OBJETIVOS
Determinar el comportamiento y la variabilidad enzimática de la tirosinasa, bajo diferentes parámetros físicos y químicos (pH, temperatura y concentración)
MARCO TEÓRICO
Las enzimas son catalizadores proteicos que aceleran la velocidad de una reacción. Actúan en condiciones muy suaves, a temperatura por debajo de 70°C, con un PH de 7.Tienen un alto Grado De Especificidad, solamente catalizan la reacción en que participa un sustrato o un grupo de sustratos con ciertas características químicas y geométricas comunes.
Sustrato es una molécula sobre la que actúa una enzima. El sustrato se une al sitio activo de la enzima, y se forma un complejo transformado en enzima-sustrato. El sustrato por acción de la enzima es producto y es liberado del sitio activo, quedando libre para recibir otro sustrato.
ESPECIFICIDAD, SITIO ACTIVO Y GRUPOS CATALÍTICOS Las enzimas se unen a los sustratos por medio de interacciones hidrofóbicas y electrostáticas, puentes de hidrógeno y fuerzas de van der Waals. Los residuos de aminoácidos de la enzima que participan en la interacción con el sustrato están alejados unos de otros; pero como resultado de la unión del plegamiento de la proteína, se agrupan para formar el sitio activo de la enzima. Algunos residuos participan solo en la unión del sustrato y definen una región del sitio activo que se llama sitio de fijación o de unión de los sustratos. Los catalíticos (residuos), se encargan de la transformación del sustrato en producto. Normalmente, el número de residuos que intervienen en la unión del sustrato es mayor que el de residuos catalíticos. Debido al plegamiento de la proteína, su localización se encuentra en los surcos o huecos de la superficie de la encima.
COMPLEJO ENZIMA-SUSTRATO La unión del sustrato a la enzima se puede explicar por medio de dos mecanismos:
Modelo De La Llave Y La Cerradura: Considera que el sitio activo de la enzima está
preformado, de tal manera que los residuos de aminoácidos mantienen una posición fija y complementaria a los grupos del sustrato. La isoenzima presente en las lágrimas es capaz de hidrolizar uno de los polisacáridos presentes en las paredes bacterianas, es uno de los pocos casos que se adapta a este modelo
Modelo Del Ajuste Inducido: Se propone que al interactuar el sustrato con la enzima se inducen cambios conformacionales en ésta, que dan lugar a la formación del sitio activo. Se ha dicho que la enzima asemeja a un guante vacío, y la presencia del sustrato equivale a introducir la mano en el guante, con lo que da la forma precisa al sitio activo.
CINETICA ENZIMATICA La cinética enzimática estudia la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas. Estos estudios proporcionan información directa acerca del mecanismo de la reacción catalítica y de la especificidad del enzima. La velocidad de una reacción catalizada por un enzima puede medirse con relativa facilidad, ya que en muchos casos no es necesario purificar o aislar el enzima. La medida se realiza siempre en las condiciones óptimas de pH, temperatura, presencia de cofactores, etc, y se utilizan concentraciones saturantes de sustrato. En estas condiciones, la velocidad de reacción observada es la velocidad máxima (Vmax). La velocidad puede determinarse bien midiendo la aparición de los productos o la desaparición de los reactivos. Al seguir la velocidad de aparición de producto (o de desaparición del sustrato) en función del tiempo se obtiene la llamada curva de avance de la reacción, o simplemente, la cinética de la reacción. A medida que la reacción transcurre, la velocidad de acumulación del producto va disminuyendo porque se va consumiendo el sustrato de la reacción. Para evitar esta complicación se procede a medir la velocidad inicial de la reacción (v0). La velocidad inicial de la reacción es igual a la pendiente de la curva de avance a tiempo cero. De esta forma, la medida de v0 se realiza antes de que se consuma el 10% del total del sustrato, de forma que pueda considerarse la [S] como esencialmente constante a lo largo del experimento. Además, en estas condiciones no es necesario considerar la reacción inversa, ya que la cantidad de producto formada es tan pequeña que la reacción inversa apenas ocurre. De esta forma se simplifican enormemente las ecuaciones de velocidad.
