VITAE, REVISTA DE LA FACULTAD DE INGENIERIA ISSN 0121-4004 / ISSNe 2145-2660. Volumen 19 número 2, año 2013 Universidad de Sucre, Sincelejo, Colombia.
DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA Y LOS PARAMETROS Km Y Vmax UTILIZANDO EL METODO DE DNS. DETERMINATION OF ENZYME ACTIVITY DEXTROZYME GLUCOAMYLASE AND ALPHA AMYLASE Rodolfo BARRIOS1*, Jheymer BARRIOS2, Víctor MONTES3.
RESUMEN
Antecedentes: la cinética enzimática permite calcular parámetros referentes a la actividad de una enzima y así ver que tan efectiva es en cuanto a la capacidad de producir producto a partir de sustrato, además es conveniente estudiarlas debido a que son eficientes y menos costosas en muchos casos, tienen un alto grado de especificidad y adaptabilidad. Permitiéndonos remplazar hidrolisis química. Objetivo: medir la actividad enzimática de la glucoamilasa en diferentes condiciones de reacción en cuanto a la concentración del sustrato empleado. Metodología: se prepararon 4 biorreactores con una solución de glucosa anhidra más la adición enzimática de glucoamilasa dextrozyme, con concentraciones al 5%, 10%, 15% y 20 % la cual fueron calentadas en una estufa con agitador magnético se tomaron muestras de las soluciones cada 15 minutos hasta llegar a 60 minutos para ser adicionadas 0,5 ml en unos tubos de ensayo completando con 0,5 ml de dns . Se sometieron a calentamiento calentamiento durante 5 minutos y luego choque con frio dentro de 5 minutos. para posteriormente adicionarles 8ml de agua destilada, agitarlas y finalmente medirles la absorbancia en el espectrofotómetro. Resultados: se hizo posible determina las concentraciones de azucares reductores para las soluciones de concentración de glucosa y glucoamilasa a los tiempos de de 0, 15, 30, 30, 45, 60 minutos, con estos valores de absorbancia o de azucares reducidos se pudo hallar los parámetros enzimáticos de las diferentes cineticas enzimáticas además se hiso posible calcular la actividad enzimática con la curva patrón de absorbancia vs concentración. Conclusiones: El conocimiento de Km nos indica la afinidad de la enzima por un determinado sustrato. Vmax expresan la velocidad máxima que fue constante aplicando todas las cinéticas, lo que puede inferir que solo depende de la concentración de enzima. Palabras claves: cinética, velocidad, sustrato, actividad. 1
Estudiantes en formación de ingeniería agroindustrial. Universidad de sucre. Sincelejo, Colombia. autor a quien se le debe dirigir la correspondencia:
[email protected] [email protected]
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2 DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA Y LOS PARAMETROS KM Y VMAX POR EL ME TODO DE DNS
ABSTRACT
Background: The enzyme kinetics allows to calculate parameters relating to the activity of an enzyme and thus see how effective it is in terms of the ability to produce product from substrate, it should be studied further because they are efficient and less costly in many cases , have high degree of specificity and adaptability. Allowing replace chemical hydrolysis. Objective: to measure the enzymatic activity of glucoamylase at different reaction conditions in terms of the concentration of the substrate used. Methodology: 4 bioreactors were prepared with a solution of anhydrous glucose more enzymatic addition of Dextrozyme glucoamylase, with concentrations of 5%, 10%, 15% and 20% which were heated in an oven with magnetic stirrer samples of the solutions were taken every 15 minutes up to 60 minutes to be added in 0.5 ml test tubes with 0.5 ml of completing DNS. Were subjected to heating for 5 minutes and then with cold shock within 5 minutes. to subsequently adicionarles 8ml of distilled water, and finally medirles agitate the absorbance in a spectrophotometer. Results: it was possible to determine the concentrations of reducing sugars for glucose solutions and glucoamylase at times 0, 15, 30, 45, 60 minutes, these values of