funcionales de los aminoácidos que forman la proteína enzimática. Cada enzima realiza su acción dentro de un determinado intervalo de pH, dentro de este intervalo habrá un pH óptimo donde la actividad enzimática será máxima. Por debajo del pH mínimo o por encima del pH máximo el enzima se inactiva ya que se desnaturaliza. En la mayoría de las enzimas el pH óptimo está próximo a la neutralidad, aunque hay excepciones. La mayoría de los enzimas presentan un pH óptimo para el cual su actividad es máxima; por encima o por debajo de ese pH la actividad disminuye bruscamente. Este efecto se debe a que, al ser los enzimas de naturaleza proteica, al igual que otras proteínas, se desnaturalizan y pierden su actividad si el pH varía más allá de unos límites estrechos. De ahí la conocida importancia biológica de los sistemas tampón.
En la mayor parte de los casos el pH óptimo está próximo a la neutralidad, en consonancia con el pH intracelular, pero existen enzimas con pH óptimo muy diverso según sea el pH del medio en el que habitualmente actúan (los enzimas proteolíticos del jugo gástrico tienen pHs óptimos próximos a 2 ya que este es el pH de dicho jugo). Por último existen algunos enzimas a los que el pH no afecta en absoluto. EFECTO DE LA TEMPERATURA: Al igual que ocurre con la mayoría de las reacciones químicas, la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas se incrementa con la temperatura. La variación de la actividad enzimática con la temperatura es diferente de unos enzimas a otros en función de la barrera de energía de activación de la reacción catalizada. Sin embargo, a diferencia de lo que ocurre en otras reacciones químicas, en las reacciones catalizadas por enzimas se produce un brusco descenso de la actividad cuando se alcanza una temperatura crítica. Este efecto no es más que un reflejo de la desnaturalización térmica del enzima cuando se alcanza dicha temperatura. La Temperatura influye en la actividad enzimática. En general por cada 10ºC que aumente la temperatura la velocidad de la reacción aumenta de 2 a 4 veces. Esta regla se cumple hasta que la temperatura alcanza un valor máximo (T° óptima) donde la actividad es máxima. Esto se debe a que al aumentar la T° aumenta el movimiento de las moléculas y, por tanto aumenta la probabilidad de encuentro entre el S y el E. Si la T° aumenta por encima de la T° óptima, disminuye e incluso cesa la actividad enzimática debido a que la enzima se desnaturaliza. Cada enzima posee una T° óptima, en las enzimas humanas suele estar alrededor de 37ºC. Los animales poiquilotermos debido a que carecen de mecanismos para regular la Tª corporal, se ven obligados a hibernar en la estación fría pues la actividad de sus enzimas debido a las bajas temperaturas es muy baja.
INHIBIDORES: Son compuestos químicos que se unen al enzima, en distintos puntos del mismo y disminuyen o incluso impiden su actividad. Estos compuestos pueden ser de distintos tipos: iones, moléculas orgánicas y a veces el producto final de la reacción. A la acción que realizan se la denomina inhibición. La inhibición puede ser: ·Inhibición irreversible: Cuando el inhibidor impide permanentemente la actividad enzimática, bien porque se une de forma permanente con grupos funcionales importantes del centro activo o bien porque altera su estructura. A estos inhibidores se les denomina venenos y a la inhibición que realizan se la denomina envenenamiento del enzima. Ej. La penicilina que inhibe las enzimas que sintetizan la pared bacteriana. El ión cianuro actúa sobre la citocromo oxidasa (enzima respiratorio). ·Inhibición reversible: El inhibidor se une al enzima de forma temporal mediante enlaces débiles e impide el normal funcionamiento del mism, pero no la inutiliza permanentemente. Puede ser de dos tipos: Competitiva: El inhibidor es similar al sustrato y se puede unir al centro activo del enzima impidiendo que lo haga el sustrato. Es decir ambos, inhibidor y sustrato compiten por unirse al centro activo del enzima. La acción suele anularse aumentando la concentración del sustrato No competitiva: El inhibidor no compite con el sustrato, puede actuar de 2 formas: -Sobre el enzima, uniéndose a el en un lugar diferente al centro activo y modificando su estructura lo que dificulta que el enzima se pueda unir con el sustrato. -Sobre el complejo E-S uniéndose a él y dificultando su desintegración y por lo tanto la formación de los productos.
