PRÁCTICA # 1 “CUANTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS POR TURBIDIMETRÍA” OBJETIVO:
Explicar el fundamento de las técnicas más utilizadas en el recuento microbiano. Establecer la cantidad de microorganismos en na muestra mediante la aplicación de diferentes métodos. Relacionar los resultados obtenidos y explicar las causas que determinan la variación de estos.
INTRODUCCIÓN Para trabajar con un microorganismo en condiciones definidas en el laboratorio es necesario primero proceder a su aislamiento, es decir a separarlo del resto de las poblaciones con las que coexiste en la naturaleza. Para el aislamiento se de organismos utilizan medios sólidos (agar. Ventajas) o líquidos. · Medios sólidos: siembra (extensión o vertido) en placa. Separación e inmovilización de organismos de forma individualizada en un medio nutritivo sólido. Cada individuo al multiplicarse origina una colonia. Método: diluciones consecutivas de la muestra. · Medios líquidos: Solo utilizable para aislar la especie predominante en un cultivo mixto. Método de la dilución límite. · Medios selectivos: Medios que favorecen el crecimiento de un microorganismo específico. Se emplean cuando el organismo que quiere aislarse se encuentra en forma minoritaria. Pueden utilizarse para: - Enriquecer: medios líquidos que tienden a seleccionar los organismos de tasa de crecimiento más elevada entre todos aquellos que pueden hacerlo bajo las condiciones impuestas - Aislar directamente: medios sólidos que permiten aislar colonias. Suelen llevar un inhibidor que impide el desarrollo de los demás microorganismos. Los métodos de aislamiento microscópicos tienen poca (o nula) utilidad en Microbiología. El crecimiento de una población o cultivo bacterianos se puede expresar en función de: Aumento del número de células aumento de masa del cultivo Ambos tipos de expresiones son equivalentes entre sí en cultivos que estén en crecimiento balanceado o equilibrado (en el que todos los componentes aumentan una misma proporción por unidad de tiempo). Cuantificación de microorganismos: Recuento de viables: Se utiliza una técnica similar al aislamiento en placa: diluciones seriadas y siembra en placas (30-300 bacterias/placa). Recuento de totales. Medida del número de células: - Directo mediante microscopio (cámaras de recuento de Newbaver). - Contador electrónico de partículas (contador de Coulter) Medida de la masa celular. - Turbidimetría (densidad óptica). Se utiliza un colorímetro (Repasar la ley de Lamber- Beer: A= ε bC, o log Ii/It = k*C). Es el método más utilizado. Peso seco
℘ Medida de la masa celular
Métodos Directos: En estos métodos se requieren preparaciones limpias, sin partículas extrañas.
1) Determinación del peso húmedo: se tara un tubo de centrífuga; se centrifuga el cultivo y se elimina el sobrenadante; se determina el peso del sedimento.
- Inconvenientes: grandes errores, debido al líquido intercelular retenido, cuya cuantía depende a su vez de la forma y tipo de agrupaciones de la cepa, intensidad del empaquetamiento, etc. 2) Determinación del peso seco: como el anterior, pero el sedimento se seca antes de ser pesado (105ºC, toda la noche), hasta peso constante. Las medidas de peso seco suelen representar el 10-15% de los valores de peso húmedo. - Inconvenientes: método tedioso (requiere mucho tiempo) y con bastantes errores: es difícil pesar menos de 1 mg con exactitud en las balanzas habituales de laboratorio. 1 mg de peso seco equivale a unas 5x109 bacterias. 3) Determinación del nitrógeno total: técnica de micro-Kjeldahl. 4) Determinación de un componente característico: peptidoglucano, ADN, ARN, proteínas, ATP, clorofilas en organismos fotosintéticos, etc. Comentarios: se suele usar en bacterias para las que otros métodos más fáciles dan errores debido a que forman grumos no dispersables, crecen en filamentos, etc. Se emplean en determinaciones de crecimientos en ambientes naturales.
