BIOLOGÍA MOLECULAR COMPETENCIA 1 ORGANIZACIÓN DEL GENOMA
Química de las bases nitrogenadas (nucleótidos) FUNCIONES DEL DNA • Almacenar • Replicar • Expresar • Transmitir • Cambiar Funciones de nucleótidos en metabolismo celular Lehninger pág. 281 1. Garantizan intercambios energéticos 2. Actúan como señales químicas en sistemas celulares en Respuesta a hormonas y estímulos extracelulares 3. Son componentes estructurales de cofactores enzimáticos e intermediarios metabólicos 4. Son constituyentes de los ácidos nucleicos (DNA y RNA) depositarios moleculares de la información genética NUCLEÓTIDO Lehninger pág. 281, Stryer 110 • 3 componentes: 1. Base nitrogenada (contiene nitrógeno) 2. Pentosa (Azúcar) 3. Fosfatos (sin este: nucleósido) NUCLEÓSIDO Base+Azúcar Stryer pág. 111 DNA • • • • RNA • • • •
DESOXIADENOSINA DESOXIGUANOSINA DESOXICITIDINA TIMIDINA ADENOSINA GUANOSINA CITIDINA URIDINA
Karp 394, Lehninger pág. 284 • • • • • •
Nucleótidos Unión covalente Polímero lineal o cadena Azúcar-fosfato-azúcar- fosfato… Enlaces 5’5’-3’ fosfodiéster En base a posición posición del carbono de pentosa pentosa
Karp 394 • Un nucleótido tiene una estructura polarizada polarizada (con (con una dirección) • Extremo 5’ donde se localiza el fosfato – inicio – inicio o izquierda • Y un extremo 3’3’- termino o derecha BASES Y PENTONAS SON COMPUESTOS HETEROCICLICOS
Lehninger pág. 282
• Los átomos de carbono y de nitrógeno de las estructuras estructuras parentales parentales se numeran numeran para facilitar la nomenclatura y la identificación de sus muchos derivados • A los números de los átomos átomos de carbono de las pentosas (azúcares) de los nucleótidos y nucleósidos se les añade el signo prima (’) para distinguirlos de los átomos numerados de las bases nitrogenadas BASES NITROGENADAS Karp 394 PIRIMIDINAS 1 ANILLO • TIMINA - T • CITOCINA – CITOCINA –C C • URACILO- U (RNA) PURINAS 2 ANILLOS • GUANINA – GUANINA –G G • ADENINA -A BASES NITROGENADAS Stryer pág. 11, Lehninger pág. 281 • Base nitrogenada y pentosa unión covalente • N-1 en las pirimidinas • N-9 en las purinas • Enlace N-β N-β-glucosídico • Carbono 1’ de la pentosa y el fosfato está esterificado con el carbono 5’. • El enlace N-β N-β-glucosídico se forma por la eliminación e liminación de agua (un grupo hidroxilo de la pentosa y un hidrógeno de la base).
Covalente N1 o N9 con carbono 1 Pentosas Lehninger pág. 282 • En forma de β furanosa furan osa (anillo pentagonal cerrado) Pentosas: Definen la identidad de los ácidos nucleicos (DNA-RNA) (DNA -RNA) DESOXIRRIBONUCLEÓTIDOS (DNA) • 2’desoxi-D-ribosa 2’desoxi-D-ribosa RIBONUCLEÓTIDOS (RNA) • D-ribosa Pentosas: -H y –OH y –OH en carbón 2’ Lehninger pág. 281 DESOXIRRIBONUCLEÓTIDO (- H) • En los desoxirribonucleótidos un – un –H H reemplaza reemplaza al grupo OH del carbono 2’ RIBONUCLEÓTIDO (-OH) Lehninger pág. 284 • La mayoría de los nucleótidos contienen solamente solamente las purinas y pirimidinas principales. • DNA como el RNA contiene contiene también también otras bases secundarias o minoritarias • En DNA las más comunes son las formas metiladas metiladas de las las bases Principales. • En DNA sirven como señales específicas para la regulación o protección protección de la información genética. Nomenclatura
Salazar 27
DIFERENCIAS RNA Y DNA SALAZAR PAG 32 • MONOCATENARIO • URACILO EN LUGAR TIMINA • RIBOSA OH Provoca mayor inestabilidad RNA Salazar pág. 31 • Ácido nucleico nucleico más más abundante en la célula • 10 veces más abundante que el DNA DNA ESTRUCTURA DEL RNA SALAZAR PAG 32 • PRIMARIA • 5´ →3’ • SECUNDARIA • Pasador o (hairpin) • TERCIARIA
• Por interacción de bases • «L» • Átomos de hidrógeno - Fosfodiéster • OH de ribosa (dador y aceptor aceptor de Hidrógenos) TIPOS DE RNA RNAm SALAZAR 32, Str • Molde para síntesis de proteínas • 5’ cap • 3’ cola poli A RNAr SALAZAR PAG 33, Stryer 124 • Componente principal de ribosoma • Catalizador en síntesis de proteínas • Es el más abundante abundante de los 3 tipos de RNA • Procariotas 3 tipos (por grado de sedimentación): sedimentación): 23S, 16S y 5S RNAt SALAZAR 33, Stryer 124 • Transporta aa aa en forma forma activada al ribosoma para la formación de enlaces polipetídicos • Al un tRNA para cada aminoácido • 75-90 nucleótidos RNAsi (pequeños (pequeños de interferencia) SALAZAR 34, Stryer 124 • Se unen a mRNA y produce produce una degradación enzimática • Experimentalmente inhibe expresión de genes • 20-25 nucleótidos
Rama SALAZAR PAG 34, Stryer 124 • Se unen a RNAm y bloquean bloquean la traducción (No degradan) • 21-23 nucleótidos RNAsn (Pequeños RNA nucleares – nucleares –small small nuclear-) SALAZAR 34, Stryer 124 • Participan en el empalme de los exones del RNA (maduración (maduración del hnRNA) mediante mediante el spliceosome PRINCIPIO DE COMPLEMENTARIEDAD DE LAS BASES EN LAS HEBRAS HEB RAS DE DNA. Estructura primaria del ADN Salazar 27 • Secuencia de polinucleótidos lineal
Estructura secundaria del ADN Salazar 27 y 28 • DOBLE CADENA DE POLIDESOXIRRIBONUCLEÓTIDOS • Surco mayor y menor • Antiparalela • Complementaria • Forma B dextrógira • A in vitro a partir de B • Z Levogira (zonas CG) • Puentes de hidrógeno Chargaff
2 GENOMA PROCARIOTE Y EUCARIOTE. Luque 5 a 8 CONCEPTO DE GENOMA. 1. Contenido único único de información genética – genética –Karp Karp 399 2. Conjunto de pares pares de bases contenidos en el ADN de cada organismo organismo – Salazar – Salazar 305 3. Del griego gen-origen. Conjunto total total de material genético hereditario hereditario presente en la célula, tanto nuclear como extranuclear, ex tranuclear, codificante o no – no – Luque Luque 5 Longitud DNA • Pb pares pares de bases bases en hebra hebra doble • Nt nucleótidos en hebra sencilla • Kilobases kb o kpb= 10³pb • Megabases Mb o Mpb 106 pb CUANTOS TIPOS DE DNA TENEMOS DENTRO DE LA CÉLULA CARACTERÍSTICAS DEL GENOMA NUCLEAR Y MITOCONDRIAL.
• 16.5 kb • Doble hebra
• • • • • • • •
Circular No. Cromosomas por célula: 1, decenas, 200 a 105 Sin proteínas Codifica ~93% Sin DNA repetitivo Sin intrones Genes 37 1 gen cada 0,45 kb
GENOMA MITOCONDRIAL • Mitocondria hubiera surgido al acumularse O2 en la atmósfera al incorporarse por endocitosis células procariotas aeróbicas al interior de la célula • Con el tiempo… la mayoría del DNA protomitocondrial se incorporó al genoma nuclear • Las mitocondrias varían en número dependiendo del tejido. Thompson • La cantidad de DNA mitocondrial va de 200 a 100 000 copias • La mayoría es codificante y no repetitivo
Transposones 37 GENES RNA MITOCONDRIAL • 2 rRNA • 22 tRNA • 13 proteínas de complejos enzimáticos respiratorios I, III, IV y V (5% de las proteínas mitocondriales resto lo codifica DNA nuclear Datos • 1 célula de DNA Longitud de 2 metros
• • • • •
Todas las células 4 billones de metros Variación pb entre especie No hay correlación en tamaño del genoma con número de cromosoma Sin correlación entre cantidad de material genético y complejidad del organismo Gran tamaño de organismos superiores no codifica
DIFERENCIAS ENTRE EL GENOMA PROCARIOTE Y EUCARIOTE. Procariotas o procariontes • EUBACTERIAS Y ARQUEOBACTERIAS • TAMAÑO PEQUEÑO (0.2 A 5 MICRAS DE DIÁMETRO) • MEMBRANA PLASMÁTICA Y PARED RÍGIDA • ESTRUCTURAS SUPERFICIALES (PILI, FLAGELOS, ETC) • NO: Membrana celular, membrana de organeros GENOMA: 1 CROMOSOMA CIRCULAR EN REGIÓN NUCLEAR O NUCLEOIDE EN SUSPENCIÓN • PLÁSMIDOS • Material genético extra no esencial • Circular • Propiedad de replicación autónoma (sin coordinación con división celular • DNA recombinante • Vectores • Eucariotas más grandes • Cromosomas de organelos más grandes que plásmidos Eucariotas O Eucariontes • PLURICELULARES O MULTICELULARES (Protozoos, hongos y algas) • 10-50 micras Contienen: • Membrana plasmática • Pared celular - plantas • Citoesqueleto • Gran compartimentación: organelos • Núcleo con doble membrana GENOMA • Nuclear • Cromatina en interfase o en cromosomas • DNA asociado a proteínas • Organelos (Cloroplastos y mitocondrias) • Cromosomas circulares 3. COMPONENTES DEL GENOMA EUCARIOTE. Karp 400-411
• • • • • • •
secuencias codificantes (3%) Secuencias repetidas Transposones (40-50%) Intrones Elementos reguladores Seudogenes Secuencias intergénicas
SECUENCIAS REPETIDAS Renaturalización del DNA Renaturalización a diferente velocidad Corresponde al número de repetidos FRACCIÓN Muy repetida Moderadamente repetida No repetida SECUENCIAS DE DNA MUY REPETIDAS • 1-10% del DNA total • Cortas (las más grandes cientos) • Grupos en tándem-Se repiten sin interrupción • Categorías • DNA satélite • DNA minisatélite • DNA microsatélite DNA SATÉLITE 5 – cientos de pb Entre ellos a su vez forman grupos de millones de pb Se separan como bandas satélites por centrifugación por gradiente de densidad Evolutivamente aparecen rápido por lo que aún entre especies emparentadas varían Se localiza en centrómeros DNA MINISATÉLITE • 10-100 pb • Grupos de hasta 3000 repeticiones • Inestables ↑↓ en cada generación →Entrecruzamiento desigual • Longitud por tanto muy variable entre individuos (polimórficos) • Identificación mediante perfiles de DNA Minisatélites/ microsatélites • Las secuencias que se unen a las sondas marcadas varían en longitud de una persona a otra debido a la presencia de números variables de repeticiones en tándem cortas (STR) en el genoma
