UNIVERSIDAD CENTRAL DE VENEZUELA FACULTAD DE CUIENCIAS VETERINARIAS DEPARTAMENTO DEPARTAMENTO DE PATOLOGIA VETERINARIA CATEDRA DE MICROBIOLOGIA E INMUNOLOGIA
PRACTICA: MUESTRAS DE LECHE L ECHE Y AGUA Determinación del Numero más Probable de Coliformes Totales, Coliformes Fecales y Escherichia coli Recuento de Aerobios Mesófilos
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OBJETIVOS: 1.
Esta Esta prácti práctica ca conte contempl mpla a los método métodos s de ensayo ensayo para para la determ determina inació ción n del Númer Número o Más Proba Probable ble (NMP) (NMP) de bacter bacterias ias colif colifor ormes mes,, y de colif coliform ormes es fecale fecales s en muestras de leche y muestras de agua potable, mediante la utilización de medios líquidos. 2. Igualm Igualment ente e cont contemp empla la el el méto método do a emple emplear ar para para la determ determina inació ción n cuan cuantit titati ativa va de microorganismos aerobios en alimentos, mediante la utilización de placas de petri y un medio de cultivo apropiado.
DETERMINACIÓN DEL NUMERO MÁS PROBABLE DE COLIFORMES TOTALES, DE COLIFORMES FECALES Y Escherichia coli EN MUESTRAS DE LECHE NORMAS COVENIN A CONSULTAR: COVENIN 1126-89 Alimentos. Codificación y preparación de muestras para el análisis microbiológico
PRINCIPIO DEL ENSAYO El método consiste en colocar determinadas cantidades de muestra y/o sus diluciones, en cada uno de 3 ó 5 tubos de ensayo con tubos de fermentación inco incorp rpor orad ados os y un medi medio o de cult cultiv ivo o apro apropi piad ado. o. Desp Despué ués s del del perí períod odo o de incubación a la temperatura correspondiente, se toma nota de los tubos que presentan formación de gas y se confirman en un medio de cultivo apropiado.
PROCEDIMIENTO DETERMINACIÓN DEL NÚMERO MÁS PROBABLE (NMP) DE COLIFORMES TOTALES Para la realización de este ensayo utilizaremos el siguiente método:
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Se inocula cada uno de 3 o 5 tubos de ensayo (que contengan caldo lauril sulfato triptosa triptosa con tubo de Durhan) con 1 ml de la muestra y/o diluciones diluciones de la misma. Se incuban a 35ºC - 37ºC por 24 a 48 horas. De cada tubo tubo que presente gas gas (+) se transfiere un asa del cultivo cultivo a tubos que contengan caldo lactosa bilis verde brillante al 2 % con tubo de Durham, o se repica por estrías a placas que contengan agar Levine (EMB) o agar Endo. Se incuba de 35 a 37ºC por 24 a 48 h y se observa la producción de gas o la formación de colonias negras o púrpura oscuro, colonias mucoides, rosadas con centro oscuro en el agar Levine (EMB), o colonias rojas rodeadas de halos rojos en el agar Endo. La formación de gas en los tubos de caldo LBVB o la formación de colonias características en las placas como se describió anteriormente, confirma la presencia de organismos coliformes. Los Los tubo tubos s posi positi tivo vo de cald caldo o laur lauril il sulf sulfat ato o trip tripto tosa sa (CLS (CLST) T) que que fuer fueron on confirmados como coliformes en caldo LBVB o en placas de agar Endo o Levine, se anotan como positivos y los resultados se llevan a la tabla del NMP que corresponda. (ver anexo)
DETERMINACIÓN DEL NMP DE COLIFORMES FECALES Para la realización de este ensayo, se utilizará el siguiente método:
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A partir de los tubos de gas (+) en caldo Mac Conkey ó Caldo Lactosa Bilis Verd Verde e Bril Brilla lant nte e (CLB (CLBVB VB)) tubo tubo de Durh Durham am,, se inoc inocul ulan an con con una una asa, asa, respectivamente: a.- Un tubo que contenga caldo lactosa bilis verde brillante al 2 % con tubo Durham. b.- Un tubo que contenga agua peptonada o caldo triptonado. Se incuban en baño de maría 44,5ºC ±0.1 º C por 24 a 48 horas. Se observ observa a si hay forma formació ción n de gas gas en los tubos tubos de caldo caldo LBVB LBVB y se investiga la formación formación de indol, añadiendo 0.2 a 0.3 ml de reactivo de Kovacs al cultivo en agua peptonada o caldo triptonado al cabo de 24 h; el resultado es positivo si se observa coloración roja en la capa alcohólica. Se consideran positivos los cultivos que den gas e indol. Estos resultadoss (tubos positivos) se llevan a la tabla del NMP que corresponde (ver anexo).
EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS Los resultados del NMP de Coliformes Totales y de coliformes fecales, se expresan por mililitro o por gramo gramo según la muestra haya haya sido medida o pesada. Para la expresión de los resultados, se deben tomar en cuenta las siguientes consideraciones:
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Si no se emplean volúmenes correspondientes a aquellos expresados en la tabla (0.1; 0.01 y 0.001 ml) el resultado se debe multiplicar por la dilución intermedia y dividirse por 100:
NMP/g o ml: Nº obtenido en la tabla X Dilución intermedia 100
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Cuando se emplean más de 3 series de la muestra y/o diluciones diferentes de la misma, los resultados que se llevan a la tabla del NMP son los correspondientes a 3 series consecutivas; tomando como primera aquella que presente todos los tubos positivos. positivos.
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Cuando ninguna de las series presente ésta condición, se tomará aquella cuya dilución intermedia muestre tubos positivos. En caso de que todos los tubos sean positivos, se tomarán en cuenta las series de diluciones más altas de la muestra; expresándose el resultado como estimado del NMP, "más de" el número de la tabla, multiplicado por la dilución intermedia.
TABLA Nº 1 Número Más Probable (NMP) por 1 g de muestra y 95% de límites de confianza 0,1 0 0 0 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3
Usando tres tubos con porciones de 0,1; 0,01 y 0,01 g Número de tubos positivos NMP NMP límite 0,01 0,001 /g ó /ml Más bajo Más alto 0 0 <3 0 1 3 0.5 9 1 0 3 <0.5 13 0 0 4 <0.5 20 0 1 7 1 21 1 0 7 1 23 1 1 11 3 36 2 0 11 3 36 0 0 9 1 36 0 1 14 3 37 1 0 15 3 44 1 1 20 7 89 2 0 21 4 47 2 1 28 10 150 0 0 23 4 120 0 1 39 7 130 0 2 64 15 380 1 0 43 7 210 1 1 75 14 230 1 2 120 30 380 2 0 93 15 380 2 1 150 30 440 2 2 210 35 470 3 0 240 36 1.300 3 1 460 71 2.400 3 2 1.100 150 4.800 3 3 >2.400
DETERMINACIÓN DEL NUMERO MÁS PROBABLE DE COLIFORMES TOTALES, DE COLIFORMES FECALES EN MUESTRAS DE AGUA POTABLE NORMAS COVENIN A CONSULTAR COVENIN 1126-89 Alimentos. Identificación y preparación de muestras para el análisis microbiológico COVENIN 2614-89 Agua Potable. Toma de muestras
OBJETO Y CAMPO DE APLICACIÓN Esta Norma Venezolana contempla el método de ensayo de rutina para la determinación determinación del número más probable de bacterias coniformes en agua potable.
PRINCIPIO DEL ENSAYO El método consiste en inocular volúmenes conocidos de una muestra de agua potable en c/u de 5 ó 10 tubos de ensayo, con un medio de cultivo no selectivo, doble concentrado, y con tubos de fermentación incorporados. Después del período de incubación se observan los tubos que presentan formación de gas y/o turbidez, se confirman en un medio de cultivo selectivo, selectivo, y se obtiene el NMP de bacterias coniformes, utilizando las tablas diseñadas para tal fin.