absorbance or reduced sugars could be found for the enzymatic parameters of different enzyme kinetics was hiso also possible to calculate the enzymatic activity with the standard curve of absorbance vs concentration. Conclusions: Km knowledge indicates the affinity of the enzyme for a specific substrate. Express the maximum speed Vmax was applying all the kinetic constant, which can be inferred that only depends on the enzyme concentration. Keywords: kinetics, velocity, substrate, activity INTRODUCCIÓN sacarosa) porque uno de sus dos carbonos anoméricos no está formando En la naturaleza, los carbohidratos se enlace glucosídico. presentan como monosacáridos ( Berg,Stryer, & Tymoczko, 2008). (azucares simples), oligosacáridos (contienen de dos a diez unidades Las pruebas de Fehling y de Benedict, monosacáridas) y polisacáridos por ejemplo, se basan en la capacidad (glúcidos poliméricos más grandes).Los de los azucares reductores de reducir monosacáridos se clasifican en aldosas los iones cúpricos (Cu 2+) y aportan un si tienen grupo aldehído y cetosas si ensayo sencillo para reconocer tienen un grupo cetona. Todos los azucares que pueden existir como monosacáridos, aldosas o cetosas y la aldehído o cetona libre. Los azucares mayoría de los disacáridos son que reaccionan se llaman azucares azucares reductores (excepto la reductores, que pueden unirse de
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forma inespecífica a otras moléculas; los que no lo hacen, azucares no reductores. (Armstrong & Bennet,1982) El método DNS es una técnica colorimétrica que emplea 3,5ácidodinitrosalicílico para la hidrólisis de polisacáridos presentes en una muestra, seguido de la determinación espectrofotométrica a 540nm de los azúcares reductores. Esta técnica sirve para cuantificar los azucares reductores producidos durante una fermentación o para cuantificar los productos de una reacción enzimática. 1
En efecto con la prueba dns se cuantifican los productos de la actividad enzimática de La glucoamilasa (glucano 1,4-α-glucosidasa) es una enzima fúngica, extracelular, producida comercialmente con Aspergillus niger o Rhizopus sp., que libera unidades de d-glucosa de los extremos no reductores del almidón y de oligosacáridos como las maltodextrinas. Esta habilidad de degradación del almidón a glucosa tiene una gran aplicación industrial en el proceso de producción de jarabes de glucosa, materia prima en panadería, en la industria de bebidas y en infinidad de procesos biotecnológicos de los cuales los más representativos son la producción de fructosa y etanol 2 Se debe considerar que las enzimas son catalizadores muy potentes y eficaces, químicamente
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son proteínas. Como catalizadores, los enzimas actúan en pequeña cantidad y se recuperan indefinidamente. No llevan a cabo reacciones que sean energéticamente desfavorables, no modifican el sentido de los equilibrios químicos, sino que aceleran estas reacciones. En su estructura globular, se entrelazan y se pliegan una o más cadenas polipeptídicas, que aportan un pequeño grupo de aminoácidos para formar el sitio activo, o lugar donde se adhiere el sustrato, y donde se realiza la reacción. Una enzima y un sustrato no llegan a adherirse si sus formas no encajan con exactitud.3 Cuando medimos la actividad de una enzima variando las concentraciones de sustrato, generalmente se da comportamiento especial regido por la cinética de Michaelis - Menten, la cual afirma que en bajas concentraciones, la velocidad de la reacción que tiene este tipo de muestras es directamente proporcional a la concentración del mismo, siendo la reacción de primer orden. El objetivo primordial es Medir la actividad enzimática de una glucoamilasa fúngica, Alfa amilasa (A. niger) y los parámetros de MichaelisMenten (Vmax y Km) en diferentes condiciones de reacción (Concentración de sustrato, Velocidad de agitación y temperatura).