TIROSINASA En esta práctica, se va a extraer la enzima tirosinasa y se hará el estudio de sus parámetros cinéticos. Esta es sólo una de miles de enzimas que trabajan dentro de las células, pero que fácilmente se muestran las características principales de la cinética enzimática. Esta práctica implica el aislamiento (extracción) de la enzima tirosinasa a partir de la papa y la posterior medición de su actividad. La tirosinasa es una enzima de tipo oxidorreductasa la cual cataliza la hidroxilación de monofenoles y la oxidación de o-difenoles a o-quinoles, reacciones que convierten a la enzima en clave para la síntesis de pigmentos, como es el caso de la melanina, tanto en eucariotas como en procariotas. El pardeamiento enzimático es una reacción de oxidación en la que interviene como sustrato el oxígeno molecular, catalizada por un tipo de enzimas que se puede encontrar en prácticamente todos los seres vivos, desde las bacterias al hombre. En el hombre es la responsable de la formación de pigmentos del pelo y de la piel. En los cefalópodos produce el pigmento de la tinta, y en los artrópodos participa en el endurecimiento de las cutículas del caparazón, al formar quinonas que reaccionan con las proteínas, insolubilizándolas. En los vegetales no se conoce con precisión cuál es su papel fisiológico. El enzima responsable del pardeamiento enzimático recibe el nombre de polifenoloxidasa, fenolasa o tirosinasa, en este último caso especialmente cuando se hace referencia a animales, ya que en ellos la tirosina es el principal substrato1. También se ha utilizado el término cresolasa, aplicado a la enzima de vegetales. Se descubrió primero en los champiñones, en los que el efecto de pardeamiento tras un daño mecánico, como el corte, es muy evidente. En el campo de los alimentos, el pardeamiento enzimático puede ser un problema muy serio en frutas, champiñones, papas y otros vegetales, y también en algunos crustáceos, e incluso en la industria del vino, al producir alteraciones en el color que reducen el valor comercial de los productos, o incluso los hacen inaceptables para el consumidor. Estas pérdidas son muy importantes en el caso de las frutas tropicales y de los camarones, productos trascendentales para la economía de muchos países poco desarrollados. A pesar del nombre genérico de “pardeamiento”, los colores formados son muy variables,
marrones, rojizos o negros, dependiendo del alimento y de las condiciones del proceso. En algún caso, como en las pasas, otras frutas secas, la sidra, el té o el cacao, el pardeamiento enzimático contribuye al desarrollo de los colores característicos de estos productos, aunque como se ha indicado, en otros muchos constituye un problema grave. Además de la alteración
del color, los productos formados pueden reaccionar con las proteínas, insolubilizándolas. Por otra parte, puede producirse también una pérdida nutricional, ya que aunque la polifenoloxidasa no oxida directamente al ácido ascórbico, esta vitamina puede destruirse al reaccionar con intermedios de la reacción. El control natural de la actividad de la polifenoloxidasa se produce fundamentalmente mediante la compartimentalización de los sustratos. El enzima se encuentra en los plástidos y cloroplastos (en los vegetales superiores), y también en el citoplasma celular, mientras que los compuestos fenólicos que pueden servir de sustratos se acumulan en vesículas. Cuando se rompe la compartimentalización por un daño mecánico, como el triturado, corte o congelación y descongelación, la reacción de pardeamiento se puede producir. También se produce la inhibición del enzima por los productos de la reacción. Además de manteniendo la compartimentalización, la reacción de pardeamiento se puede frenar actuando sobre diferentes factores:
Evitando el contacto del oxígeno con la superficie de corte
Bajando al temperatura
Reduciendo el pH
Desnaturalizando el enzima
DATOS Y RESULTADOS
Absorbancia