PROCEDIMIENTO PRUEBA PRESUNTIVA a.- Se inoculan volúmenes de 10 ml de muestra en cada uno de 5 tubos que contengan caldo lauril sulfato triptosa doble concentrado con tubo de fermentación invertido. Se mezcla suavemente. Nota: Si se requiere mayor precisión en el método, se inoculan 10 tubos b.- Se incuban a 35 +/- 0,5ºC. Después Después de 24 +/- 2 h, agite suavemente cada tubo y observe la aparición de gas y turbidez, si ambas son negativas se reincuban por 24 +/- 2 h adicionales. c.- Se consideran como tubos positivos en la prueba presuntiva aquellos que presenten cualquier cantidad de gas en el tubo Durham y/o turbidez en el medio de cultivo, después de 24 a 48 horas de incubación.
PRUEBA CONFIRMATIVA a.-. Se agita suavemente cada uno de los tubos positivos de la prueba anterior, y se transfiere una asada del cultivo a tubos que contengan caldo lactosa bilis verde brillante (2%), con tubo de fermentación invertido. b.- Se incuba a 35 +/- 0,5ºC durante 48 horas.
c.- Finalizado el periodo de incubación se consideran como tubos positivos en la prueba confirmatoria aquellos donde se observa la aparición de gas. d.- Se cuenta el número de tubos positivos obtenidos y el resultado se lleva a las tablas de número más probable que corresponda (ver tabla anexa)
EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS El resultado se expresa como número más probable de bacterias coliformes por 100 ml de muestra. En caso de que todos los tubos sean negativos, el resultado se expresa como “menos de 2,2 o menos de 1,1” según se hayan inoculado 5 ó 10 tubos respectivamente. En caso de que todos los tubos sean positivos, el resultado se expresa como “más de 16 o más de 23” según se hayan inoculado 5 ó 10 tubos respectivamente. Tabla 2
Indices de NMP y límites de confianza de 95% para varias combinaciones de resultados positivos y negativos, cuando se utilizan tubos inoculados con 10 ml de muestra de agua potable Nº de tubos positivos 0 1 2 3 4 5
Indice NMP/100 ml ≤ 2,2 2,2 5,1 9,2 16 ≥ 16
Limite de confianza de 95% Inferior Superior 0 6 0,1 12,6 0,5 19,2 1,6 29,4 3,3 52,9 8 infinito
Tabla 3
Indices de NMP y límites de confianza de 95% para varias combinaciones de resultados positivos y negativos, cuando se utilizan 10 tubos inoculados con 10 ml de muestra de agua potable Nº de tubos positivos 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Indice NMP/100 ml ≤ 1,1 1,1 2,2 3,6 5,1 6,9 9,2 12 16,1 23 ≥ 23
Limite de confianza de 95% Inferior Superior 0 3 0,13 5,9 0,36 8,1 0,69 10,6 1,3 13,4 2,1 16,8 3,1 21,1 4,3 27,1 5,9 36,8 8,1 59,5 13,5 Infinito
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RECUENTO DE MICROORGANISMOS AEROBIOS MESOFILOS EN PLACAS DE PETRI (Norma COVENIN 902-87) PRINCIPIO DE ENSAYO. El métod método o cons consis iste te en mezc mezcla larr un volu volum men dado dado de una una mues muestr tra a representativa y homogénea del alimento a examinar o de diluciones de la misma con un medio de cultivo cultivo en placas de Petri. Petri. Después del del período de incubación, incubación, se determina el número de unidades formadoras de colonias (ufc) de las bacterias mediante un contador de colonias.