Métodos Indirectos:
1) Medida de consumo de nutrientes o de producción de algún metabolito por unidad de tiempo. Ejemplos: consumo de oxígeno (QO2) y consumo de carbónico (QCO2), determinados por el respirómetro de Warburg. Producción de ácidos. 2) Métodos turbidimétricos (ópticos). Son muy usados en la práctica cotidiana del laboratorio. La base común de estos métodos consiste en la medición de la cantidad de luz dispersada o transmitida a través de un cultivo bacteriano. Recordemos aquí que las suspensiones bacterianas dispersan la luz, al igual que cualquier partícula pequeña suspendida en agua (efecto Tyndall). La dispersión de la luz es, dentro de ciertos límites, proporcional a la masa del cultivo. a) Espectrofotómetro: Este aparato es de uso habitual en cualquier laboratorio de Microbiología o Bioquímica. Mide la densidad óptica (D.O.), es decir la absorbancia (una medida de la luz transmitida a través de la suspensión). Por supuesto, hay que realizar una curva estándar para relacionar los valores de A con la masa bacteriana en una muestra problema; La cantidad de luz dispersada es proporcional al cociente entre el tamaño de la partícula y la longitud de onda incidente; la sensibilidad de la técnica aumenta pues a longitudes de onda (λ) cortas. La proporcionalidad entre A y masa bacteriana sólo es válida para >107céls/ml. b) Nefelómetro: Es un aparato similar al anterior, pero el dispositivo sensor está situado en ángulo recto respecto de la dirección de la luz incidente, y lo que se mide es pues, la luz dispersada directamente por la preparación. Posee mayor sensibilidad que el espectrofotómetro.
Método nefelométrico: Determinar la concentración de bacterias en UFC/ml, utilizando la Tabla Solución de BaCl2 al 1,0% ml Solución de H2SO4 al 1,0% ml Escala de McFarland UFC Millones/ml 0,1
9,9
4,0
300
0,2
9,8
3,7
600
0,3
9,7
3,5
900
0,4
9,6
3,4
1 200
0,5
9,5
3,3
1 500
0,6
9,4
3,2
1 800
0,7
9,3
3,15
2 100
0,8
9,2
3,10
2 400
0,9
9,1
3,04
2 700
1,0
9,0
3,00
3 000
2
Diluir la suspensión bacteriana con solución salina estéril al 0,85%, a la transmitancia o turbiedad elegida, de acuerdo con la concentración de bacterias establecida. ℘ Medida del número de individuos
1)
Métodos Directos:
Cámara de recuento de Petroff-Hauser: Consiste en un portaobjetos especial con una graduación en superficie y unas medidas muy concretas: excavación con 0.02 mm de profundidad; área de 1 mm2, dividida en un retículo de 25 cuadrados grandes; cada cuadrado grande está subdividido a su vez en 4x4 = 16 cuadrados pequeños. O sea, la muestra se distribuye en 16 x 25 = 400 celdillas (cuadros pequeños). La muestra, una vez dispensada entre el porta y el cubre, se deja reposar sobre la plataforma del microscopio durante unos minutos, y se cuenta el número de células en varias celdillas (normalmente en 16, equivalentes a uno de los cuadros grandes). Se anota el número n de células observadas en esas 16 celdillas. Entonces, la concentración celular es fácil de establecer: n x 25 x 50 x 1000 = concentración en células/ml. - Ventajas: es un método muy rápido. - Inconvenientes: sólo sirve para suspensiones relativamente concentradas (>10x10 6 céls./ml). Por debajo de este valor el número de células vistas en el campo del microscopio es muy pequeño y poco significativo estadísticamente. En bacterias móviles, hay que inmovilizarlas previamente, con una mezcla de alcohol y agua. 2) Contadores electrónicos de partículas (tipo Coulter): Se hace pasar una suspensión microbiana por un tubo capilar, entre los dos polos de una corriente eléctrica. Cada vez que por un orificio (30 µm diámetro) pasa una partícula (p. ej., bacteria) se interrumpe la corriente, lo cual es recogido por un dispositivo de registro electrónico, que detecta el número y el tamaño de las partículas que van pasando. (El tamaño detectado es función de la intensidad del pulso de voltaje al paso de la partícula). Hay que usar suspensiones absolutamente libres de partículas extrañas (las pequeñas serían contabilizadas erróneamente como bacterias, y las mayores pueden obturar el orificio del aparato).