4 DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA Y LOS PARAMETROS KM Y VMAX POR EL ME TODO DE DNS
MARCO TEÓRICO La cinética enzimática estudia la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas. Estos estudios proporcionan información directa acerca del mecanismo de la reacción catalítica y de la especificad del enzima. La velocidad de una reacción catalizada por un enzima puede medirse con relativa facilidad, ya que en muchos casos no es necesario purificar o aislar el enzima. La medida se realiza siempre en las condiciones óptimas de pH, temperatura, presencia de cofactores, etc., y se utilizan concentraciones saturantes de sustrato. En estas condiciones, la velocidad de reacción observada es la velocidad máxima (Vmax). La velocidad puede determinarse bien midiendo la aparición de los productos o la desaparición de los reactivos. 4 Al seguir la velocidad de aparición de producto (o de desaparición del sustrato) en función del tiempo se obtiene la llamada curva de avance de la reacción, o simplemente, la cinética de la reacción. A medida que la reacción transcurre, la velocidad de acumulación del producto va disminuyendo porque se va consumiendo el sustrato de la reacción (Figura de la derecha). Para evitar esta complicación se procede a medir la velocidad inicial de la reacción (v0). La velocidad inicial de la reacción es igual a la pendiente de la curva de avance a tiempo cero (Figura de la derecha). De esta forma, la medida de v0 se realiza
antes de que se consuma el 10% del total del sustrato, de forma que pueda considerarse la [S] como esencialmente constante a lo largo del experimento. Además, en estas condiciones no es necesario considerar la reacción inversa, ya que la cantidad de producto formada es tan pequeña que la reacción inversa apenas ocurre. De esta forma se simplifican enormemente las ecuaciones de velocidad. 5 Se define la unidad de actividad enzimática (U) como la cantidad de enzima que cataliza la conversión de 1 µmol de sustrato en un minuto. La actividad específica es el número de unidades de enzima por miligramo de proteína (U/mg prot) o por mililitro de disolución (U/ml). Cuando se conoce el peso molecular del enzima puro y el número de centros activos por molécula de enzima, las medidas de actividad enzimática permiten calcular el número de recambio del enzima, o sea, el número de reacciones elementales que realiza el enzima por cada centro activo y por unidad de tiempo. Los estudios sistemáticos del efecto de la concentración inical del sustrato sobre la actividad enzimática comenzaron a realizarse a finales del siglo XIX. Ya en 1882 se introdujo el concepto del complejo enzima-sustrato como intermediario del proceso de catálisis enzimática. En 1913, Leonor Michaelis y Maud
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Menten desarrollaron esta teoría y v1 = v2 + v3 propusieron una ecuación de velocidad que explica el comportamiento cinético Además, como [ES] es constante, la velocidad de formación de los de los enzimas. [6] productos es constante: Para explicar la relación observada entre la velocidad inicial (V o) y la v = v3 = k3 [ES] = constante. concentración inicial de sustrato ([S] o) Michaelis y Menten propusieron que las Como v1=v2+v3, podemos decir que: reacciones catalizadas k1 [S] [ET] - k1 [S] [ES] = k 2 [ES] + enzimáticamente ocurren en dos k3 [ES] etapas: En la primera etapa se forma el complejo enzima-sustrato y en la segunda, el complejo enzima-sustrato Despejando [ES], queda que: da lugar a la formación del producto, liberando el enzima libre:
Siendo: Se puede distinguir entre enzima libre (E) y enzima unido al sustrato (ES), de forma que la concentración total de enzima, [ET], (que es constante a lo largo de la reacción) es: [ET] = [E] + [ES] Como [E] = [ET] - [ES] Resulta que: V1= k1 [S] [ET] – k1 [S] [ES] Este modelo cinético adopta la hipótesis del estado estacionario, según la cual la concentración del complejo enzima-sustrato es pequeña y constante a lo largo de la reacción (Figura de la derecha). Por tanto, la velocidad de formación del complejo enzima-sustrato (v1) es igual a la de su disociación (v2+ v3):
, En donde la expresión (k2+k3)/k1 se ha sustituido por Km, o constante de Michaelis-Menten. Este enlace nos aporta una explicación sobre las razones que hacen de la KM un parámetro cinético importante. [8] Por lo tanto, en el estado estacionario, la velocidad de formación del producto es: v = v3 = k3 [ES] =
Para cualquier reacción enzimática, [ET], k3 y KM son constantes.