PROCEDIMIENTO 1.- El material material a ensayar ensayar consiste consiste en una muestra muestra representat representativa iva del alimento alimento y dicha muestra deberá codificarse y prepararse según la norma COVENIN 1126. (ver anexo) 2.- Previo al análisis, análisis, las muestras deben mantenerse mantenerse en condiciones condiciones apropiadas. apropiadas. Todo el análisis debe realizarse en condiciones de asepsia. A partir de la primera dilución dilución obtenida obtenida se preparará prepararán n las dilucion diluciones es necesari necesarias as utilizan utilizando do el diluente diluente apropiado. 3.- Se coloca 1 ml de la muestra original ó 1 ml de las diluciones respectivas según sea el caso, en placas de Petri por duplicado 4.- Se añade a cada placa de 12 a 15 ml del del medio de cultivo cultivo previamente previamente fundido fundido y temperado a 45ºC - 50ºC. Se mezcla convenientemente y se deja solidificar por 8 a 10 min. Sobre una superficie superficie plana. No deben transcurrir transcurrir más de 20 min. Desde Desde el momento de la preparación de la dilución hasta el agregado del agar. 5.- Se invierten las placas y se incuba bajo las condiciones siguientes: 1 Tipo de Microorganismo Psicotróficos Mesófilos Termófilos
Temperatura 7ºC +/- 1ºC 32ºC +/- 1ºC 55ºC +/- 1ºC
Tiempo 10 días 48h +/- 3h 48h
6.Finalizad Finalizado o el períod período o de incuba incubación ción,, se selecc selecciona ionan n preferen preferenteme temente nte las las placa placas s donde donde aparez aparezca can n entre entre 30 y 300 colonias colonias.. Con Con la ayuda ayuda de un cuenta cuenta colonias o en su defecto, una lente de aumento, se cuentan todas las colonias, incluyendo las que se observan como pequeños puntos, y se anota la dilución correspondiente. Evite contar como colonias, partículas de muestras o pequeñas burbujas.
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NOTA: Debe mantenerse la humedad necesaria dentro de la estufa para prevenir la deshidratación del agar (Las placas con el agar no deben perder más del 15% de su peso original)
7.- Si las placas placas de todas todas las diluciones diluciones tiene más más de 300 colonias, colonias, se seleccionan seleccionan aquellas que tengan el valor más cercano a 300. 8.Si las las placas placas de toda todas s las diluci dilucione ones s tienen tienen menos menos de 300 300 coloni colonias, as, se seleccionan aquellas que tengan el valor más cercano a 30. 9.- El número número de colonias colonias promedio promedio de las las dos placas de una misma misma dilución dilución se multiplica por la dilución correspondiente y este será el resultado final. 10.- Si placas placas de dos diluciones diluciones decimales decimales consecutivas consecutivas presentan presentan entre 30 y 300 colonias, se multiplica cada recuento por la dilución correspondiente, se establece el promedio y éste será el resultado resultado final. Si el recuento más alto es superior superior a dos veces el más bajo, se descarta y se toma como resultado el valor más bajo.
EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS. Los resultados se expresan como recuento estándar por mililitro (ml) o gramo (g) de muestra. El núme número ro de colo coloni nias as obte obteni nido do segú según n 7 y 8, se mult multip ipli lica ca por por la dilu diluci ción ón correspondiente correspondiente y se expresa como "Estimado del recuento estándar". Si no hay colonias en ninguna placa, el recuento se reporta como "menos de 1" multiplicado por la primera dilución de la muestra, y se expresa como "Estimado del recuento estándar".
ANEXO 1 Ejemplo de determinación del Número Más Probable (NMP) 1.- Si seleccionamos tres diluciones de la muestra: 1/100, 1/1.000, 1/1.000, 1/10.000 y el número de tubos tubos positivos para cada cada dilución es de 3, 1 y 0 respectivamente, cuando llevamos este número a la tabla del NMP, a 3, 1 y 0 corresponde corresponde un NMP de 43 coliformes. Multiplicando Multiplicando por la dilución intermedia intermedia (1/1000) y dividiendo 100 se obtiene un valor de 430 coliformes/ml o por g según la muestra se haya pesado o medido. 2.- Si las diluciones preparadas son: 1/10, 1/100, 1/.1000, 1/10.000 y el número de tubos positivos para cada dilución es de 3, 3, 3, 3 respec respectiv tivam ament ente, e, se escoge escogen n los valores valores corre correspo spondi ndient entes es a las las tres tres diluciones más altas (1/100, 1/1.000, 1/10.000) y el número que se lleva a la tabla del NMP será 3,3,3. A ese valor corresponde un estimado del NMP de “más de” 2.400, multiplicado multiplicado por la dilución intermedia (1/1000) y dividido por 100 2.400 x 10 3 coliformes/ml coliformes/ml ó g más de = -------------------------------------------------------- = 100 más de 24.000 coliformes/ml ó g 3.- Cuando se emplean series de 5 tubos, se procede en la misma forma, pero utilizamos la tabla del NMP correspondiente.