• Los laboratorios utilizan aprox 13 de los más polimórficos DNA MICROSATÉLITE • 1-9 pb • Segmentos repetidos 10-40pb • Las enzimas de replicación de DNA tienen problemas para copiar estas secuencias →Cambian de generación en generación (Estudios poblacionales) SECUENCIAS MODERADAMENTE REPETIDAS • Va de 20 a 80% según el organismo • De pocas a decenas de miles de veces • Secuencias codificadoras y no codificadoras • Son Secuencias de DNA repetidas con funciones codificadoras • DNA repetidos sin funciones codificadoras Secuencias de DNA repetidas con funciones codificadoras • Contiene genes que codifican: • RNA ribosómicos • Histonas DNA repetidos sin funciones codificadoras; 2 Clases: • SINE (Short interspersed elements- elementos cortos intercalados) • LINE (Long interspersed elements- elementos largos intercalados) SECUENCIAS DE DNA NO REPETIDAS O COPIAS ÚNICAS • Tardan más en renaturalizar • Genes (la mayor cantidad de genes) con patrón de herencia mendeliano y Locus específico • Codificación de histonas, familias de genes relacionados (globinas, actinas, miosinas, colágenos, tubulinas, integrinas, etc.) Transposones (40-50%) 45% • Elementos bacterianos transferibles • Codifican transposasa.-escisión-inserción • Por lo general se crea duplicación flanqueante «huellas» Transposones-45% • 45% de la célula nuclear humana más del 99% ya no se mueve • Por mutaciones • RNA pequeños • Metilación • Enfs producidas si se insertan en genes • 1 de cada 500 mutaciones • Hemofilia, Ca
Transposones en eucariotas Trasnposones de DNA: Se escinden de sitio donador y se insertan distante Retrotransposones ◦ «copiado e inserción» ◦ RNA ◦ Transcriptasa inversa Las secuencias moderadamente repetidas están diseminadas y se generan por transposición 2 familias más comunes en el humano (son transponibles): • L1-LINE • Retrotranscripción • 500 000 copias la mayor parte inmóviles incompletos • Evolución humana • Alu –SINE • Más abundante que L1 • RNA citoplasmático se retrotranscribió primero en primates • Tasa actual de transposición es de 1 por 200 nacimientos • Diversidad genética de la población humana Transposones • Pueden llevar con ellos parte del genoma hospedador • Segmentos que ahora son reguladores antes fueron transposones • Parecen haber dado lugar a genes Ej. Telomerasa, anticuerpos (Mecanismo de defensa) • Células cerebrales por retrotransposición L1 Intrones Karp G-13, Salazar 45 • Las partes de un gen dividido que corresponden a las secuencias intercaladas • Regiones que no serán traducidas ELEMENTOS REGULADORES • • • •
• SALAZAR 44-47
Inicio de transcripción +1… y aumenta hacia 3’ Corriente abajo Hacia 5’ Corriente arriba se indica -1…
ELEMENTOS REGULADORES Transcripción Luque 264 • REGULACION GENÉTICA • Promotor • Factores de Transcripción • REGULACIÓN EPIGENÉTICA • Gru
Promotor basal: • Secuencia mínima requerida para la unión de la maquinaria basal de transcripción y para la ARN Pol II (ARN polimerasa II) • Incluye: Inr (iniciador), caja TATA (8 pares de bases AT a-31 o -25pb a 5’ del punto de inicio), DPE (Downstream promoter element) elemento común en los promotores TATA menos (sin) a +28 o +32
FACTORES DE TRANSCRIPCION • Aumentan o disminuyen la tasa de transcripción • Cis • Trans POTENCIADORES (ENHANCERS) • Secuencias que potencian o aumentan la transcripción del gen • De manera cooperativa con otras secuencias reguladoras y alteran la estructura del ADN induciendo superenrollamientos en el promotor y aumentan la unión de TF con aumento en aproximación física entre ambos SILENCIADORES • Secuencias cortas: • Modifican estructura • Evitando que FT inductoras se una a ADN • Evitando maduración del RNAhn • Creando señales que bloquean traducción e inactivando expresión génica • 1) Elemento silenciadores • 2) Elementos de regulación negativa (NRE) SECUENCIAS AISLADORAS • Bloquean la transmisión de la señal para un sitio a otro en el ADN e impiden el silenciamiento SEUDOGENES • KARP 408 • Secuencias funcionales a genes pero que han acumulado mutaciones significativas que los han tornado no funcionales • Procesados • No procesados SECUENCIAS INTERGÉNICAS O EXTRAGÉNICAS COMPACTACIÓN DEL GENOMA CÉLULAS EUCARIONTES. Karp 494-499, 505- 509 Salazar 30-31 Identifica los diferentes niveles de compactación del DNA: nucleosoma, solenoide, cromosoma en metafase. • 2 metros de DNA por célula • El núcleo mide 10 micras • Se asocia con nucleoproteínas (histonas y no histonas)
→ Cromatina→Cromosomas • • • •
NUCLEOSOMA SOLENOIDE ASAS CROMATÍNICAS CROMOSOMA CONDENSADO
NUCLEOSOMA • HISTONAS • Proteínas carga + a pH fisiológico por alto contenido de aminoácidos básicos (arginina y lisina) • →ADN (carga negativa por grupos fosfato) • Núcleo de nucleosoma (octámero): H2A x2, H2B x2, H3 x2, H4 x2 • H1 • Histonas evolutivamente conservadas • Segmento de DNA de doble cadena de 146 pb (casi 200 karp) dan 1.6 vueltas al octámero = nucleosoma • La cadena de nucleosomas se conoce como «cuentas de rosario o cuentas de collar» (sin H1) • Entre cada nucleosoma existe un linker (DNA de enlace 55pb) NIVEL MÍNIMO DE ORGANIZACIÓN DEL GENOMA • Tasa de empaquetamiento ~7:1 • Las 8 histonas de la partícula central se organizan en 8 heterodímeros • 2 dímeros H2A-H2B • 2 dímeros H3-H4 FUNCIÓN DEL NUCLEOSOMA • Condensar al ADN en una fibra de 11nm de ancho MODIFICACIONES EPIGENÉTICAS: Extremo aminoterminal de las histonas puede unirse de manera reversible a grupos: • Acetilo • Metilo • Fosfato Variantes de H2A y H3 • Posibles funciones aun no bien conocidas • CENP-A es variante H3 centromérica que sirve de ensamblaje del cinetocoro • H2A.X – Se fosforila en sitios de ruptura del ADN y podría participar en reclutamiento de enzimas reparadoras • H2A.Z y H3.3 - No bien determinado, activación de transcripción • H1 interactúa con 168pb • ADN linker se asocia con H1 (partícula conectora) ayudando al empaquetamiento --solenoide
SOLENOIDE • Los nucleosomas se compactan para formar un polinucleosoma de 6 unidades mediante la interacción entre H1 de cada nucleosoma→SOLENOIDE • 30 nm • DNA compactado 100 veces • Se conoce como Cromatina • Eucromatina • Descompactada- transcripcionalmente activa • Heterocromatina • Inactiva-compactada ASAS CROMATÍNICAS • Fibra de 30nm se pliega y condensa formando asas amplias superenrolladas • Se anclan sobre proteínas de andamiaje → hebra de 300nm de grosor CROMOSOMA CONDENSADO • Asas se compactan →Cromosona condensado de 700nm de espesor visible en interfase CROMOSOMAS MITÓTICOS • Cromátides hermanas • ULTIMA ETAPA DE ORGANIZACIÓN DEL ADN • 1 400 nm de grosor PARTES DEL CROMOSOMA: CENTRÓMERO, TELÓMERO, CROMÁTIDA. Karp 501-509 CENTRÓMERO • Área de constricción • Secuencia repetida en tándem • 171pb a 500 kb • DNA satélite α • Contiene CENP-A (variante de H3) que ensambla cinetocoro ----microtúbulos • Presenta diferencias marcadas en secuencia de nucleótidos aun en especies relacionadas TELÓMERO • Forma una cubierta en cada extremo de cromosoma • Repetido de 500 a 5000 veces • TTAGGG • AATCCC • Casi no varía entre especies ---Función conservada en diversos organismos • En su replicación se requieren cebadores los cuales posteriormente son eliminados haciendo con ello que se acorten en cada ciclo TELOMERASA: • Transcriptasa inversa (sintetiza DNA a partir de RNA que le sirve como plantilla) • Agrega nucleótidos en 3’ • Contiene RNA • Al perderse se acortan los telómeros---senescencia replicativa
TELOMERAS • Ausente en casi todas las células • Presente en: células germinales, Células madre (piel, intestino, hematopoyéticas) • No se ha dilucidado si una persona con telómeros largos es más susceptible de padecer Ca pero se encuentra en estudio neoplasias y telómeros • 90% de los tumores tienen telomerasa activa TELÓMERO IMPORTANCIA • Necesarios en replicación completa de los cromosomas • Protegen del ataque de nucleasas • Impiden que los extremos se fusionen en Otras funciones en estudio CROMÁTIDA (qué es la eucromatina y heterocromatina Karp 498-499) HETEROCROMATINA • Compacta durante la interfase • Se tiñe densa • Constitutiva • Facultativa EUCROMATINA * Dispersa Heterocromatina Constitutiva • Compacta • No se transcribe • Pocos genes con efecto de posición (tienden a inactivarse aun cuando se mueven) • Telómeros, centrómeros y parte distal de Y • Secuencias repetidas • Su diseminación queda bloqueada por secuencias especializadas (efecto frontera) • Inhibe la recombinación entre secuencias repetitivas homólogas (↓duplicaciones y deleciones) Heterocromatina Facultativa • Inactivación en ciertas fases de la vida • Corpúsculo de Barr • Hipótesis Lyon • Heterocromatizacion X – embrión • Aleatorio • Reactivación antes de meiosis Inactivación X • Gen XIST • RNA XIST (IncRNA ---no codificador largo) • Se acumula a lo largo del X • Recluta complejos proteínicos • Se mantiene inactivo por histonas y metilación