6 DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA Y LOS PARAMETROS KM Y VMAX POR EL ME TODO DE DNS
A concentraciones de sustrato elevadas ([S] >> KM), v = k3 [ET]. La velocidad de reacción es independiente de la concentración del sustrato, y por tanto, la reacción es un proceso cinético de orden cero. Además, tanto k3 como [ET] son constantes, y nos permite definir un nuevo parámetro, la velocidad máxima de la reacción (Vmax): Vmax = k3 [ET], que es la velocidad que se alcanzaría cuando todo el enzima disponible se encuentra unido al sustrato. [7]
Reactivo DNS
Procedimiento.
Si introducimos el parámetro Vmax en la ecuación general de la velocidad, (la fórmula recuadrada anteriormente), obtenemos la expresión más conocida de la ecuación de Michaelis-Menten:
METODOLOGIA Materiales:
Biorreactor de (Erlenmeyer) Agitador magnético pHmetro Balanza analítica Balones aforados Estufa Pipetas Termómetros
500
mL
se prepararon 5 concentraciones de glucosa al 5%, 10%, 15%, 20%. Para un volumen de 250ml para las dos primeras muestras se pesaron 12,5 g y 25 g. para las dos últimas muestras un volumen de 200 ml se pesaron 30g y 40g. se preparó una disolución en un beaker respectivamente para cada concentración la cual se mantuvo a una determinada temperatura y agitación exclusiva para cada concentración. [] T (°C) glucosa 5% 45 10% 65 15% 30 20% 50 luego se le adiciono a cada biorreactor 1 ml de la solución de enzima glucoamilasa dextrosyme en el tiempo 0 se adicionaron 10ml de la solución del biorreactor en 1 tubos de ensayo para determinar el analito. Esto se hizo para cada concentración de glucosa.
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Se midió el tiempo cada 15 minutos hasta lograr 60 minutos. Cada periodo de 15 minutos, se tomaron 10 ml de solución del biorreactor, se adicionaba la muestra a un tubo de ensayo. Esto se hizo para cada biorreactor 5%, 10%, 15%, 20%. Luego de adicionar la muestra a los respectivos 4 tubo de ensayo cada 15 30 45 y 60 min , de estos se extraían 0,5 ml de solución que luego se adicionaban a un tubo de ensayo, posteriormente al mismo tubo de ensayo se le adiciona 0,5 ml de DNS. Esto se realizo para los 4 tiempos. Y generalmente este procedimiento se hizo para los 4 birreactores. Se lleva la muestra solución – dns a choque térmico, primero se introduce en un beaker con agua a 89°C por 5 minutos, luego se lleva a frio 10°C por 5 minutos.luego se le adiciono 9ml de agua destilada Posteriormente se procede a medir la absorbancia con el espectrofotómetro para cada tiempo de 15,30,45,60 °C y para cada biorreactor a su determinada concentración.