ANEXO 2 Norma COVENIN, 1126-89 ALIMENTOS. IDENTIFICACIÓN Y PREPARACIÓN DE MUESTRAS PARA EL ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO PREPARACION DE LA MUESTRA CONDICIONES GENERALES 1.1.- El siti sitio o dond donde e se real realiz izará ará el anál anális isis is micr microb obio ioló lógi gico co debe deberá rá reun reunir ir las las condiciones de asépsia indispensables. indispensables. El material y equipo a utilizar utilizar deben estar convenientemente convenientemente preparados. Identificados y listos para su uso. 2.- Cuando se abra el recipiente con la muestra debe evitarse cualquier tipo de contaminación.
NOTA: Si no se dispone de cabinas especiales, deben abrirse primero los productos que se supone tienen menor carga microbiana (pasteurizados, (pasteurizados, precocidos) y por último los crudos o desecados. Esto es con la finalidad de prevenir la contaminación del área de trabajo y así evitar contaminaciones cruzadas. cruzadas.
3.- Las latas, latas, jarras jarras y otros otros recipi recipient entes es cerrad cerrados os deberá deberán n lavars lavarse e y secars secarse; e; desi desinf nfec ecta tarr el área área de prep prepar arac ació ión n de la mues muestr tra a medi median ante te algú algún n agen agente te adecuado tal como el alcohol de 70º. El cual se elimina a la llama (flameado). No se debe flamear aquellos envases o empaques que puedan dañarse o explotar. caso de que que se requie requieran ran condic condicion iones es de asepsi asepsia a más más estri estricta ctas s NOTA: En caso (prueba (prueba del deterioro deterioro microbio microbiológi lógico) co) deben deben utilizar utilizarse se además además otros desinfec desinfectant tantes, es, tales tales como como el alcoh alcohol ol yodado yodado (2% (2% de yodo) yodo) y compu compuest estos os deriva derivado dos s de amoni amonio o cuater cuaternar nario. io. Deben Deben utiliz utilizars arse e cabin cabinas as espec especial iales es (flujo (flujo lamina laminar). r). Si no se dispon dispone e deberán utilizarse áreas desinfectadas desinfectadas y protegidas de las corrientes de aire.
4.- Cuando el producto este envuelto en cartón, papel celofán, papel aluminio o cualquier otro material de empaque similar, éste deberá limpiarse con una tela o esponja humedecida con un agente desinfectante (alcohol de 70º) para eliminar la contaminación superficial superficial y el polvo. Debe darse una atención atención especial al área de abertura del empaque o envase. 5.- Debe tomarse una muestra representativa del alimento.
TRATAMIENTO DE LA MUESTRA SEGÚN SU ESTADO FÍSICO 1.- Si se trata de alimentos líquidos o material que fluya libremente, envasados en recipientes pequeños, debe agitarse por 25 veces haciendo un ángulo de 45º con el vaso o por rotación del recipiente hasta que el contenido sea homogéneo. En el caso de que los recipientes sean grandes y de difícil manejo, se deben tomar muestras representativas y trasvasarlas asépticamente a envases estériles más pequeños. 2.- Si la muestra está congelada, se deja descongelar en su recipiente original (o en el cual se recibió en el laboratorio), por un período de 15 minutos a 45ºC en baño de agua mezclando continuamente o 18 horas entre 2 y 5ºC. Si la muestra congelada puede trabajarse fácilmente (ejm: un helado) se procede sin descongelar. 3.- Si el materi material al es sólido sólido deben deben tomars tomarse e porci porcione ones s de difere diferente ntes s sitio sitios s del producto para tener una u na muestra representativa. 4.- Cuando se tenga un material de difícil manejo debe colocarse en un recipiente grande y estéril, romperse en pequeños trozos, usando métodos adecuados bajo condiciones asépticas y de allí se toma una muestra, la cual se transfiere a un recipiente estéril. 5.5.- Si el cont ontenido nido del del env envase ase es het heterog erogén éne eo, se prep prepar ara a una una mezc ezcla homogénea de todo su contenido o se analizan porciones separadas del mismo dependiendo del propósito del ensayo. NOTA: En caso de alimentos que presenten una cubierta natural (huevos, ostras, etc), la modificación en la preparación de la muestra se especificará en la norma particular.