GENES Gen • Unidad de la herencia –Karp 387 • Unidad fundamental de la información genética- Stryer 19 • Definición molecular (Luque 245): Conjunto de secuencias de DNA estructurales (intrones y exones) y reguladoras, necesarias para codificar un producto génico (RNA o proteína funcional) señalará el número aproximado de genes contenidos en el genoma humano • El número verdadero de genes humanos oscila entre 20 000 y 25 000 (en el libro se utiliza un estimado 23 000) – Stryer 19 • 3% codifica- Stryer 19 • Las estimaciones actuales indican 21 000 genes - Karp 412 ESTRUCTURA DE GENES Salazar 44 PROCARIONTES • Organizados en OPERONES: Conjunto de genes situados en el mismo fragmento de ADN que se transcriben como una unidad y que generan varios productos funcionales que participan en una vía metabólica común • También tienen unidades que codifican 1 solo producto EUCARIONTES • Generalmente 1 solo producto • Secuencias regulatorias y codificantes ...ELEMENTOS REGULADORES Salazar 45-47 Promotor basal • Secuencia mínima requerida para la unión de la maquinaria basal de transcripción y para la ARN Pol II (ARN polimerasa II) • Incluye • Inr (iniciador) • Caja TATA (8 pares de bases AT a-31 o -25pb a 5’ del punto de inicio) • DPE (Downstream promoter element) elemento común en los promotores TATA menos (sin) a +28 o +32 Karp 485 PROMOTOR • Sitio donde la RNA polimerasa se une al DNA antes de iniciar la transcripción Karp 484-485 • BACTERIAS
• Genes que codifican las enzimas de una vía metabólica se agrupan en un cromosoma →complejo funcional →operón • Un operón bacteriano GENES ESTRUCTURALES • Codifican enzimas y se encuentran uno junto a otro • Se transcribe en un solo mRNA (policistrónico) • Posteriormente se traduce en varias enzimas PROMOTOR OPERADOR • Adyacente al promotor o se traslapa • Sitio de unión a proteína represor (regula transcripción) GEN REGULADOR • Codifica a proteína represora Genes adaptativos • Genes constitutivos • codifican enzimas necesarias para el metabolismo básico celular se está expresando continuamente (expresan de forma constitutiva o continua) • Genes adaptativos • Se expresan solamente en determinadas situaciones, codifican para enzimas que solamente se necesitan en momentos concretos COMPETENCIA 2 1. DUPLICACIÓN (SÍNTESIS DE DNA) Salazar 36-42 Karp 546- 564 Crick 1955: «El ADN dirige su propia replicación y su transcripción para formar ARN complementario a su secuencia; el ARN es traducido en aminoácidos para Proteína »
CARACTERÍSTICAS GENERALES DE LA REPLICACIÓN (semiconservadora, bidiereccional y discontinua) • SEMICONSERVADORA • En cada una de las moléculas hijas se conserva una de las cadenas originales • BIDIRECCIONAL • A partir de ORI (sitio de origen, ARS en eucariontes)
• 2 Puntos de crecimiento →HORQUILLA DE REPLICACIÓN Horquilla de replicación karp 549 • Segmentos replicados se unen con segmentos no replicados • Corresponde al sitio donde: • 1 La doble hélice parental se separa • 2 Los nucleótidos se incorporan en las cadenas complementarias resintetizadas • Eucariontes ORI multifocal acortan el tiempo en que se replica todo el ADN • ORI secuencias ricas en AT y controlan la replicación del replicón • Bacterias y virus monofocal • DISCONTINUA • Fragmentos de Okazaki en hebra rezagada o retrasada (Discontinua) • 1000 a 2000 nucleótidos PROTEÍNAS QUE PARTICIPAN EN LA HERLIECPASLAICACIÓN • Rompe puentes hidrógeno • Ocasiona superenrollamientos positivos a los lados de la burbuja de replicación • SSB –procariontes (single stranded DNA binding)- Y RPA - eucariontes- Proteínas de unión a cadena sencilla • Evitan formación de puentes de hidrógeno • Dan estabilidad TOPOISOMERASAS • Cortan o forman enlaces fosfodiéster • 1 hebra-----topoisomerasa I • 2 hebras----topoisomerasa II (girasa kar • Liberan tensión (superenrollamiento) PRIMASA • Enzima sintetiza fragmentos de entre 8 y 10 nucleótidos- de ARN----CEBADOR o PRIMER • Proporciona un extremo 3’ para que ADN polimerasa actúe • Rnasa H1 • Retira CEBADORES de ARN • Fragmentos de Okazaki y en reparación • FEN1/RTH1 (endonucleasa flap 1) • Remueve ribonucleótido 5’ del fragmento de Okazaki • Produce el Nick (falta de enlace fosfodiéster entre 2 nucleótidos adyacentes) LIGASA • Cataliza formación de enlace fosfodiéster • Sella mella 3’P con el 5’ TELOMERASA • Ribonucleoproteína con actividad de ADN polimerasa dirigida por ARN (transcriptasa inversa) • Sintetiza una secuencia determinada de ADN que permite el alargamiento de los telómeros
ANTÍGENO NUCLEAR DE CÉLULAS EN PROLIFERACIÓN (PCNA) • Homotrímero que forma estructura toroide • Abierta transitoriamente por acción del factor de replicación (RFC-factor de Replicación C-) • Permite su recirculación alrededor de la doble hélice a la altura del extremo del primer en cadena líder • Su función es mantener la ADN polimerasa en contacto con cadena molde ADN POLIMERASA • Sintetiza cadenas de ADN • Añade nucleótidos en dirección 5’ →3’ siempre y cuando haya un extremo 3’ disponible • Dirección en la cual se lee la cadena molde es 3’ →5’ REPLISOMA KARP 555 • Complejo completo de proteínas que están activas en la horquilla de replicación 5 DNA
POLIMERASAS EN EUCARIONTES EN REPLICACIÓN
Polimerasas • Alfa ----primasa inicia síntesis de cebador de ARN • Delta y epsilon ---- Elongación • Beta ---- Reparación (no replicación) • Gamma --- Replicación mitocondrial • Exonucleasas 3’--- delta, gamma y epsilon (corrigen errores) • Ninguna polimerasa en eucariontes presenta actividad exonucleasa 5’ • Theta, eta y iota --- función no muy conocida ----reparación, recombinación POLIMERASAS EN PROCARIONTES • INICIO • ELONGACIÓN • TERMINACIÓN INICIO • Zonas de producción de burbujas de replicación ---- secuencias de 300pb ricos en AT • Secuencias AT reconocidas por proteínas de reconocimiento del sitio de origen (SRA) • Burbuja de replicación contiene 2 horquillas (Derecha-Izquierda) • Helicasa y RPA • Primasa ----Cebador ELONGACIÓN • ADN polimerasa
• Topoisomerasas I y II (se desenrolla 1 y 2 vueltas respectivamente) • Lider---continúa • Retrasada---discontinua TERMINACIÓN • Cuando ADN polimerasa gamma llega al extremo del fragmento del ADN • Desacoplamiento de todo el replicosoma • MADURACIÓN • Complementar síntesis de cadena retrasada y unión de fragmentos de Okazaki • Eliminación de cebadores y unión de extremos resultantes (DNA Pol delta o epsilon, ligasa) • Nucleasas FEN1/RTH1 + Rnasa H1 REPLICACIÓN DE TELÓMEROS (Elongación, translocación, elongación) • TELOMERASA • Transcriptasa inversa ---RNA (9-28 nucleótidos) 1. Elongación: Se une telomerasa y alarga 3´Apareamiento entre DNA telomérico y el ARN de la telomerasa 2 La telomerasa cataliza elongación de extremo 3’ 3 se añaden dNTPs y la telomerasa se desliza sobre 3’ previamente elongado conservando complementariedad por repeticiones (translocación) 4 Nueva elongación por parte de telomerasa 5 se repite translocación y elongación 6 La DNA polimerasa alfa llena la otra hebra y la ligasa sella REPLICACIÓN MITOCONDRIAL • Desplazamiento de lazo D • Unidireccional • Diferente entre hebra L y H (ligera y pesada) • Primero 2/ • L termina a DIFERENCIAS EN REPLICACIÓN ENTRE PROCARIOTES Y EUCARIOTES
2. TRANSCRIPCIÓN (SÍNTESIS DE RNA ) Salazar capítulo 5 Karp capítulo 11 TRANSCRIPCION: Síntesis de ácido ribonucleico a partir de una plantilla de DNA –Karp 428 • Primer paso en la expresión génica es la transcripción • Consiste en la síntesis de una cadena de ARN complementaria y antiparalela a la secuencia de nucleótidos de una de las cadenas de ADN (cadena molde) • Transcrito secuencia idéntica a cadena codificadora (Uracilo por timina) Karp 429 • Los RNA contienen pares de bases que no son comunes y bases nitrogenadas modificadas por ejemplo metiladenosina • El apareamiento de bases entre moléculas de RNA tiene una función en la mayor parte de las actividades en las que éstas intervienen PROMOTOR Karp 485, 430,431 Sitio donde la RNA polimerasa se une al DNA antes de iniciar la transcripción Sitio de la molécula de DNA donde se adhiere la RNA polimerasa antes de iniciar la transcripción El promotor contiene la información que determina cuál de las 2 cadenas se transcribe y el sitio donde inicia la transcripción Salazar 45 Secuencias de ADN regulatorias que no codifican para el producto génico, pero regulan su expresión • Caja TATA 8 pb Promotores MÍNIMO
Región reguladora indispensable para la transcripción del gen Secuencias adyacentes forman parte de él--- modifican tasa de transcripción sin ser imprescindibles para unión de RNA Pol BASAL • Secuencia mínima requerida para la unión de la maquinaria basal de transcripción y RNA Pol II • Incluye Inr y caja TATA o DPE Promotores basales FUERTES • Procariontes y virales • La maquinaria de transcripción se une de forma eficaz y la tasa de transcripción es elevada DÉBILES • La mayoría de eucariontes • Inicio de transcripción menos frecuente • Se requieren secuencias accesorias contenidas en promotores proximales a 200 pb arriba del sitio de inicio (Por ejemplo cajas CG, CAAT y octámero) Unidad de transcripción •Interacción de todas las secuencias funcionales o estructurales posibles y al complejo proteico de enzimas y TF
POTENCIADORES (ENHANCERS) • Secuencias--- potencian o aumentan transcripción del gen • De manera cooperativa con otras secuencias reguladoras alteran la estructura del ADN induciendo superenrollamientos en el promotor y aumentan la unión de TF con aumento en SILENCIADORES • Secuencias cortas: • Modifican estructura • Evitando que FT inductoras se una a ADN • Evitando maduración del RNAhn • Creando señales que bloquean traducción e inactivando expresión génica • 1) Elemento silenciadores • 2) Elementos de regulación negativa (NRE) SECUENCIAS AISLADORAS • Bloquean la transmisión de la señal para un sitio a otro en el ADN e impiden el silenciamiento Tipos de ARN polimerasa • Reconocen promotores y TF con características específicas