1)
Métodos Indirectos
Recuento de viables en placa: Los métodos de recuento de número de células que hemos visto hasta ahora (los directos) no distinguen entre células vivas y muertas. En muchos casos conviene contar las células vivas, y esto en laboratorio se suele hacer mediante el recuento de viables. (Una célula se define como viable cuando, colocada en un medio adecuado, es capaz de dividirse y dar descendencia). El método habitual de lograr esto es sembrar pequeñas alícuotas de diluciones adecuadas de un cultivo original sobre placas de Petri con medio sólido (con agar). Cada célula viable dará origen a una colonia visible después del tiempo adecuado de incubación. Contando las colonias visibles, teniendo en cuenta la dilución de la que proceden y el volumen de alícuota utilizado, es fácil deducir el número de células viables en la suspensión original. Precauciones: para minimizar los errores estadísticos de muestreo, se recomienda sembrar 5 placas de cada dilución; hay que usar pipetas nuevas en cada dilución; contar las placas donde existan entre 50 y 300 colonias. Como no podemos garantizar que cada colonia no proceda de más de un individuo (y esto es especialmente cierto para bacterias que forman agrupaciones de 2 o más células), el recuento se refiere no a “células viables reales” sino a “unidades formadoras de colonia” (UFC). Por lo tanto, una UFC corresponde, como mínimo, a una bacteria, pero sobre todo en bacterias con agrupaciones, la medida por siembra en placa infravalora el número real de individuos, porque cada UFC puede corresponder a dos o más individuos que estaban juntos al ser sembrados en la placa. 2) Recuento sobre filtros: Se usa para suspensiones diluidas de bacterias. Se hace pasar un gran volumen de suspensión a través de una membrana de nitrocelulosa o de nylon estériles (con un diámetro de poro que retiene las bacterias pero permite el tránsito de sustancias). Posteriormente, el filtro se deposita sobre la superficie de un medio de cultivo sólido. Las colonias se forman sobre el filtro a partir de las células retenidas. Dichas colonias se cuentan, deduciéndose la concentración original de viables en función del volumen de suspensión que se hizo pasar por el filtro.
MATERIAL
3
10 Tubos de 16x150 con tapón de baquelita 10 Tubos de 16x150 con tapón de baquelita conteniendo 20, 18, 16, 15, 12, 10, 7.5 y 5ml de caldo nutritivo estéril 1 pipeta 1ml 1 pipeta 10ml 5 pipetas estériles de 5, 10 y 20ml Un espectrofotómetro con su celdas REACTIVOS:
Solución salina Cultivo de Escherichia Coli en caldo nutritivo Solución de cloruro de bario al 1% Ácido sulfúrico al 1% Caldo nutritivo estéril PROCEDIMIENTO: 1.- Escala de McFarland o Identifique los tubos con las claves indicadas en la tabla o Con la bureta de 1ml, agregue a cada uno de los tubos el volumen de bario indicado en la tabla. o Con la bureta de 10ml, agregue a cada tubo los volúmenes correspondientes de ácido sulfúrico. o Con el espectrofotómetro determine la turbiedad de las diferentes mezclas. Para ello calibrar el aparato con un tubo que contenga agua. o Graficar las lecturas, colocando en la ordenada los valores de densidad óptica registrados y en las absisa el número aproximado de bacterias representado. Clave del Tubo
BaCl2 1% MI
H2SO4 1% MI
No. Aproximado de bacterias Representadas x 106/ml
D.O. Teórico
D.O. Experimental
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0
9.9 9.8 9.7 9.6 9.5 9.4 9.3 9.2 9.1 9.0
300 600 900 1,200 1,500 1,800 2,100 2,400 2,700 3,000
0.602 0.568 0.544 0.532 0.519 0.505 0.498 0.491 0.483 0.477
0.906 0.935 0.928 0.928 0.927 0.917 0.955 0.955 0.958 0.953
4
Escala de McFarland (TEÓRICA) 1 0.9 0.8
D.O.