HOMOGENEIZACIÓN Y PREPARACIÓN DE LAS DILUCIONES MUESTRA SÓLIDA 1.- Se pesan 10, 25 o 50 grs ± 0.1 de la muestra en una jarra, frasco apropiado o en bolsas de polietileno estériles, previamente tarados. tarados. 2.- Se añaden 90, 225 o 450 ml de diluente respectivamente (solución tampom fosfato o agua peptonada al 0.1 %)
3.- Se homogeneiza por no más de 2 minutos a 8.000 rpm. Debe esperarse 2 a 3 minutos hasta que desaparezca desaparezca la espuma formada. formada. En el caso caso de emplearse un homogeneizador mecánico (Stomacher) (Stomacher) se agita la muestra por un tiempo tiempo de 60 segundos.
NOTA 1: En el caso de alimentos sólidos cuya flora microbiana está limitada ala superficie (maní, nueces, almendras, pasas, aceitunas sin deshuesar u otros) se pesan 50 grs y se añaden 50 ml del diluente se agita vigorosamente 50 veces en un ángulo de 45 º. Cada ml de la solución de enjuague será equivalente a un gr de muestra.
NOTA 2: Cuando se analicen alimentos con alto contenido de grasa (mayor de 20%) o polvo que formen grumos, pueden añadirse al diluente, agentes humectantes tales como el tergitol tergitol 7 anionico (1% p/v) para facilitar facilitar la emulcificación emulcificación (ejemplo: (ejemplo: quesos, cremas de leche, mantequilla, chorizo, albúmina)
NOTA 3: Se recomienda tomar siempre que sea posible la mayor cantidad de muestra (50 gr) a fin de obtener obtener resultados resultados más confiables. confiables.
MUESTRAS LÍQUIDAS 1.- Se miden con una pipeta 10 u 11 ml de la muestra y se transfieren a un frasco de dilu diluci ción ón que que cont conten enga gan n 90 o 99 ml de dilu diluen entte (buf (bufffer fosf fosfat ato o o agua agua peptonada). En el caso de muestras muy viscosas (Ej.: chicha, jarabes, leche condensada, yogurt, crema de leche, pulpas de frutas), estas deben pesarse. En el caso de muestras liquidas con elevada cantidad de gas (refrescos, malta, agua mineral gasificada) , deben trasvasarse a un recipiente estéril y agitar con rotación durante 15 a 30 minutos hasta que liberen el gas. 2.- La muestra se agita luego 25 veces, bien sea por un movimiento del brazo en un ángulo de 45 grados o por rotación del recipiente en diferentes sentidos.
NOTA: La homogeneización de la muestra, bien sea sólida o líquida en la forma antes descrita, corresponde corresponde a la primera dilución (10 -1)
3.- A partir de la primera dilución obtenida en el punto 1 y 2 se procede de inmediato a preparar las diluciones necesarias de la siguiente forma: a - Se mide mide 1 ml de la dilución dilución 10 10-1 y se transfier transfiere ea un tubo que contenga 9 ml de diluente o 10 u 11 ml de la dilución 10 -1 y se transfiere a un frasco de dil dilución que conte ntenga 90 o 99 ml -2 respectivamente de diluente para obtener 10 . Se agita el frasco o tubo utilizado 25 veces, bien sea con un movimiento del brazo en un ángulo de 45 º o por rotación del recipiente en diferentes sentidos.
b.- Se repite este procedimiento a fín de obtener las otras diluciones necesarias necesarias para el anális análisis is 10-3, 10-4, etc, o aquellas que según la experiencia necesite el alimento o microorganísmo objeto de análisis.
NOTA: La inoculación del medio se debe llevar a cabo dentro de los 20 minutos siguientes siguientes a la preparación de las diluciones. diluciones.