RESULTADOS Las lecturas de las absorbancias de las soluciones de glucoamilasa en el tiempo 0, 15, 45 y 60 minutos y su promedio se muestran a continuación para las concentraciones de sustrato de 5% ,10%, 15%, 20% en las siguientes tablas:
Concentración de 5% prom t (min) T (°C) Absorbancia 0 45 0,037 15 45 0,147 30 45 0,379 45 45 0,586 60 45 0,496 Tabla 1. Absorbancia para la concentración 5%
Concentración de 10% t (min) T (°C) Absorbancia 0 61,3 0,167 15 62,6 0,198 30 62,5 0,633 45 63,4 0,717 60 63,5 0,688 Tabla 2. Absorbancia para la concentración 10%
8 DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA Y LOS PARAMETROS KM Y VMAX POR EL ME TODO DE DNS
concentracion al 10 % Concentración de 15% t (min) T (°C) Absorbancia 0 27,5 0,103 15 27,5 0,342 30 27,4 0,493 45 27,5 0,719 60 26,9 0,729 Tabla 2. Absorbancia para la concentración 15% Concentración de 20% t (min)
T (°C)
0.9 0.8 0.7 a i c0.6 n a0.5 b r o0.4 s b0.3 a 0.2 0.1 0
y = 0.0104x + 0.1684 R² = 0.8113 Series1 Linear (Series1)
0
Figura 2.
Absorbancia
0.8
0
51,8
0,144
0.7
15
49,1
0,403
30
49,7
0,667
45
50,5
0,756
60
49,8
0,706
a0.6 i c n a0.5 b r o0.4 s b a0.3
Series1 Linear (Series1)
0.2 0.1 0
Para graficar Producto vs tiempo utilizamos las tablas de concentración cruzando absorbancia vs tiempo
concentracion al 5% y = 0.009x + 0.0576 R² = 0.8572
0.6 0.5 a i c n 0.4 a b r o 0.3 s b a
Series1 Linear (Series1)
0.2 0.1
Figura 1.
50 tiempo t
100
P vs t concentración 5%
50
100
Tiempo t
Figura 3. P vs t concentración 15%
concentracion al 20% 0.9 0.8 0.7 a i 0.6 c n a 0.5 b r 0.4 o s b 0.3 a 0.2 0.1 0
y = 0.0098x + 0.2398 R² = 0.8207 Series1 Linear (Series1)
0
0 0
P vs t concentración 10%
y = 0.0109x + 0.1514 R² = 0.9463
0
0.7
100
concentracion al 15%
0.9
Tabla 4. Absorbancia para la concentración 20%
50 t tiempo
50 tiempo t
100
Figura 4. P vs t concentración 20%
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Con la pendiente de estas graficas obtenemos la velocidad promedio de crecimiento estas pendientes las cruzamos en un plano con las concentraciones de sustrato en g/l
REPRESENTACION MICHELES MENTEN concentración glucosa (g/l)
velocidad 50
0,009
100
0,0104
150
0,0109
200 0,0098 Tabla 5. Concentraciones glucosa y velocidad de crecimiento velocidad vs concentracion sustrato y = 6E-06x + 0.0093 R² = 0.2095 0.012 0.01 Series1
0.008
Linear (Series1)
V0.006
0.004 0.002 0 0
100
200
300
S
Figura 5. Grafica V vs S
Determinación Km y Vmax Vmax es el punto máximo de concentración por lo tanto tiene un valor Vmax= 0,0109 g/l.min Por lo tanto Km= Vmax/2 = 0,00545 Entonces km= 20 1
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10 DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA Y LOS PARAMETROS KM Y VMAX POR EL ME TODO DE DNS
METODO LINEAWEAVER – BURK S
V
50 100 150 200 Tabla 6. Concentraciones glucosa y velocidad de crecimiento
0,009 0,0104 0,0109 0,0098
La ecuación linealizada es
1/S
1/V
0,02
111,111111
0,01
96,1538462
0,00666667
91,7431193
0,005
102,040816
Tabla 7. 1/S vs 1/V Graficamos la correspondiente tabla y nos queda: 120 y = 945.18x + 90.417 R² = 0.5752
100 80
Series1
60
Linear (Series1)
40 20 0 0
0.005
0.01
Figuara 5. Grafica 1/S vs 1/V Donde 1/ Vmax
90,417
km/Vmax
945,18
0.015
0.02
0.025
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VITAE
Para determinar Vmax Vmax= 1/90,417 = 0,01105987
10, 4535651
REPRESENTACIÓN EADIE FOSTER S
V 50
0,009
100
0,0104
150
0,0109
200
0,0098
La ecuación que representa esa cinetica es
Se hallan los valores de la relación V/S y graficamos en función de V V
V/S 0,009
0,00018
0,0104
0,000104
0,0109
7,2667E-05
0,0098
0,000049
Tabla 8. V vs V/S
V/S vs V
0.0002