• ARN Pol I → RNAr 45S • Precursor de RNAr 18S, 28S y 5.8S • ARN Pol II → ARNhn→ARNm y algunos ARNsn • ARN Pol III→ARNt, ARNr 5S y otros ARNsn • ARN mitocondrial se asemeja a Pol bacteriana ARN polimerasa • 1 subunidad grande • Dominio terminal carboxilo (CTD) • Fosforilada en residuos de serina y treonina • Inicio de transcripción • Corte y empalme • Modificación de extremos del ARN • Terminación • 2 subunidades de reconocimiento • Reconocimiento de secuencia de ADN • Sitio catalítico ARN polimerasas dependientes de DNA
RNA polimerasa Karp 431 • Cataliza la reacción: NTP ribonucleósido trifosfato se dividen en nucleósidos monofosfatados para polimerizar la cadena covalente • Polimerasa cubre alrededor de 35 pb Factores de transcripción karp 432- 431, Salazar 48 • RNA polimerasas requieren de proteínas adicionales para reconocer a los promotores • Proteínas que se unen al ADN en el promotor, potenciador o silenciador para el control de la expresión Factores de transcripción • Una misma secuencia puede ser reconocida por más de 1 TF • Un TF puede ser activador o represor Factores de transcripción de acuerdo a función GENERALES O BASALES • Son requeridos en promotores basales
• Se unen a RNA Pol --- complejo que rodea sitio de inicio (aparato básico de transcripción) • Transcribe genes que se expresan constitutivamente (cualquier tipo celular) TEJIDO ESPECÍFICOS O INDUCIBLES Función reguladora Se sintetizan o activan bajo un estímulo Controlan transcripción en tiempo y espacio Unión preferente a promotores distales Factores de transcripción • Toman el nombre de la ARN Pol con la que actúan • ARN Pol I → TF • ARN Pol II → TF II • ARN Pol III→ TF III SITIO DE LA CÉLULA EN DONDE SE LLEVA A CABO LA TRANSCRIPCIÓN • Burbuja de transcripción por separación parcial ETAPAS DE LA TRANSCRIPCIÓN • INICIACIÓN • ELONGACIÓN • TERMINACIÓN TRANSCRIPCIÓN --- PREINICIO • TBP (Proteína de unión a la caja TATA) • Forma parte del TFIID (factor de transcripción IID) • Interactúa con surco menor del ADN →activa el complejo de inicio y curvando doble hélice TFIIA • Controla capacidad de unión de TBP al ADN • Permite a TFIID reconocer la región que se extiende hacia el extremo 5’ TFIIB • Proporciona superficie de reconocimiento para anclaje de RNA Pol II • Se forma --- Complejo TFIIF y RNA Pol II • RNA Pol --- se coloca en sitio de inicio de transcripción Unión de TFIIE que recluta a TFIIH • TFIIH • Helicasa • ATPasa • Cinasa INICIO • Síntesis de los primeros 10 enlaces del ARN
• Extremo CTD (dominio carboxiterminal) de ARN Pol II se fosforila (por TFIIH) --Abandono del promotor • ARN Pol II se suelta de todos los factores (solo TBP queda unido a TATA) ELONGACIÓN • RNA Pol II sintetiza la cadena • Presencia de TFEII Y TFIIH • PTEFb y TFIIS (Elonguina- también en reparación) • Factores de elongación • Evitan terminación prematura • hSPT5- Factor de procesamiento del extremo 5’ TERMINACIÓN • Elongación, terminación y maduración son simultáneos • Reconocimiento de región rica en GC en serie de adeninas del ARN • Formación de señal de poliadenilación y terminación AAUAAAAA • CPSF • Adición de cola de poli A • Separación del complejo de transcripción • CstF escisión • SF1 recluta el ayustosoma TRANSCRIPCIÓN Karp 432-433 • Intentos infructuosos hasta que llega a 10 nucleótidos Secuencias conservadas corriente arriba. Inicio transcripción. • 1) TTGACA a -35pb («elemento -35») «Secuencia consenso» (más común de las conservadas) • 2) TATAAT a-10 pb Caja Pribnow Identifica el nucleótido que inicia transcripción Es reconocida por proteína σ-INICIO TRANSCRIPCION • Las células bacterianas poseen factores σ que reconocen promotores • Proteína σ «Factor σ de mantenimiento»--Inicia transcripción de la mayor parte de genes • Presenta «tenazas con forma de cangrejo» separa cadena de doble hélice • En algunos modelos el factor se pierde conforme se alarga la cadena • Factores σ alternativos ---transcripción de genes específicos de respuesta común • Ejemplo: Elevación de temperatura de E. coli ---genes de choque térmico (protegen a proteínas de daño) TERMINACIÓN • Transcripción termina cuando se alcanza secuencia nucleotídica específica mediante la proteína rho • Rho • Rodea al RNA recién sintetizado y se mueve a lo largo en dirección
5’→3’ hacia la polimerasa, separación • Polimerasa también puede detener transcripción cuando alcanza Secuencias de terminación que se pliegan en forma de horquilla PROCESAMIENTO DEL ARNhn • Adición capuchón Guanina modificada en 5’ • Poliadenilación 3’ • Corte y empalme • Edición (algunos genes) Adición capuchón Guanina modificada en 5’ • ARN 20-40 ribonucleótidos adición 5’ de 7 - metilguanosina (enlace 5’-5’ de las ribosas) • 3 pasos con 3 enzimas reclutadas por hSPT5 (Factor de procesamiento del extremo 5’ unido al CTD de la ARN Pol II) • Eliminación de grupo fosfato (ARN • Adición de Guanina (metil transfe • Metilación (metil transferasa) ARN polimerasa • 1 subunidad grande • Dominio terminal carboxilo (CTD) • Fosforilada en residuos de serina y treonina • Inicio de transcripción • Corte y empalme • Modificación de extremos del ARN • Terminación • 2 subunidades de reconocimiento • Reconocimiento de secuencia de ADN • Sitio catalítico Poliadenilación 3’ en RNA generados por RNA Pol II quienres presentan señal AAUAAA • CTD de ARN Pol II recluta enzimas • 3 pasos • Escinden al RNAhn • CstF (factor estimulante de escisión) • CPSF (factor específico de poliadenilación y escisión) • Adición de 200 residuos de Adenina (poli-A polimerasa) • ARN Pol II continúa añadi Colapso de burbuja (TERM Corte y empalme (splicing) • Remoción intrones (secuencias intragénicas no codificadoras de la región codificadora) • Empalme de exones (bloques de secuencias codificadoras para formar RNA maduro)
• Variantes de RNAm ---splicing alternativo • Secuencias conservadas de nucleótidos en RNAhn de corte y empalme que limitan corte y empalme • 5’ y 3’ (donante y receptor) Salazar, Karp 450 GGU--- AGG • Sitio de ramificación ---en intrón con Adenina conservada AYUSTOSOMA ---Riboproteína 150 proteínas y 5 RNAsn (U1, U2, U4 y U6) • Median 2 Reacciones de transesterificación sucesivas rompiendo y formando 2 enlaces fosfodiéster y el lazo intrónico 3 etapas en que actúa el ayustosoma: Identificación • secuencias donantes 5’ ----U1 • sitio de ramificación ----U2 Plegamiento ARN ayudado por U4, U5 Y U6 • Ataque nucleofílico de la Adenina conservada en sitio de ramificación (enlace fosfodiéster) • Ataque en Guanina de sitio donante • Formación de lazo intrónico---enlace fosfodiéter Liberación de U1 remplazado por U6 • Liberación de lazo intrónico • Liberación U4 • Contacto de U6 y U2 • Unión de exones por U5 • AYUSTOSOMA Reciclado y Reclutado por el CTD de la ARN Pol II a través de TAT-SF1 Edición postranscripcional del ARN • Ciertos genes y tejidos Mecanismos • 1) Desaminación oxidativa de Citosina Metilada--- Uridina (por citidina desaminasa) CAA---UAA (stop) • 2) Adenina por inosina que se une con citosina (por adenosina desaminasa de acción sobre ARN ADAR) — Humanos • Otro mecanismo en procariontes: Inserción o deleción de Uridina (cambia marco de lectura) Apolipoproteína B (Apo B) • ARNm HÍGADO---100aa (APO B-100) • ARNm INTESTINO • EDICIÓN • C en 2152 se desamina---→U • CAA--→UAA (stop) • 48aa (APO B 48) Actinomicina D---antibiótico
• Contiene péptidos y se obtiene a partir de Streptomyces • Se une al DNA de doble hélice impidiendo que sea molde eficaz para síntesis de RNA • Su anillo de fenoxazona se acomoda entre pares de bases adyacentesIntercalación • A bajas concentraciones inhibe solo transcripción y no replicación • Tx Cáncer Rifampicina---Antibiótico • De rifamicinas que se obtiene a partir de Streptomyces • Inhibición de inicio de transcripción • Interfiere en la formación de los primeros enlaces fosfodiéster en la cadena de RNA—Iniciación • Complejo RNA polimerasa procarionta y rifampicina Bloquea el canal por el que d debe pasar el híbrido RNA-DNA • Tuberculosis • No eucariontes α amanitina (amanita phalloides) «ángel dest ructor o sombrero de la muerte» • α amanitina se une fuertemente a RNA Pol II bloqueando la elongación de la síntesis de RNA • Pol III ---dosis altas • Pol I ---NO • 100 muertes cada año •
PROCESOS DE MODIFICACIÓN POSTRANSCRIPCIONAL DEL RNAM, EL RNAT Y EL RNAR EN PROCARIONTES Y EUCARIONTES. • Genes RNA ribosomal, mensajero y transferencia Karp 435 -440 (Karp 6ª 428-433) • Células eucariotas contienen millones de ribosomas (rRNA y docenas de proteínas) • ˃ 80% del RNA de las células es ribosómico • Secuencias de rDNA que codifican rRNA se repite cientos de veces • Se agrupa en 5 acumulaciones en cromosomas diferentes • En interfase los grupos forman nucléolos (apariencia granular) • NUCLEOLOS participan en la formación de • NUCLEOLO TIENE OTRAS FUNCIONES NO CONSIDERADAS EN EL TEXTO ADEMAS DE FORMACIÓN DE RIBOSOMAS OVOCITOS DE RANA • Componente Granular • Componente Fibrilar • Componente Fibrilar Denso Árbol de navidad, tándem ---genes que codifican RNA
Ribosómico en porción fibrilar de nucléolos
Seres humanos • A partir de un solo pre- rRNA 45S de 13 000 nucleótidos • 28 S (Unidad de Svedberg- coeficiente de sedimentación del RNA) • 18 S • 5.8 S
