Practica Aerobios Mesofilos en Agar

RECUENTO DE AEROBIOS MESÓFILOS

CODIGO: MMAM-06 REVISION: 5 FECHA: 2009-07-08 PÁGINA: 1 de 7 ELABORADO POR: D. Hualpa S.

Centro de Transferencia Transferenc ia de Tecnología e Investigación Agroindustrial LABORATORIO LABORATORIO CETTIA – UTPL

APROBADO POR: M. Jácome

UNIVERSIDAD TÉCNICA PARTICULAR DE LOJA ESCUELA DE BIOQUÍMICA Y FARMACIA LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS

PRACTICA: Determinación de aerobios mesófilos por agar. OBJETIVO: Cuantificar y reconocer las colonias de microorganismos aerobios mesófilos en agar plate count.

1. ALCANCE Se aplica a la enumeración de Aerobios mesófilos en alimentos. El método es apropiado para la determinación de Aerobios mesófilos en alimentos.

2.- DESCRIPCIÓN DEL DEL TIPO DE ITEM La muestra es alimentos en general, excepto productos fermentados.

3. PRINCIPIO Las bacterias aerobias mesófilas son todas las bacterias capaces de desarrollarse en un medio nutritivo incubado en condiciones de aerobiosis. Las bacterias mesófilas tienen varios usos como indicadores:



 

Determinan la posible presencia de bacterias patógenas. La mayoría de bacterias patógenas son mesófilas y por tanto un recuento elevado de bacteriuas mesófilas aerobias indica que existieron condiciones que favorecieron el que ciertos microorganismos patógenos proliferaran considerablemente encontrándose en el alimento en gran número. Indican la calidad sanitaria de un alimento natural o procesado, ya que éstos productos deben satisfacer ciertas especificaciones microbiológicas (Normas de Calidad). Estiman la duración de la vida de anaquel de un producto, ya que generalmente existe una relación directa entre el grado de descomposición y el contenido microbiano (excepto en productos fermentados o madurados.



Centro de Transferencia de Tecnología e Investigación Agroindustrial LABORATORIO CETTIA – UTPL


4. PARÁMETRO Y RANGO >1 ufc/g

5. CONDICIONES AMBIENTALES REQUERIDAS Y PERÍODO DE ESTABILIZACIÓN QUE SEA NECESARIO. Las condiciones ambientales en las que normalmente se trabaja son: Temperatura: 18 – 24 ºC Humedad Relativa: 45 – 65 %

6.- MEDIDAS DE SEGURIDAD En el laboratorio de microbiología se debe considerar lo siguiente: -

Ingresar al laboratorio con mandil limpio y desinfectarse los zapatos con una solución de alcohol al 70%. Trabajar con guantes, gorro, mascarilla Incinerar, agujas, azas de platino 5 veces después de haber terminado el trabajo de siembra. Lavarse las manos periódicamente con jabón antibacterial y secarse con toallas desechables. Ubicar correctamente las secciones donde se encuentra el material contaminado del material estéril. No ingresar con alimentos. No hablar mientras se realiza la siembra. Las pipetas que han sido utilizadas después de la siembra se las debe sumergir en agua con cloro. Al usar la Cepa de Referencia ATCC 6538, para la recuperación de los microorganismos tener cuidado en trabajar en la cámara de seguridad biológica, para evitar contaminarse.

7. APARATOS Y EQUIPOS: -

1 Erlenmeyer de 500 ml 3 Erlenmeyer de 250 o 125 ml 3 pipetas de 10 ml 3 pipetas de 1 ml Un mechero Un trípode Una malla de amianto 7 cajas Petri



APROBADO POR:


-

M. Jácome

Fósforos Contador de colonias Incubadora a 35 ºC. Cámara de seguridad Biológica 2B2

8. REACTIVOS, PATRONES DE REFERENCIA Y MATERIALES DE REFERENCIA

REACTIVO

CODIGO DE LABORATORIO ESPECIFICACIONES

Agar Plate count Peptona de caseína Cepa de referencia de S. aureus LSRC-6538

Certificado de lote de fabricación

Cepa pura bacteriana con certificado

9. DESCRIPCIÓN DEL PROCEDIMIENTO 9.1 MARCAS DE IDENTIFICACIÓN Las muestras para la determinación de Aerobios Mesófilos deben identificarse con mismo código asignado.

un

9.2 TRANSPORTE DE LOS ITEMS DE ENSAYO Las muestras deben transportarse en una bandeja adecuada para el efecto para evitar derrames o daños en las mismas.