Mililitros de extracto enzimático
Tiempo (seg)
1,0
1,5
2,0
2,5
0
0,164
0,088
0,49
0,37
20
0,178
0,199
0,542
0,444
40
0,182
0,259
0,537
0,439
60
0,186
0,293
0,528
0,436
80
0,193
0,304
0,518
0,437
100
0,179
0,305
0,509
0,429
0,294
0,498
0,423
120
0,170
150
0,161
0,284
0,491
0,421
180
0,144
0,272
0,482
0,412
Actividad enzimatica - Diferentes concentraciones de enzima 0.6 0.5 Actividad enzimatica normal
0.4
a i c n a b 0.3 r o s b A
1.5 ml
0.2 2.0 ml 0.1 2.5 ml 0 0
50
100
Tiempo (seg)
150
200
PH Absorbancia Tiempo (seg)
3,0
6,0
10,0
0
0,326
0,106
0,626
20
0,347
0,156
0,703
40
0,371
0,217
0,755
60
0,394
0,239
0,768
80
0,404
0,249
0,831
100
0,413
0,269
0,853
120
0,420
0,311
0,868
140
0,427
0,354
0,878
160
0,434
0,371
0,883
180
0,326
0,106
0,626
Actividad enzimatica - Diferentes pH 1 0.9 0.8 a i c n a b r o s b A
0.7 0.6
pH 3.0
0.5
pH 6.0
0.4
Actividad enzimatica normal
0.3
pH 10.0
0.2 0.1 0 0
50
100
Tiempo (Seg)
150
200
Absorbancia
Temperatura
Tiempo (seg)
2°C
37°C
60°C
0
0,323
0,059
0,626
20
0,474
0,146
0,703
40
0,558
0,188
0,755
60
0,610
0,207
0,768
80
0,623
0,213
0,831
100
0,624
0,211
0,853
120
0,621
0,202
0,868
150
0,620
0,190
0,878
180
0,619
0,164
0,883
Actividad enzimatica - Diferentes temperaturas 1
0.9 0.8
2°C
0.7 a i c 0.6 n a b 0.5 r o s b 0.4 A
Actividad enzimatica normal
0.3
37°C
0.2 0.1
60°C
0 0
50
100
Tiempo (Seg)
150
200
DISCUSION DE RESULTADOS
Al analizar las diferentes graficas resultantes de los datos obtenidos durante la experimentación con la tirosinasa y los diferentes factores que podrían provocar la alteración de su actividad enzimática, se puede apreciar una variación demasiado grande entre la actividad enzimática normal y los demás experimentos tanto en la grafica de la influencia de la temperatura, como en la grafica de la influencia del PH, en el caso de la variación por concentración de enzima no se ve un resultado esperado, que la variación de la actividad enzimática va creciendo a mayor concentración de la enzima, esto no se dio, ya que un grupo realizo la extracción de la enzima con otra papa diferente a la usada por los de mas grupos, por esta razón no se da el comportamiento esperado en la experimentación (gráfica 1 - concentración de enzima 2.5); donde la actividad de la enzima no fue creciendo a mayor concentración de la enzima Para las otras dos graficas esta gran variación podría explicarse debido a que fue realizada por diferentes grupos de trabajo por lo cual a pesar que se utilizaron iguales volúmenes, la concentración del extracto enzimático podría variar al igual que las condiciones a las cual se mantuvo este antes de iniciar las mediciones en el espectrofotómetro y las medidas todas realizadas en diferentes espectrofotómetros, la suma de todas estas diferentes condiciones puede explicar porque varia de forma tan significativa la actividad enzimática normal con las demás condiciones, cuando a pesar que debería haber una modificación no debería ser tan grande. En el caso del pH es también un resultado esperado pues a pesar que la curva para el PH básico está por encima de las demás, la pendiente de la curva que hace referencia a la actividad enzimática es superior para el PH de 6 y la tirosinasa lo cual está dentro del rango de PH optimo para la tirosinasa. Para el caso de la Temperatura se observa un crecimiento y posterior decrecimiento en todas las curvas aunque con mayor evidencia en el comportamiento a baja temperatura, a pesar que en este caso se esperaba un resultado similar por datos reportados de experimentos anteriores no hay claridad en el porqué de estos resultados ya que a una baja temperatura la enzima se debería ver inhibida en su gran mayoría y en las corvas de temperatura ambiente y temperatura fisiológica, es poco común que se observe un decrecimiento en la actividad enzimática aunque como se presento solo en las mediciones hechas con uno de los espectrofotómetros esto puede deberse a una falla instrumental.