• Fuera del nucléolo a partir de otro RNA precursor 5S PRE rRNA • Contiene nucleótidos metilados y residuos de sudouridina con función no clara, pueden ser: • Protección • Plegamiento • Interacciones con otras moléculas • A partir de un solo Pre-rRNA 45S • 18S • 32S • 28 S • 5.8 S • Cortes enzimáticos pb por «exoma» • 4S—5.8 y tRNA PRE rRNA y snoRNA • Se adhieren snoRNA con proteínas ----ribonucleoproteínas nucleolares pequeñas (snoRNP) • SnoRNA U3 es la primera en unirse al pre rRNA • SnoRNA de caja C/D---Determina que nucleótidos se metilan • SnoRNA de caja H/ACA--- Determinan que uridinas se convierten en seudouridinas SnoRNA
• Algunos de 10 a 20 nucleótidos son complementarios a rRNA formando dúplex • Mas de 200 snoRNA diferentes Nucléolo • Procesamiento de rRNA • Ensamble de 2 subunidades ribosómicas • ˃200 proteínas involucradas se dividen en 2 grupos: • Ribosómicas que permanecen en las subunidades • Accesorias para el procesamiento (por ejemplo Helicasas) rRNA 5S • 120 nucleótidos • Transcrito por RNA Pol III (puede unirse a un sitio promotor situado dentro de la porción transcrita del gen blanco) RNA TRANSFERENCIA • Codificado por secuencias repetidas de DNA con pequeños agrupamientos diseminados por el genoma • 1 agrupamiento---contiene múltiples copias de diferentes genes de tRNA (secuencia de DNA que codifica un tRNA se encuentra en más de 1 agrupamiento) • Repeticiones de acuerdo a cada organism • HUMANO 1300 • Moscas de fruta 850 • Levadura 275 tDNA • Tienen secuencias espaciadoras no transcritas y secuencias codificantes que se sitúan en intervalos irregulares en tándem • Se transcriben por RNA Pol III • La secuencia promotora se localiza en región codificante del gen tDNA procesamiento • Extremos 5’ y 3’ deben eliminarse • Modificación de bases • Ribonucleasa P –endonucleasa • RNA – cataliza corte del sustrato pre-tRNA y subunidad proteica • 1 que tipo de bases nitrogenadas forman la secuencia de shine dalgarno • 2 RNA polimerasa q se encarga de replicación del DNA mitocondrial • 3 cuantos pares de bases conforman un nucleosoma • 4 que es un operon • 5 enzima encargada de enlazar ama
TRADUCCIÓN (SÍNTESIS DE PROTEÍNAS) SALAZAR Capítulo 6 KARP 461 – 477 (6ª 455-471) 64 COMBIANCIONES POSIBLES
Características del código genético ESPECÍFICO Y CONTINUO • Cada codón significado único • Se leen en forma continua • No sé sobre lapa REDUNDANTE PERO NO AMBIGUO • Degenerado (excepto metionina y triptófano) • Una base puede ser 4 veces degenerada (Ej. alanina) • Aminoácidos sinónimos UNIVERSAL -----CASI UNIVERSAL • Excepciones --- mitocondrias, mamíferos, bacterias
DIFERENTE
CARACTERÍSTICAS DEL CÓDIGO GENÉTICO •Sin puntuación •Tripletes •No se superpone •“Universal” •Degenerado CONSUMO ENERGETICO PRODUCIDO POR LA CÉLULA DURANTE TRADUCCIÓN •80% DE ATP •20% DE GTP
ARNr Eucariontes •5 S •5.8 S •18 S •28 S Procariontes •5 S •16 S •23 S P-Peptidilo • Peptidil-ARNt—elongación A-Centro Aminoacilo • Sito donde entra Aminoacil- ARNt correspondiente a lectura E- Centro de Eliminación • Sale ARNt sin aa Fenómeno de bamboleo o fluctuación 2 reglas 1. Bases 3ra y 2da del anticodón forman Puente de H con 1ra y 2da del codóndetermina especificidad interacción 1. 2. 1ra base del anticodón puede girar para interaccionar con interaccionar con distintas bases en la 3ra posición del codón –interacción más débil
Anticodones NUCLEÓTIDOS •ANTICODON---------CODON •URACILO 1ra ------A o G 3ra •GUANINA 3ra ------U o C 3ra •INOSINA 3ra---------C, U o A 3ra •Inosina se une con guanina ACTIVACIÓN DE AMINOÁCIDOS • Por enzima aminoacil- ARNt sintetasa • Hidrólisis de 2 moléculas de ATP
• Remoción pirofosfato • Hidrólisis de pirofosfato a 2 ac fosfóricos (pirofosfatasa) • aa se una a tRNA específico •Se antepone nombre del aminoácido •Mentionil ARNt…leucinil… etc. FASES DE TRADUCCIÓN • INICIO de síntesis proteica • ELONGACIÓN de cadena polipeptídica • TERMINACIÓN de la síntesis de proteínas INICIO de síntesis proteica • AUG • Formación del complejo • Formación del primer enlace peptídico • Unión ARNm a subunidad menor (ARNr) con ayuda de IF (factores de iniciación) • Metionil-ARNt entra a sitio P—reconoce AUG • Ayudan: • eIF4 eucariotas • IF3 procariotas • Dirección de lectura • Codones 5’→3’ • Anticodones 3’→5’ • Subunidad mayor forma complejo • ayuda IF • IF2 se asocia a GTP uniéndose a metionil- RNAt y complejo ribosomal--complementarios codón/anticodón— hidrólisis de GTP--- unión estable SECUENCIAS ARNm QUE SE UNE A ARNr (Subunidad menor) SHINE DALGARNO BACTERIAS •Rica en Purinas •Rio arriba 5’ a 6-10pb antes de codón de inicio •Complementaria a RNAr (3’)
KOZAK
EUCARIONTES
•En codón de inicio •Purina en -3 •Guanina en +4 •Dentro de ésta se encuentra codón de inicio ELONGACIÓN de cadena polipeptídica • PEPTIDILTRANSFERASA • Enlace peptídico • aa iniciador extremo –COOH (con NH2 (radical amino) del si PASOS PARA AÑADIR UN AMINOÁCIDO • Decodificación del aminoacil-ARNt en sitio A • Transferencia del aa al peptidil-ARNt • Desplazamiento del ribosoma DECODIFICACIÓN DEL AMINOACIL-ARNT EN SITIO A • Complejo ternario (3): • Factor de elongación (EF) con unión a GTP • Aminoacil-ARNty GTP-• EF-Tu también en bacterias • EF-1a en eucariotas TRANSFERENCIA DEL AA AL PEPTIDIL-ARNT • Cuando aminoacil-ARNt se une a codón de ARNm---- hidrólisis de GTP a GDP (libera ácido fosfórico) ---formación de enlace peptídico (PEPTIDIL TRANSFERASA) • Segunda hidrólisis de GTP (EF-G -Bacterias- o EF-2 – eucariontes DESPLAZAMIENTO RIBOSOMAL hacia 3’ de RNAm (TRANSLOCACIÓN) TERMINACIÓN de la síntesis de proteínas • Cuando A lee codones de stop • Factores de liberación –hidroliza peptidil tRNA FACTORES DE LIBERACION CLASE I ESPECÍFICOS DE CODON •RF1 •RF2 •Erf -1 CLASE II •RF3 •eRF-3 • RNAm puede leerse de nuevo • Polisoma o Polirribosoma
MODIFICACIÓN POSTRADUCCIONAL Salazar 60-63 • Modificaciones covalentes reversibles (Fosforilación, acetilación, ADP ribosilación) Fosforilación Y Desfosforilación • Más comunes • Se agrega y se quita fosfato • Regula la actividad biológica * Fosforilación de glucógeno * Serina, treonina y tirosina • Modificación covalente • Cinasas-fosforilan (Fosforilación) • Fosfatasas – eliminan fosfatos (Desfosforilación) Acetilación • Modificación de N-terminal (grupo miristoil de 14 carbonos) • 50% de eucariontes • Aumenta resistencia a degradación • Lisina de H4 • Acetil-CoA-------- Donador de acetilo • Modificación de N-terminal --- grupo miristoil de 14 carbonos (donador miristoilCoA) * Unión a membranas Miristoil • El univalente radical derivado de ácido miristico por la pérdida del grupo hidroxil ADP ribosilacion stryer 298 • Modificación covalente
• Molécula dadora + • Ej. Proteína modificadora RNA polimerasa (transcripción) Modificaciones covalentes irreversibles (glucosilacion, hidroxilacion, proteólisis controlada, unión a grupos prostéticos) • Glucosilacion • Frecuente • Unión covalente de cadenas de oligosacáridos (glicanos) • No regulan actividad proteica • Producen plegamiento de dominios por propiedad hidrofilica de azucares • Evitan degradación extracelular • Post membranas • No en procariontes (si eucariontes y virus) Hidroxilacion • Hidroxilasas de (RE) --- incorporan grupo hidroxilo OH • Por enzimas *prolilil hidroxilasa I * idil hidroxilasa • Depende de vitamina C (cofactor) ----- escorbuto *falta de vitamina C *prolina (50% de las de colágeno) *lisina *amidación C terminal (donante es glicina) *oxitócica y vasopresina Tetraciclinas stryer 909 • Se une a la subunidad 30s e inhibe la unión de los aminoacil -tRNA (en procariotas) Estreptomicina (aminoglucosido) • Inhibe la iniciación y origina lectura errónea del mRNA (en procariotas) Cloranfenicol • Inhibe la actividad peptidiltransferasa de la subunidad ribosómica 50s (en procariotas) • Inhibe la formación de enlace peptídico Eritromicina • Se une a la subunidad 50s e inhibe la translocación (en procariotas) Puromicina • Provoca la terminación prematura de la cadena al actuar como un análogo del aminoacil-tRNA (en procariotas y eucariontes) • Análogo de la porción terminal del aminoacil-tRNA • Solo experimental, no fines medicinales
Dehidroemetina • Amebiasis tisulares • Bloquea la síntesis de proteínas (ribosoma) • Inhibición de la síntesis de ADN Cicloheximina • Peptidiltransferasa • Inhibe la translocación (en eucariontes) • Laboratorio Toxina diftérica stryer 910 • Bloquea síntesis de proteínas en eucariontes al inhibir la translocación • El fragmento A de la toxina modifica covalentemente el factor 2 de Elongación (EF2) • Producida por corynebacterium diphtheriae • Difteria --- primera causa de muerte infantil, antes de vacunas • Dolor de garganta, fiebre, ronquera, disnea
MUTACIONES Y REPARACIÓN CELULAR Mutación • Todo cambio permanente ocurrido e n la secuencia de bases del DNA que se puede trasmitir o heredar • +↑ 1% polimorfismo • -↓ 1% mutación Clasificación • Tipo de célula *somática. Cualquier célula, excepto germinales, no se hereda *germinal. Células sexuales (óvulo y espermatozoide) se hereda • Magnitud Grandes o cromosimicas Medianas – secuencias repetidas *4p16 repetido Huntington Pequeñas o puntuales -inserción --- mete par de base -deleccion ---- quita -sustitución ---- cambia