y = -0.0463x + 0.0006 R² = 0.4411
0.00015 Series1
S / 0.0001 V
Linear (Series1)
0.00005 0 0
0.002
Figura 9. Grafica V/S vs V
0.004
0.006
0.008
0.01
0.012
V
12 DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA Y LOS PARAMETROS KM Y VMAX POR EL ME TODO DE DNS
Vmax/Km -1/Km
0,0006 -0,0463
Hallamos Vmax y Km
) ( CINÉTICA ENZIMÁTICA LUGMUIR S
V
50 0,009 100 0,0104 150 0,0109 200 0,0098 La ecuación que representa esa cinética es
Se hallan los valores de la relación V/S y graficamos en función de V S
S/V 50 5555,55556 100 9615,38462 150 13761,4679 200 20408,1633
Tabla 9. S vs S/V 25000
S/V vs V
20000
y = 97.408x + 159.17 R² = 0.9837
15000
V / S
Series1
10000
Linear (Series1)
5000 0 0
50
100 V 150
Figura 10. Grafica S/V vs V
200
250
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R.Barrios J
VITAE
1/Vmax Km/Vmax
97,408 159,17
Hallamos Vmax Hallamos Km
CURVA ESTANDAR ppm
muestra 1
muestra 2
muestra 3
0
0,06
0,001
0,006
0,02233333
200
0,101
0,095
0,096
0,09733333
400
0,262
0,237
0,243
0,24733333
600
0,391
0,359
0,426
0,392
800
0,534
0,561
0,526
0,54033333
1000
0,779
0,783
0,811
0,791
Tabla 10. Concentración y absorbancia estándar. absorbancia promedio
ppm 0
0,02233333
200
0,09733333
400
0,24733333
600
0,392
800
0,54033333
1000
0,791
Tabla 11. Concentracion vs absorbancia promedio 1 0.8
curva estandar y = 0.0008x - 0.0314 R² = 0.975
a i c 0.6 n a b 0.4 r o s b 0.2 a
Series1 Linear (Series1)
0 -0.2 0
absorbancia promedio
500 1000 concentracion
Figura 11. Curva estándar abs vs ppm
1500
14 DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA Y LOS PARAMETROS KM Y VMAX POR EL ME TODO DE DNS
CALCULO DE ENZIMATICA
LA
ACTIVIDAD
Donde: m = es la pendiente de la recta (∆abs/∆t) en unidades de abs/min
e = es el coeficiente de extinción molecular para el NADH. 6,22 x 103M-1 cm-1 b = es la distancia de la celda, que corresponde a 1 cm
ANALISIS DE RESULTADOS El reactivo DNS (acido 3.5dinitrosalicílico), se emplea para cuantificar los azucares reductores producidos durante una fermentación y para cuantificar los productos de una reacción enzimática. La influencia del sometimiento a calor de las soluciones con el reactivo DNS en los tubos de ensayo, provoca el aumento de la solubilidad de dicho reactivo, esto debido a que el calor acelera la velocidad en que ocurre la reacción, incrementándose la interacción de las moléculas cuando estas vibran. El método DNS (Acido 3,5 dinitrosalicilico) nos ayuda a
determinar la presencia de grupos carbonilos libres (C=O) en los también llamados azucares reductores. Esto involucra la oxidación del aldehído presente en el grupo funcional. Simultáneamente, en presencia de calor del DNS se reduce a acido 3-amino, 5-nitrosalicilico bajo las condiciones alcalinas, desarrollándose una color amarrillo café. Cuando se grafica el producto o absorbancia obtenida respecto al tiempo estamos refiriéndonos a la formación de producto por parte de la enzima lo que intrínsecamente es una velocidad de producción. Estas velocidades describen la pendientes de esas graficas P vs t y son velocidades específicas de producción. La caída de la velocidad de reacción en las gráficas de P vs t se debe a la disminución significativa de la concentración de sustrato, aunque también pueden influir otros factores como el aumento de la concentración de producto, cambios de pH, inactivación del enzima. Igualmente se observa que a mayor tiempo de reacción la absorbancia aumenta en las muestras tomadas dándonos referencia a que la actividad enzimática o la velocidad de producción son mayores. Puede ser debido a las condiciones del reactor y a las concentraciones de sustrato.