PROCEDIMIENTO 1. FACTORES QUE AFECTAN LA ACTIVIDAD ENZIMATICA
Tubo 1: 5 ml de Extracto de papa e hígado + 3 ml de Peróxido de hidrógeno al 3% Acción de la temperatura en la catalasa de la papa e hígado: Macerar un trozo de papa en 15 ml de agua y recoger el extracto.
Tubo 2: 5 ml de Extracto de papa e hígado + hielo= temperatura de 5°c+ 3 ml de Peróxido de hidrógeno al 3% Tubo 3: 5 ml de Extracto de papa e hígado + Ebullir= 84°c + 3 ml de Peróxido de hidrógeno al 3%
Repetir el procedimiento anterior reemplazando la papa por hígado. Realizar las respectivas y resultados.
anotaciones analizar los
2. FACTORES QUE AFECTAN LA ACTIVIDAD ENZIMATICA
Influencia del pH en la acción de la catalasa de la papa: Macerar un trozo de papa en 15 ml de agua y recoger el extracto.
Tubo 1: 5 ml de Extracto de papa + 2 ml de ácido clorhídrico al 0.1N + 3 ml de Peróxido de hidrógeno al 3% Tubo 2: 5 ml de Extracto de papa + 2 ml de solución de hidróxido de sodio + 3 ml de Peróxido de hidrógeno al 3% Tubo 3: 5 ml de Extracto de papa + 3 ml de Peróxido de hidrógeno al 3%
Realizar las anotaciones respectivas a la toma de pH con papel indicador y analizar los resultados.
3.
INFLUENCIA DE LA SUPERFICIE DE LA MUESTRA DEL HÍGADO EN SU ACCIÓN ENZIMÁTICA
Porción de hígado 1: Macerar + 3 ml de Peróxido de hidrógeno Porción de hígado 2: Dividir en trozos + 3 ml de Peróxido de hidrógeno
Comparar las reacciones de los dos montajes.
RESULTADOS
1. ACCIÓN DE LA TEMPERATURA EN LA ACCIÓN DE LA CATALASA: 1.1 Acción de la temperatura en la acción de la catalasa de la papa: Tubo 1: En esta parte se observó una reacción abundante de la enzima catalasa o peroxidasa y se evidenció por la producción de burbujas de aire en la superficie del tubo, la temperatura estaba en 28°C. Tubo 2: En este tubo la reacción fue muy lenta, casi nula, no se evidenció gran producción de burbujas de aire, la temperatura estaba en 4°C. Tubo 3: Igualmente en este tubo no se presentó reacción enzimática evidente, la temperatura estaba en 92°C.
1.2 Acción de la temperatura en la acción de la catalasa del hígado: Los resultados similares
a
obtenidos en el ensayo realizado con el hígado de res fueron
los
obtenidos
con
la
papa,
aunque
un
poco
disminuidos
proporcionalmente, debido a la interferencia que puede darse entre las reacciones enzimáticas con otros componentes celulares presentes en el tejido animal.
2. INFLUENCIA DEL PH EN LA ACCIÓN DE LA CATALASA DE LA PAPA: Con referencia a la acción que tiene el pH en la actividad de las enzimas se pudo constatar que en los rangos de pHs ácidos y básicos trabajados en el experimento, según la adición de ácido clorhídrico e hidróxido de sodio, respectivamente, se observó una disminución en la reacción enzimática con muy poca actividad de la catalasa, lo que se demuestra con la baja producción de burbujas de oxígeno,
producto de la degradación del peróxido de hidrógeno adicionado para revelar dicha reacción.
3. INFLUENCIA DE LA SUPERFICIE DE LA MUESTRA DEL HÍGADO EN SU ACCIÓN ENZIMÁTICA En este experimento se pudo observar que ocurre una reacción enzimática mayor, con abundante producción de burbujeo en el pedazo de hígado que fue macerado, mientras en los pedazos cortados en trozos grandes fue inferior, notándose sólo reacción superficial en las partes expuestas al peróxido de hidrógeno.