•Mecanismo Endógenas (espontaneas o fortuitas) -Errores de replicación -desaminacion oxidativa de bases -inestabilidad química N-glucosidico Exógenas -químicos --- plomo, tabaco -físicos ---- Rx ionizante -biológicos ---- virus --- VPH Transición --- cambio de pirimidina por pirimidina, o de purina por purina Transversion --- cambio de pirimidina por purina, o purina por pirimidinas Mutaciones silenciosas (no efecto en proteína) • Con sentido, sinónimas, neutrales • Degradación del código genético --- mismo aa No silenciosa (efecto en proteína) • De sentido equivocado, no sinónim as, falso o alterado (missense) • aa por otro aa • Cargada o polaridad diferente --- no conservadora Sin sentido (nonsense mutations) • STOP • UAC muta UAG… etc. … no silenciosa Terminación retrasada • Con cambio en el marco de lectura (frameshift mutation) -Deleccion o inserción de pares de bases que no son múltiplos de 3 • No cambian el marco de lectura -Deleccion o inserción en múltiplos de 3 Karp 529-530 6TA SINOPSIS • Proteosoma -capuchón -subunidad α -subunidades β -subunidad α
Degrón • Secuencia interna especifica de aminoácidos que asegura que algunas proteínas no sobrevivan mucho tiempo dentro de la célula • Proteinas pueden sobrevivir solo pocos minutos • División celular *vida media • Aminoácidos se relacionan con proteínas que tienen vida media corta --- arginina y lisina – dan la carga + de las histonas • Enzimas que se requieren para la unión de proteínas al grupo de moléculas de ubiquitina para su degradación. • E1 • E2 • E3 • Modificación postraduccional esencial para el glutamato de la trombina carboxilacion • Proceso de maduración postraduccional que actúa en la lisina de la Histona H4 -acetilación Mutaciones y reparación del DNA • Mecanismos de reparación • Reparación por escisión de base --- VER • Elimina nucleótidos alterados • Reparación por escisión de nucleótidos --- NER • Corte y pegado • Vía acoplada a transcripción • Vía genómica global • Principal efecto de la luz ultravioleta de la luz solar • Une covalentemente residuos de pirimidina adyacentes • Enzima que utiliza la absorción de un fotón para adquirir un estado excitado que escinde dímeros de pirimidina • DNA fotoliasa corrige Polimorfismo • Variante génica que se presenta en cuando menos 1% de la población de una especie Fenilcetonuria (PKU) • ↓ fenilalanina hidroxilasa • Cromosoma 12q22-24.1 • Gen PAH Reparación por escisión de nucleótidos • Mecanismos de reparación opera por corte y pegado eliminando di versas lesiones voluminosas incluidas los dímeros de pirimidina
• Incidencia hemofilia A: 1/5000-10000
deficiencia de la actividad del factor VIII
• Hemofilia B: deficiencia en la actividad del factor IX de la coagulación • Ligada al X recesiva Anemia de células falciformes • Autosómica recesiva • Gen beta globulina • T por A • Acido glutámico (-) por valina (+) • Cromosoma 11 • Polímeros cruzados que deforman el glóbulo rojo Cuadro de punnett La suma del cuadro = 100% Calculo de riesgo
Leyes de Mendel • Ley de la uniformidad (X) • Ley de la segregación • Ley de la segregación independiente o distribución independiente Ley de la uniformidad • Si se cruzan 2 individuos puros para un determinado carácter los genes se separan y se reparten de tal forma que los descendientes serán iguales fenotípicamente y genotípicamente • Solo se manifiesta el carácter dominante Ley de la segregación • Durante la formación de los gametos cada alelo de un par se separa del otro (meiosis) • Pude volver a manifestarse el carácter recesivo • Proporciones de color • 3:4 amarillo y 1:4 verde Ley de la segregación independiente o distribución independiente
• Diferentes características se heredan independientemente unos de otros combinándose en forma al azar en la descendencia Hemofilia Ligada a X recesivo Mujer portadora y hombre sano 50% sin enfermedad 50% enfermos 50% sin enfermedad 50% portadoras Autosómica recesiva AR
mutación
COMPETENCIA III NIVELES DE REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN GENÉTICA
Karp 499-503 control de la expresión génica en eucariotas Salazar 67-68 Control transcripcional en procariotas • Operon – bacteria • Agrupación de genes que codifican enzimas para una misma vía metabólica • Consta de: 1. Genes estructurales 2. Región promotora 3. Región operadora 4. Gen regulador • Genes estructurales -Codifican para las mismas enzimas adyacentes a RNA polimerasa, se mueve uno tras otro transcribiendo un solo RNAm pero solo se traduce en diferentes enzimas -El encendido de un gen enciende a todos los genes • Región promotora -sitio donde RNA polimerasa de une al inicio de la transcripción • Región operadora -adyacente o traslapado con el promotor
-ahí se une el represor • Gen regulador -codifica proteína represora Represor • Proteína reguladora de genes • Se une al operador • Determina si un segmento se transcribe o no Lactosa • En bacterias expresión determinada por factores ambiental es (disponibilidad de alimento) • Galactosidasa β cataliza la reacción de la lactosa en: glucosa + galactosa • Galactosidasa β en condiciones minimas solo se requiere un RNAm, cuando se aumenta la concentración de lactosa en el medio se aumenta hasta 1000 veces la trascripción de dicha enzima Operon lac • Contiene enzima para degradar lactosa • Operon inducible: solo en presencia de sustancia metabólica (lactosa) Induce la transcripción de genes estructurales • Contiene 3 genes estructurales -gen z --- Galactosidasa β -gen y --- permeasa de galactosido -gen a --- acetiltransferasa de tiogalactosido Lactosa funciona como inductor • Medio con lactosa --- unión a represor lac --- cambia conformación de represor lac (incapacitándolo para unirse a la región operadora del DNA) --- los genes estructurales se transcriben --- catabolismo de lactosa • Medio sin lactosa --- represor se una a DNA e inhibe *no hay transcripción RNAm policistronico • Varios genes traducen a varias proteínas Operador triptófano • Represor solo actúa cuando se une a triptófano Regulación genética en eucariontes karp cap 12 509 • Epigenetica.- herencia que no está codificada en el DNA • Suele ser reversible • Epigenoma --- cambios • Cromosoma X inactivo --- metilación
Se piensa que las modificaciones presentes en las colas de las histonas de cromatina progenitora determinan las modificaciones que serán introducidas en las histonas recién sintetizadas (cromatina hija) • Ej. Lisina metilada en posición 9 de H3 • El patrón de metilación de la cromatina y su estado condensado se transmite a células de la descendencia Alteraciones de metilación originan enfermedades • Pueden originar diferentes entre: -longitud de genes *rel con ambiente -susceptibilidad a enfermedades Prader willi • Retraso mental, obesidad y desarrollo gonadal deficiente, Manos y pies muy pequeños, obesidad, hiperfagia, hipotonía muscular, estatura baja e hipogonadismo hipogonadotrófico. Deleción-inserción en la región (15q11q13) • Metilación • Deleciones • Disemia uniparental materna • Pierde papa • 15q11-q13 Angelman • 15q11-q13 • Pierde mama • Disomia uniparietal paterna • Gen mutado UBE3A Metilación del DNA karp 6° 520 • 1 de cada 100 nucleótidos porta un grupo metilo que se une al carbono 5 de una citosina • Metiltransferasa de DNA (codificadas por DNMT) -agregan grupo metilo a DNA • Marca epigenetica • Mamíferos metilaciones son parte de dinucleotidos dentro de secuencias Simétricas 5´-CpG-3´ -secuencias repetidas no codificadoras -principalmente elementos transponibles - metilación mantiene estos elementos en un estado inactivo Metilación • DNMT mutantes se relacionan con enfermedad
• Estudios de elementos transponibles en células germinales • Cada 100 espero metilado Metilación y represión transcripcional • Metilación de promotor --- gen inactivo • Cromosoma X primero se metila • Mantenimiento de represión por proteínas o enzimas *Se une al sitio metilado y recluta complejos correpresores --- compactación Cromatina *Actividad de HSAC ---Eliminación de grupos acetilo *SUV39h1 --- metilan residuos H3k9 *MeCP2 --- se une a dinucleotidos CpG metilados X frágil • La mutación que origina el síndrome afecta a una región del cromosoma X en la que se sitúa el gen FMR-1. La expansión del trinucleótido tiene lugar en la región reguladora del gen, siendo este trinucleótido CGG (Citosina-Guanina-Guanina). Cuando el número de repeticiones supera el valor umbral de 230 repeticiones se produce la metilación del gen y, por tanto, éste pierde su función, produciendo así el síndrome del X frágil. Metilación aberrante ---- cáncer Metilación • Marca estable pero sujeta a regulación al pasar a siguiente generación PROCESO DE REMODELACIÓN DE LA CROMATINA Karp 7° 499- código de histonas y formación de la heterocromatina • Código de histonas --- residuos de histonas pueden modificarse mediante: -metilación, acetilación, Fosforilación o ubucuitinacion Modificaciones de histonas actúan de 2 formas • 1.- loa residuos sirven como sitios de acoplamiento para reclutar grupos de proteínas --- modifican actividad y estructura • 2.- los residuos modificados alteran de manera en que las colas de histonas de nucleosomas vecinos interactúan entre sí o con el DNA al cual están unidos --alteraciones en estructura • Ej. Acetilación de lisina en porción 16 de la histona H4 impide que interactúe con H2A de un nucleosoma adyacente --- inhibe la formación de fibra compacta de cromatina de 30nm Grupos metilo se agregan --- a residuos de lisina (K) o arginina (R)