9.6 VERIFICACIONES PREVIAS Se debe verificar lo siguiente:  Revisar los termómetros en la etiqueta que se encuentren dentro de la fecha de calibración.  Revisar que los medios de cultivo no estén expirados.





9.7 VERIFICACIÓN DE EQUIPOS, FUNCIONAMIENTO Y CALIBRACIÓN. Se realiza una verificación de todos los registros:

  

La temperatura de la incubadora (35 +/- 1 ºC) La cámara de seguridad Biológica flujo de aire se encuentre dentro de límites según instructivo I.5.6.2.31. Si se va a trabajar con mechero se debe revisar las conexiones de gas

9.9 METODOLOGÍA 9.9.1

SIEMBRA

-

Pesar asépticamente 10 gramos de muestra en 90 ml de agua peptonada para obtener la -1 dilución 10 luego seguir preparando las siguientes diluciones de acuerdo al tipo de alimento. -2 De esta solución tomar 10 ml y poner en 90 ml de agua peptonada esta será la dilución 10 , de la misma manera tomar 10 ml de esta solución y poner en 90 ml de agua peptonada esta será -3 la dilución 10 . Con una pipeta perpendicular a la caja Petri poner 1 ml de cada una de las diluciones. Poner aproximadamente 15 a 20 ml de agar plate count frío y templado a 45 grados centígrados, agitar suavemente 3 veces a la izquierda, 3 a la derecha una arriba y otra abajo sin levantar la caja de la mesa. Dejar solidificar. Poner las placas en la incubadora a 35 grados centígrados por 48 horas. Realizar el conteo de las colonias de aerobios mesófilos. Realizar el conteo entre 25-250 colonias.

9.9.2 INTERPRETACION Y RESULTADOS Para diferenciar las colonias de aerobios mesófilos en el agar plate count, busque algunas de las siguientes características típicas del cultivo: colonias de color crema. Para calcular el contaje de aerobios mesófilos, multiplicar el número total de colonias de aerobios mesófilos por placa por el respectivo factor de dilución. Cuando se hace el contaje en placas por duplicado en diluciones consecutivas, calcule el número promedio de colonias de cada dilución antes de determinar el contaje total de aerobios mesófilos. Se puede hacer contajes estimados en placas con más de 250 colonias y puede ser reportado como contaje estimado. Al realizar dichos contajes determinar el contaje promedio / 1 cm 2 y multiplicar por 30 (área de crecimiento circular de 30 cm2).





9.10 FIGURAS EXPLICATIVAS

A continuación podemos observar las colonias de aerobios mesófilos.



APROBADO POR:


M. Jácome

9.11 DIAGRAMA DE PUNTOS CRÍTICOS

PESAJE DE LA MUESTRA

PREPARACIÓN MUESTRA

DE

PREPARACIÓN DE DILUCIONES

INCUBACIÓN

LA

Verificar el estado de calibración de la balanza Encerar con la cabina cerrada Verificar el nivel de la balanza La muestra debe ser completamente homogénea. Pesar la muestra realizando un cuarteo imaginario tomando 2.5 g de cada parte. Triturar en una funda estéril si es sólida. Homogenizar completamente con el agua de dilución

Agitar en ángulo de 90º , 30 veces en 30 segundos Si son muestras sólidas dejar reposar por un minuto y tomar la alícuota de la superficie.

La incubación debe realizarse en incubadora calibrada con patrón.

9.12 ELIMINACIÓN DE RESIDUOS Los residuos se eliminan en el autoclave de desechos 15 minutos a 15 PSI, poniendo la cinta de esterilización para comprobar la temperatura y presión. Una vez destruidos se los puede desechar en la basura común.





10. FÓRMULA DE CÁLCULO Para realizar el recuento de Aerobios mesófilos se utiliza la siguiente fórmula:

Recuento de aerobios mesófilos = número de colonias contadas por el inverso de la dilución.

11. CRITERIOS DE ACEPTACIÓN Y RECHAZO  

Los criterios de aceptación y rechazo para los duplicados es de ± 5%. Los blancos de medios de cultivo, aguas de dilución deben ser igual a cero, de lo contrario repetir el ensayo.

13. EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS Los resultados se expresan en ufc/g o ml de alimento y en forma exponencial.

14. INCERTIDUMBRE. El valor de la incertidumbre calcula del método es: (<50, 14%) y (>50, 5%)

15. BIBLIOGRAFIA AOAC 990.12

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