ANALISIS DE RESULTADOS.
1.1 En este experimento del efecto de la temperatura sobre la acción de la amilasa de la papa, se mide la actividad enzimática a diferentes temperaturas, en las cuales se mostraron reacciones diferentes. Las temperaturas de 90°C y 4°C, son temperaturas extremas en las cuales las enzimas, y en particular las amilasas disminuyen su acción y se inhiben totalmente, debido a la desnaturalización de la molécula proteica, de la cual están conformadas las enzimas. A 28°C y temperaturas cercanas a la temperatura ambiental y corporal las enzimas presentan su mejor funcionamiento, es decir, se encuentran en un rango óptimo de temperaturas.
Esto era de esperarse, ya que cada enzima tiene un rango de temperatura óptima y, en el caso de la amilasa, al encontrarse ésta en el cuerpo humano y animales (que siempre tienen una temperatura de 37° C), se supone que a temperatura ambiente no va a perder su actividad, pero sí disminuirla, ya que los choques intermoleculares van a ser menores. Sin embargo, al disminuir demasiado la temperatura, los choques entre las moléculas disminuyen también, por lo que la actividad enzimática baja hasta el punto en el que no se puede ver en el experimento. Por el contrario, al aumentar la temperatura de incubación a 90° C, los choques entre las moléculas se van a acrecentar de tal forma que la enzima se va a desnaturalizar. Es por ello que se presume que no se observaron cambios en el tubo.
1.2 Las burbujas que se producen en este tipo de reacciones enzimáticas son básicamente oxígeno que se desprende de la reacción entre las moléculas de peróxido de hidrógeno y la enzima catalasa, que la degrada en agua y oxígeno molecular que se libera en forma de gas.
2. Por su acción, la amilasa es sensible a una acidez elevada y se vuelve inactiva a pH 3,3 o a pH menor a 0°C por 15 min. El pH óptimo de acción está dentro del rango 5-7, siendo de 6,5 para la alfa-amilasa bacteriana y pancreática. La enzima es resistente al calor, pues a 70°C conserva un 70% de su actividad. Actúa sobre almidones crudos y gelatinizados. 3. Estos resultados se deben a que en el hígado macerado existe una mayor superficie de contacto entre las enzimas y el sustrato correspondiente, es decir, el peróxido de hidrógeno agregado, y además las enzimas catalasas del tejido se hacen más abundantes con el macerado, pues se extraen del interior de los tejidos y
contactan mejor y en mayor número con el peróxido, haciendo más evidente la reacción enzimática.
CONCLUSIONES
Como producto del análisis de los resultados del experimento realizado en el laboratorio, se pueden extraer las siguientes conclusiones:
La temperatura es un factor determinante en las reacciones enzimáticas porque acelera o retarda la acción de las enzimas, lo que se evidencia con la producción de burbujas.
Para que la catalasa funcione correctamente debe tener un ph neutro y temperatura ambiente.
BIBLIOGRAFIA
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BABRET, A. CHAVEZ, C. Biología. Editorial Prentice Hall. New Jersey.1992 VILLEE, Claude A. Biología. McGraw-Hill. 1988. http://www.iqb.es/cbasicas/farma/farma01/sec01/c1_003.htm http://www.iqb.es/CBasicas/Farma/Farma01/Sec01/C1_003.htm http://www.biosci.uga.edu/almanac/bio_103/notes/may_13.html. http://www.arrakis.es/~lluengo/transporte.html
ANEXOS
FACTORES QUE AFECTAN LA ACTIVIDAD ENZIMATICA
CAMILO ANDRES CARDENAS CARLOS JOSE PINEDA YOHANDRY RUIZ
DOCENTE: DILIA GALVAN BORJA
UNIVERSIDAD DE SUCRE FACULTAD DE EDUCACIÓN Y CIENCIAS PROGRAMA DE BIOLOGIA LABORATORIO DE BIOLOGIA OCTUBRE 11 2013