• Cada residuo de lisina pu ede tener agregados de 1-3 grupos metilo y cada arginina 1-2 • Acetatos --- a residuos de lisina • Fosfatos --- serina (S) Acetilación de lisinas (K) --- actividad de transcripción • Metilación --- depende de cual residuo se metile: • Lisina 9 de H3 (H3K9) --- heterocromatina --- represión • H3K27 Y H4K20 --- represión • H3K4 Y H3K36 --- activación Moléculas que quitan marcas • Desacetilasas • Desmetilasas • Fosfatasas PROCESOS DE REGULACIÓN DE LA TRADUCCIÓN DEL RNAmm karp 7° 536 • Maskin = mascarina • RNAm cola corta de poli A – proteína maskin se une --- CPEB (se une a UTR3´) • CPEB fosforilada atrae a --- CPSF recluta a --- PAP polimerasa de poli (A) --- unión a PABP --- alteran el-IF46 (factor de iniciación de Traducción) • Inactivo --- activo PAPEL DE LOS RNASI Y RNAMI EN LA TRADUCCIÓN del RNAm • RNAsi (pequeños de interferencia) • Se unen a RNAm y produce una degradación enzimática • Experimentalmente inhibe expresión de genes • 20-25 nucleótidos • Rama • Se unen a RNAm y bloquean la traducción (no degradan) • 21-23 nucleótidos REPERCUSIÓN DEL MEDIO EN EXPRESIÓN GÉNICA CAP 12 KARP • Hormonas que regulan a t ravés de receptores karp 6° 609 • Los receptores de hormonas esteroideas funcionan como factores de transcr ipción regulados por un ligando • Las hormonas esteroideas se difunden a través de la membrana plasmática --- se unen a receptores en el citoplasma --- dicho complejo tiene cambios conformacionales que los desplazan hacia el núcleo ---uniéndose a promotores o intensificadores de los genes de respuesta hormonal --- aumento de la transcripción
Activación por cortisol (hormona esteroidea) ↑estrés
• Glucorticoides: es un ejemplo de activación transcripción • Secreción de glucocorticoides se eleva durante periodos de estrés (ayuno, O daño físico intenso) • Superfamilia de receptores nucleares incluye (evolución de ancestro en Común funcionan como factores de transcripción) -hormonas tiroideas -Ácido retinoico -estrógenos
SnRNA karp 7° 452 • U1 complementaria a secuencia de corte y empale 5´del pre-mRNA • U1 reconoce 5´ • U2 se une y ocasiona un residuo de adenosina • U2 reclutada por la proteína U2AF, que se une a la secuencia de polipirimidina cerca del sitio de corte y empalme 3´ -- hace que se resalte adenosina • U2AF interactúa con proteínas SR que se unen a potenciadores del Corte y empalme exonico (ESE) • Unión de U4/U6 Y U5 al pre-mRNA con el desplazamiento de U1 • Ensamble de un empalmosoma • U4 y U6 se parean uno con el otro • U4 se separa del dúplex y las regiones de U6 que estaban apareadas Con U4 forman pares con una porción de U2 • Otra porción de U6 se halla en el sitio de corte y empalme 5´, despla zando a U1 que antes estaba ahí • Hipótesis • U6 es un ribosoma • U4 es un inhibidor de su actividad catalítica • Una vez que U1 y U4 se desplazan, el U6 está en posición para catalizar las dos reacciones químicas necesarias para retirar el intron • Otra visión alternativa • Las reacciones son catalizadas por la actividad combinada de U6 y una Proteína de U5
• Se piensa que la porción 5´ libre del exón se mantiene en su lugar por su relación con el U5 del empalmosoma, que también interactúa con el exón 3´ • Una segunda reacción de corte en sitio de corte y empalme 3´ -Elimina el intron en forma de lazo • Se liberan las U del pre-mRNA Cambios de molécula de DNA: pérdida, amplificación, rearreglo de genes estabilidad del genoma karp 7° 406 cap 10 • La organización del genoma sufre cambios rápidos • Poliploidizacion (duplicación completa del genoma humano caso ext remo de duplicación génica que ocurre con poca frecuencia) --- se produce una descendencia que tiene 2 veces el número de cromosomas en cada célula (4 homólogos de cada cromosoma en lugar de 2) -puede revertirse en siguientes generaciones -puede producir una nueva especie Duplicación génica --- hacer doble una pequeña porción de un cromosoma Poliploidizacion por 2 procesos 1. Dos especies relacionadas se aparean formando un organismo hibrido -más frecuente en plantas – flores – trigo – plátano – algodón – papas – café 2. Cromosomas de un embrión unicelular se duplican conservándose En una sola célula - más frecuente en animales Copias excesivas de un gen pueden tener varios destinos • Eliminarse por deleción • Quedar inactivas por mutaciones deletérea s – muta y se elimina la acción de ese gen • Evolucionar y transformarse en genes originales con funciones novedosas Duplicación y modificación de secuencias de DNA karp 407 • Duplicación génica sucede más frecuentemente • Cada gen del genoma tiene alrededor de 1% de probabilidades de duplicarse cada millón de años • Se produce por varios mecanismos, el más frecuente es el entrecruzamiento desigual Entrecruzamiento desigual • En meiosis los cromosomas homólogos quedan mal alineados • Un cromosoma adquiere un segmento adicional de DNA (una duplicación) y el otro lo pierda (una selección)
• Si la duplicación se repite en generaciones subsiguientes, se crea un grupo de segmentos repetidos en tándem en un sitio localizado dentro de ese cromosoma • Casi todos los genes duplicados se pierden durante la evolución mediante (selección o mutación) • Mutaciones sucesivas de un gen pued en formar familias multigenicas • En pocos casos la copia adicional acumula mutaciones --- adquiere una nueva función • Lo más frecuente es que ambas copias muten --- isoformas distintas. Ej. Tubulina α y β • Duplicaciones subsecuentes de uno de los genes puede inducir a la Aparición de isoformas adicionales (tubulina ɣ) • Familias de genes codifican polipéptidos con secuencias de aminoácidos relacionados Genes de globina familia multigenica • Hemoglobina Es un tratamero (4 polipéptidos de globina) Cada uno de los genes está formado por 3 exones y 2 intrones Genes semejantes a la globina (leghemoglobina de las plantas y la mioglobina de los músculos) 4 exones y 3 intrones (representan la forma original del gen de la globina) Globina β (cromosoma 11) Globina α (cromosoma 16 PAPEL DEL PROCESAMIENTO ALTERNATIVO EN LA DIVERSIDAD GÉNICA: PROTEOMA VS GENOMA • Genoma humano contiene entre 20 000 y 22 000 genes, cada uno de los cuales puede dar origen a diversas proteínas • Proteoma es todo el inventario de proteínas que produce un organismo, ya sea humano o de otro tipo; inventario de todas las proteínas presentes en un tejid o, una célula o un organelo particular • Proteomica, describe el campo creciente de la bioquímica de las proteínas, Se usan tecnologías avanzadas y computarizadas de alta velocidad para realizar ensayos a gran escala en conjuntos diversos de proteínas Genética y cáncer • El cáncer es fundamentalmente una enfermedad genética • Las mutaciones que controlan la prol iferación y muerte celular son: • Esporádico: tumores únicos unilaterales (inicio tardío) • Familiar: tumores múltiples bilaterales (inicio temprano) Mutaciones asociado con el gen • Oncogenes
• Genes tumor supresor (GTS) Oncogén • Forma mutada de un ge n normal (llamado protooncogen) • Codifica proteínas que regulan la progresión ordenada del ciclo celular, la división celular y la diferenciación • Oncogén – acelerador de la proliferación celular • Normal -control (+) de proliferación celular -control (-) de apoptosis -actúa solo cuando recibe señales reguladoras especificas • Mutado -se activa -independiente de señales reguladoras • Proteinas que codifican • Factor estimulante del crecimiento Activación de oncogenes • Mutación puntual cambio por base • Translocación --- junto a un gen activo o punto de ruptura dentro de un oncogén • Linfoma de burkitt t (8; 14) (q24; q32) gen Myc • Cromosoma philadelphia (9; 22) • Amplificación gen • Inserción promotor viral • Hipometilacion --- enciende • Metilación general --- apaga Oncogenes • Se expresan con carácter dominante • Normalmente telomeros Genes tumor supresor • Herdan una mutación • Enfermedad se requieren 2 mutaciones • Se produce cáncer Genes tumor supresor --- freno • Normal -Control (-) de proliferación -Control (+) de apoptosis • Mutado -Perdida de función de la proteína que codifica proliferación excesiva -Acumulación de daños -Tumor -- Ca
Expresión de genes supresores • Se expresa con carácter recesivo • La pérdida de la función se produce solo si están mutados los 2 alelos • Individuos que heterocigotos (que han heredado un alelo mutado ) tienen predisposición a la aparición de cáncer Hipótesis de los genes • Heredan mutación se requiere otra mutación para producir enfermedad --- perdida de heterocigosidad Retinoblastoma • Gen tumor supresor RB1 • Cromosoma 13q14 • Esporádico – ojo • Familiar --- todo cuerpo Condición heterocigota • Gen TP53 • Proteína P53 • Guardián del genoma Sx de li-fraumeni • Mutación del gen TP53 • Autosómico dominante • Predisposición a cáncer • Tumores de: Tejidos blandos Sarcomas Mama Leucemia Osteosarcoma Melanoma Colon Páncreas cerebro • Proteinas que codifican GTS y oncogenes • Factor de crecimiento • Receptor tirosina cinasa Alteraciones citogenicas • Linfoma de burkitt • Gen MYC --- Oncogén • Translocación (8; 14) (q24; q32) • Leucemia mieloide crónica • Translocación (9; 22) (q34; q11) • Cromosoma philadelphia • Imatinib medicamento Otras enfermedades genéticas con predisposición a cáncer • Neurofibromatosis