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R.Barrios J
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Esa velocidad específica se ve influenciada por la concentración de sustrato la temperatura y la agitación que se emplee, si vemos la tabla 5 la concentracion de sustrato va a estar relacionada directamente con la velocidad siendo a mayor la concentración de sustrato mayor velocidad inicial de producción cabe destacar que la temperatura a esas concentraciones de sustrato logro que la enzima obtuviera sus condiciones deseadas para la reducción de los azucares, por lo tanto a mayores temperaturas y mayores concentraciones de sustrato la velocidad fue mayor.
CONCLUSIONES El conocimiento de Km nos indica la afinidad de la enzima por un determinado sustrato. La determinación de este parámetro se vio afectado debido a errores experimentales en el laboratorio como una medición errónea o una no adecuada disolución, inhibición de la emzima etc. La Vmax la velocidad máxima fue constante aplicando todas las cinéticas, lo que puede inferir que solo depende de la concentración de enzima yno de la concentración de sustrato, Además la actividad enzimática explica cuanta glucosa puede reducir en una determinada muestra. Se logro determinar el km y Vmax por los modelos linealizados.
La figura 5 expresa la relación entre la velocidad y la concentración de sustrato pero cabe destacar que los errores experimentales en los ensayos fueron significantes, esto no permitio que la grafica V vs S nos arrojara la grafica ideal por lo cual se obtuvieron km muy variados para cada experimento. Pero se mantuvo un valor constante de Vmax esto infiere en que la velocidad máxima no va a depender de la concentración de sustrato solo de la concentración de la enzima, lo contrario que pasa con el Km que depende de las dos variables antes explicadas.
BIBLIOGRAFÍA [1] DETERMINACIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES POR LATÉCNICA DE MILLER (DNS). Bibián L. M. E., Rojas R. M. A. [2] Luz A. BETTÍN S.1; Juan C. QUINTERO D.1* Grupo de Bioprocesos, Departamento de Ingeniería Química. Universidad de Antioquia. A.A. 1226. Medellín, ColombiaESTUDIO DE LA PRODUCCIÓN DE JARABES GLUCOSADOS A PARTIR DE MALTODEXTRINAS EMPLEANDO DOS ENZIMAS COMERCIALES [3] Juan Manuel González Mañas. CURSO DE BIOMOLÉCULAS. [Internet]. Disponible en:
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(Zaragoza, España), pp 42-45. [4] Nelson DL, Cox MM (2001): “Principios de Bioquímica”, 3ª ed.
Editorial Omega (Barcelona, España), pp 304-305. [5] Stryer L, Berg JM, Tymoczko JL (2003): “Bioquímica”, 5ª ed. Editorial
Reverté (Barcelona, España), pp 577580. [6] GREENWOOD, et al., "Amylases" en "Enrymes in Food Processing", Editor Reed G., Academic Press. New York, p. 62. 1975. [7] “Official Methods of Analysis of the
Association of Official Analytical Chemists". Editor Sidney Williams, Medición, Arlington, Virginia, 1984, p. 581.
ANEXO 1. Imágenes de la experiencia realizada.