Podemos darnos cuenta de que en la grafica que corresponde a los 2ºC no obtuvimos una línea recta sino una curva, lo que hace suponer que en un principio, cuando la muestra se encuentra a bajas temperaturas se produce un incremento de absorbancia, y con el transcurso de la nueva medida de absorbancia, la muestra alcanza nuevamente la temperatura ambiente, por lo tanto hay una disminución de absorbancia, lo que indica un aumento en la actividad enzimática. De acuerdo a esto y a las líneas que en la gráfica corresponden a 37 y 60ºC afirmamos que la mayor actividad se lleva a cabo en la muestra sometida a 60ºC, (a pesar de que esta medida se tomo de la extracción de otra papa diferente a la trabajada por los demás grupos), como era de esperarse.
PREGUNTAS
1. ¿La enzima actúa mejor a pH ácido, básico o neutro? La actividad enzimática a diferentes PH es muy diferente para los diferentes tipos de enzimas, existen enzimas que presentan mayor actividad a PH acido, esto depende de la cantidad de grupos amino que posea , y existen enzimas que operan mejor a PH básico, esto depende de la cantidad de grupos carboxilo que existen en la enzima que es superior a cualquier otro grupo funcional; cada enzima además posee un PH optimo donde presenta su mayor actividad enzimática; para el caso específico de la tirosinasa aunque presenta mayor actividad enzimática en PH acido no es un valor muy bajo (PH aprox. 5.5) pues en PH básicos se disminuye su actividad enzimática pero a un PH demasiado acido también se ve disminuida de forma significativa su actividad enzimática.
2. Explique cómo afecta la concentración de enzima la actividad enzimática La concentración de enzima afecta la actividad enzimática de forma directamente proporcional, ya que entre mayor es la cantidad de enzima, se ve aumentada la cantidad de sustrato que puede reaccionar simultáneamente.
3. La enzima actúa mejor a temperaturas bajas, ambiente o fisiológicas? La actividad enzimática se ve afectada por la temperatura de igual manera para cualquier enzima, aunque la temperatura optima de cada enzima es diferente, siempre presenta un comportamiento similar, por debajo de la temperatura optima va disminuyendo su actividad hasta llegar a la inhibición total de la enzima y cuando se supera la temperatura optima se empieza a presentar un desdoblamiento en la enzima lo cual genera que se desactive de forma permanente.
4. Documéntese sobre el mecanismo catalítico de la tirosinasa y responda lo siguiente: Como pueden los pH ácidos y básicos influenciar sobre la actividad Enzimática? Muchas enzimas presentan su actividad máxima en estrechos intervalos de pH, la exposición a valores de pH por fuera del intervalo, puede conducir a la pérdida irreversible de actividad. Algunos factores importantes a tener en cuenta al momento de escoger la solución amortiguadora para la extracción de la enzima son los siguientes:
El intervalo de pH en donde la enzima tendrá su mayor actividad La fuerza iónica y la temperatura que pueden afectar la solución buffer. La solución no debe afectar la actividad de la enzima ya sea por efectos quelantes o por interferencias en etapas posteriores de purificación. La solución buffer no debe interferir con el método de cuantificación. Tanto un pH ácido ó uno básico afectarían los grupos funcionales de la Tirosinasa (Histidina), y oxidar o reducir el Cobre, que se encuentra en el núcleo de esta enzima, lo cual afectaría su actividad enzimática.
BIBLIOGRAFÍA
Christopher K. Mathews, Kevin G. Ahern, K. E. Van Holde 2002 “Bioquimica”, 3a edición, Madrid. Koolman R. Rohm K. Bioquímica, Texto y atlas. Tercera edición. Editorial medica panamericana. Sadava D. Vida, la ciencia de la biología. Octava edición. Editorial medica panamericana. S. Tuncagil, S.K. Kayahan, G. Bayramoglu, M.Y. Arica, L. Toppare, l-Dopa synthesis using tyrosinase immobilized on magnetic beads. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 58 (2009) 187-193. Solari, A. J. Genética humana: Fundamentos y aplicaciones en medicina. 3era Ed. Buenos Aires: Médica Panamericana 2007. Pág 463.