• 17q11.2 • Neurofibromina • Klinefelter • 47XXY • Cáncer de mama • Tuner • 45X • Gonadoblastoma • Down 21XXX • Leucemia mieloide Diferente locus, diferente alelo, mismo fenotipo Cáncer y ambiente • Físicos, químicos y biológicos • Síndrome de inestabilidad cromosómica por error en mecanismo de reparación • Síndrome de Bloom • Autosómico recesivo • Alteración de DNA ligasa • 15q 26.1 • Xeroderma pigmentoso • Autosómico recesivo • Alteración en reparación por daño de luz UV • Ataxia – telangiectasia Protooncogenes --- alterado -- oncogenes • Genes que codifican proteínas que regulan de manera normal y fisiológica la cascada de eventos que sirven para mantener el control de la progresión del ciclo celular y el estado normal de diferenciación de la célula • Se les antepone el prefijo “c” de celular para distinguirlos de las Versiones virales, a las cuales se les antepone el prefijo “v” Genes tumor supresor antioncogenes • Operan restringiendo suprimiendo la proliferación celular bajo ciertas condiciones • Actúan recesiva Gen de retrovirus SRC • Pertenece a la familia cinasas de tirosina • Regulan desarrollo embrionario y crecimiento celular • Sarcoma de pollo
• Inyectando homogeinado de sarcoma en pollos sanos --- sarcoma Ras
Salazar-Karp • Proteína G asociada a membrana • Une en GTP/GDP a través de su actividad GTPasa --- traducción Señales --- crecimiento celular • 3 protooncogenes • Ha-ras (harvey) • K-ras (kirsten) • N-ras • Mutaciones puntuales (codones 12, 13, 61, otros 59, 63, 116 y 119) activan potencial oncogénico alterando la secuencia de P21 • Se relaciona con tumores celulares en las primeras fases de malignizacion de canceres colorrectal y adenomas grandes
MYC karp Linfoma de Burkitt T (8; 14) (q24; q32) Mononucleosis infecciosa MUTACIÓN PUNTUAL • Magnitud • Grandes o cromosimicas • Medianas – secuencias repetidas *4p16 repetido Huntington • Pequeñas o puntuales -inserción --- mete -deleccion ---- quita -sustitución ---- cambia
• Mutaciones puntuales subdivisiones • Transición --- cambio de pirimidina por pirimidina, o de purina por Purina • Transversion --- cambio de pirimidina por purina, o purina por pirimidina Mutaciones silenciosas (no efecto en proteína) • Con sentido, sinónimas, neutrales • Degradación del código genético --- mismo aa
No silenciosa (efecto en proteína) • De sentido equivocado, no sinónim as, falso o alterado (missense) • aa por otro aa • Cargada o polaridad diferente --- no conservadora Sin sentido (nonsense mutations) • STOP • UAC muta UAG… etc. … no silenciosa Terminación retrasada • Con cambio en el marco de lectura (frameshift mutation) -Deleccion o inserción de pares de bases que no son múltiplos de 3 • No cambian el marco de lectura -Deleccion o inserción en múltiplos de 3 TRANSLOCACIÓN CROMOSOMICA • Translocación relacionada con leucemia mieloide crónica • BCR-ABL • (9; 22) VPH Salazar 201 • Alto riesgo de cáncer cervicouterino Alto riesgo VPH 16 y 18 De bajo riesgo VPH 6 y 11 Sis, erb B karp • Virus del papiloma humano (VPH), VIH COMPETENCIA IV. TÉCNICAS DE MANIPULACIÓN DEL DNA LA TECNOLOGÍA DEL DNA RECOMBINANTE EN EL CAMPO DE LA MEDICINA. Stryer 148… (Capitulo 5) Salazar – (capitulo 13) Karp • Construcción de nuevas combinaciones de a partir de genes no relacionados • Se pueden clonar • La dotación genética del hospedero se puede alterar (modificar) de forma permanente o intencionada DNA recombinante. • Inserción de combinación de material genético (modificado) donde serán replicadas por la maquinaria de síntesis de DNA del hospedero • Moléculas de DNA que son derivadas de más de una fuente Karp 764
Clonar: • Amplificar muchas veces Nucleasas • Enzimas que cortan enlaces fosfodiéster Endonucleasas • Nucleótidos dentro de la cadena • Enzimas de restricción Exonucleasas • Nucleótidos en extremos de la cadena • 3’exonucleasas • 5’endonucleasas Enzimas de restricción Karp 765 • Reconocen secuencias Diana • Cortan largas cadenas para su manipulación y análisis de fragmentos pequeños • Restringen la permanencia de un ADN exógeno en la célula bacteriana que produce dicha enzima • Suelen reconocer 4-8 nucleótidos • Forman parte de maquinaria bacteriana con la que se d efienden de infecciones virales • NO afectan al DNA bacteriano por diferencias en metilación (entre ADN bacteria y viral) • permiten disecar el DNA de un genoma en fragmentos Nomenclatura • 3 letras cursiva bacteria (género y especie) • Cepa • Numero de endonucleasa de la especie • Eco RI • realizan cortes escalonados karp 765 • Hind II
• Tipo II • Ingeniería genética
• Requieren cofactor Mg2+ • Reconocen palíndromos Vectores de clonación (plásmidos) y su uso • Plásmidos: moléculas circulares de DNA que aparecen en forma natural en bacterias y que actúan en cromosomas accesorios DNA ligasa • Sella uniones • Une entre sí mediante formación de puentes de hidrógeno al DNA humano y el plásmido cuando son incubados juntos (karp 766) La clonación de ADN, o clonación molecular • es la introducción de un fragmento de ADN denominado inserto Dentro de una molécula de ADN denominada vector, que puede replicarse de manera autónoma e independiente del genoma de la célula hospedera Vector • Molécula de ADN de doble cadena con capacidad de albergar un fragmento de ADN exógeno Clasificación de vectores por uso • Clonación • Almacenamiento de secuencias y la obtención de grandes cantidades del ADN recombinante. • Los vectores de clonación suelen ser plásmidos, fagos, fagémidos, cósmidos y cromosomas artificiales bacterianos o de levadura. • Vectores de expresión • producir un transcrito (ARN) o la proteína producto de ese transcrito (proteínas recombinantes). • Los vectores de expresión pueden ser plásmidos o fagos Ej. PCADN3.1 PET161 PDESt10
Vectores de expresión componentes • Origen de replicación --- ORI • Marcas de selección – característicos de estos vectores para identificar en que células se introdujo insero. Resistencia antibiótica (ampicilina y kanamicina) • Sitio de clonación múltiple • Promotor fuerte • Secuencias de terminación de la transcripción y de poliadenilacion • Sitio de unión al ribosoma (IRES), que es la secuencia Shine-Dalgarno que precede el codón de inicio AUG de la traducción en los ARNm procariotas.
• Dicha secuencia es complementaria con el extremo 3’ del ARNr 16S, cuya hibridación permite el ensamblaje de la maquinaria de inicio de la traducción. Vector de expresión • Fácil transferencia a otros • Numero de copias del plásmido = expresión basal del plásmido • Determinada por la fuerza de sitio de origen de replicación, que origina plásmidos con un elevado número de copias • Promotores fuertes en plásmidos con alto número de copias origina interferencias en la viabilidad celular Vectores de clonación Salazar 127 • Su finalidad es el almacenamiento de secuencias y la obtención de grandes cantidades del AND insertado Vectores de expresión • Su propósito es producir un transcrito RNA o proteína Clonación karp 766 • Técnica que produce grandes cantidades de un segmento de DNA especifico Transducción • Introducción de un vector viral a una célula eucariota Bacteriófago lambda Salazar 129 • Es el fago más utilizado como vector de clonación cuyos extremos se denominan sitios COS ORI Salazar 128 • Secuencia de DNA del vector que provee un sitio único de reconocimiento a las proteínas que identifican el sitio de inicio de replicación MANERA GENERAL EN QUE CONSISTE EL PROCEDIMIENTO BÁSICO DE LA METODOLOGÍA DE CLONACIÓN Y SU UTILIDAD MÉDICA • A. analiza el uso de enzimas de restricción cap 13
• Tipos de corte producido por enzimas de restricción
Familias de enzimas de restricción
Factores que afectan la actividad de enzimas de restricción • Pureza DNA (+pureza mayor calidad) • Contaminantes (detergentes y estabilizadores) • Cambios de pH y temperatura • El grado de metilación Almacenamiento de enzimas de restricción • -20°C y diluidas en glicerol (evita congelar) Mapa de restricción • Indica la posición de sitios de corte • Listado en orden alfabético • Tipo de corte • Número y tamaño de cada fragmento Cantidad de enzima adecuada para un ensayo • En base a la concentración de ADN • Tiempo de incubación • Caducidad PAPEL DE LA LIGASA DEL DNA EN LA UNIÓN DE FRAGMENTOS DE DNA A VECTORES DE EXPRESIÓN • Ligación – formación de enlaces fosfodiester entre fosfato 5´e hidroxilo 3´
• Las más utilizadas son la ligasa E. coli y la T4 ligasa de bacteriófagos • Se considera tipo de extremos generados
PROCESOS DE TRANSFECCIÓN Y TRANSFORMACIÓN DE LA CELULA HOSPEDORA • Transfección • Introducción de un vector a una célula eucariota • Introducción de material genético en células empleando agentes químicos o físico • Transducción • Si el vector es un virus • Introducción de ácido nucleico en una célula por medio de un vector viral • Transformación • Introducción de DNA recombinante para su replicación (a través de vectores a bacterias), transcripción y traducción empleando maquinaria de célula huésped • Influye la longitud del vector • Transformación química • Cloruro de calcio aumenta incorporación de DNA del fago lamda a células bacteriana • Otros como rubidio y el manganeso • Transformación por electroporacion • (Transformación más eficiente en resistencia) • Aplicación de pulsos eléctricos de alto voltaje a células receptoras --- forma poros de membranas plasmáticas/pared celular --- entra vector Producción de las proteínas recombinantes (producción de insulina) Karp cap 18 749 • El DNA se extrae de células humanas, se fragmenta con EcoR1 • Los fragmentos se insertan en plásmidos bacterianos • Enzima --- abre • Ligasa – cierra • Selecciona con antibióticos • Escoge cual gen de insulina Selección de plásmidos específicos stryer 149 • El resultado buscado mediante la desactivación insercional en plásmidos • Inactivación de un gen para la resistencia a un antibiótico en plásmidos • Antibióticos resistencia a antibióticos