0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 3000
2700
2400
2100
1800
1500
1200
900
600
300
0
No. de aprox. de bacterias representadas x 100000/m l
Ecala de Mc Farland
2.- Lectura de problemas: o Identificar los matraces que contienen diferentes volúmenes de medio de cultivo o En condiciones de asepsia agregar a cada matraz el volumen necesario del cultivo Escherichia Coli para obtener un volumen total de 20ml, mezclar el contenido. o Proceder a determinar la turbiedad con el espectrofotómetro. Ajustar el aparato a cero, empleando caldo nutritivo estéril. Tubos con caldo nutritivo inoculados (ml) 20 18 16 15 12 10 7.5 5
A Blanco 0.880 0.877 0.884 0.896 0.885 0.892 0.892
5
CURVA DE CALIBRACIÓN
1
D.O.
0.8 0.6 0.4 0.2 0 300
600
900
1,200 1,500 1,800 2,100 2,400 2,700 3,000 No de Microorganism os Escala de Mc Farland
D.O. experimental
DISCUSIÓN DE RESULTADOS: Se realizó la escala de McFarland para la determinación y cuantificación del número de microorganismos existentes en los caldos preparados, sin embargo, estos valores nos dieron muy altos posiblemente debido a que el espectrofotómetro se encontraba descalibrado, así que se averiguo cuáles eran los valores teóricos para esta escala y estos se muestran en la tabla de resultados, junto a los resultados experimentales, observándose así la gran diferencia que se encontró entre los valores. Debajo de la tabla se puede observar la curva teórica de Mc farland. En la segunda gráfica se observan los resultados obtenidos de las muestras para realizar la escala de Mc Farland en la misma gráfica que los resultados teóricos y ya que los datos no se podían interpolar, se realizó una tercera gráfica que se encuentra después de la tabla con los resultados de las Absorbancias obtenidos de las muestras problema, en la cuál se prolongo la gráfica hacia el cero para poder interpolar los resultados, además de que se tuvo que hacer una recta para que se extendiera la gráfica y de esta manera los puntos coincidieran y que de esta manera los resultados nos dieran el número de bacterias aproximado que se contenía en los tubos de los cuáles los resultados aproximados para los tubos fueron:
18ml 480 x106 M.O. 16ml 420 x106 M.O. 15ml 600 x106 M.O. 12ml 930 x106 M.O. 10ml 840 x106 M.O. 7.5ml 900 x106 M.O. 5ml 900 x106 M.O.
Estos resultados, no pueden ser muy confiables debido a que hubieron varios errores de muestreo como lo fueron el hecho de que los trasvasados, diluciones, tubos de la escala, lecturas, etc. No se realizaran por la misma persona, y en el caso de los tubos de Mc Farland no se realizara con las pipetas volumétricas correspondientes al volumen, y que el espectrofotómetro no se encontrara calibrado, lo que causó que los resultados fueran poco confiables y que los resultados de la curva de calibración diera tan altos y poco certeros. CONCLUSIONES
6
Con esta práctica se puede concluir que para lograr un método adecuado de cuantificación por el método de Mc Farland, hay que tener en cuenta varias variables para realizar adecuadamente el método y prevenir errores, ya que este se basa principalmente en la medición de la cantidad de luz dispersada o transmitida a través de un cultivo bacteriano, y si este no es realizado correctamente, entonces los resultados pueden variar desproporcionalemente, además de que lo más adecuado para esta técnica en especial es la utilización de un nefelómetro ya que este posee mayor sensibilidad que el espectrofotómetro, sin embargo, no se contaba con uno para la realización de la práctica.
REFERENCIAS: http://www2.cbm.uam.es/jlsanz/Docencia/archivos/02.pdf http://www.ugr.es/~eianez/Microbiologia/12crecimiento.htm#_Toc58934317 http://www.salud.gob.mx/unidades/cdi/nom/181ssa18.html
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