Guía Nº 4 SIEMBRA DE MICROORGANISMOS Objetivos: -
Comprender los conceptos de siembra y cultivo de microorganismos Aprender las técnicas asépticas de siembra de microorganismos Realizar siembras en medios líquidos y sólidos aplicando las técnicas aprendidas
1. Concepto de siembra: En Microbiología se entiende como siembra el proceso mediante el cual cual se depo deposi sita ta una una pequ pequeñ eña a cant cantid idad ad de micr microo oorg rgan anis ismo mos s (inóculo) en un medio de cultivo estéril. El inóculo puede proceder de una mue muestra stra o de un cult cultiv ivo o previ revio o. (al crec crecim imie ient nto o de microorganismos obtenido, se le denomina cultivo) La fina finali lida dad d de la siem siembr bra a es perm permit itir ir la mult multip ipli lica caci ción ón de los los microorganismos, al proporcionarles las condiciones óptimas para su desarrollo, lo, dentro de las cuales, se debe considerar: temperatura, nutrientes, pH, disponibilidad de oxígeno, entre otros. La siem iembra bra de micro icroo organ rganis ismo mos s deb debe llev llevar ars se a cabo abo con con inst instru rume ment ntos os y medi medios os prev previam iamen ente te este esteri rili liza zado dos s trab trabaj ajan ando do siempr siempre e bajo bajo condic condicion iones es de asepsi asepsia, a, lograd lograda a por medio medio de un mech mecher ero o Buns Bunsen en que, que, debi debido do a las las corr corrie ient ntes es de conv convec ecci ción ón verticales verticales que genera, es capaz de crear un ambiente ambiente estéril en la zona inmediatamente alrededor y debajo de la llama.
2 Técnicas de siembra: a)
ésta se real realiz iza a en tubo tubos s de Siembr Siembra a de medios medios líquid líquidos: os: ésta ensayo o en matraces. El crecimiento se observa por la turbidez del medio, por la formación de velo o película superficial, o por acumulación de microorganismos en el fondo del tubo (Figura 1). El inóculo se toma con el asa de loop, pipetas o micropipetas. Se utiliz utiliza a para para el enriqu enriqueci ecimie miento nto de microo microorga rganis nismos mos,, alguna algunas s técnicas de recuento, pruebas bioquímicas, etc.
a
b
c
d
Figura 1: crecimiento de microorganismos en medios de cultivo líquido a: velo superficial; b: crecimiento en el fondo del tubo; c: turbidez en todo el tubo; d: tubo control b)
Siembra en medios sólidos: se realiza en tubos de ensayo o en placas de Petri, tiene distintos usos, según el objetivo del cultivo a realizar.
Siembra por estría en tubos: se utilizan tubos con agar inclinado y con el asa de loop se siembra sobre la superficie del agar con un movimiento en zigzag desde el fondo hasta la parte superior del tubo. Se observa el crecimiento sobre la superficie del agar. (Figura 2)
Figura 2: siembra por estría en tubo
Siembra por picadura: se utilizan tubos con agar , y se agrega el inóculo con el asa en punta. El asa se introduce en el centro del agar con un solo movimiento. Se observa el crecimiento en la linea de inoculación. En agar semisólido, se utiliza para la prueba de movilidad. (Figura 3)
Figura 3: siembra en picadura en medio semisólido
Siembra por extensión en placas: consiste en poner un inóculo en la superficie del agar y luego extenderlo sobre el medio. La extensión del inóculo se puede hacer con asa de loop, técnica denominada “siembra en estrías” o el asa de Drygalsky, técnica denominada “siembra homogénea” Siembra en estrías: con un asa de loop previamente esterilizada a la llama del mechero, se deposita un pequeño inóculo y se extiende, en estrias, sobre un área pequeña de la placa. Se esteriliza el asa, se enfría en la tapa de la placa y a partir de la siembra realizada anteriormente, se estría la zona contigua. El proceso se repite sucesivamente, hasta sembrar en cuatro zonas (Figura 4). Los microorganismos se adhieren a la superficie del medio y se multiplican formando colonias. Este tipo de siembra se utiliza para aislar bacterias y obtener cultivos puros
Figura 4: siembra de estrías en placa
Siembra homogénea: se toma un pequeño volumen a partir de un cultivo o muestra líquida. Generalmente y dependiendo del objetivo de la siembra, se toman inóculos desde 0,1 a 2ml. Luego se distribuye homogéneamente sobre el agar con el asa de Drygalsky. Se utiliza para recuento de microorganismos y como técnica de aislamiento, previa dilución de la muestra. (Figura 5)
Figura 5: Dilución y siembra homogénea
Siembra en profundidad: en una placa de Petri se vacía un pequeño volumen (1 ml) de muestra y a continuación se agrega el medio de cultivo (agar nutritivo) fundido y temperado a 45º C. Se mezclan por rotación suave de la placa. (Figura 6) Los microorganismos se distribuirán en forma homgénea en el medio de cultivo, permitiendo, así el desarrollo de colonias separadas en el agar. Se deja enfriar la placa hasta que solidifique el medio. Esta técnica se utiliza para determinar el número de bacterias viables, anerobias facultativas y microaerófilas, presentes en la muestra
Figura 6: Siembra en profundidad
Las siembras realizadas en placas de Petri, permitirán observar el crecimiento de los microorganismos a través de la formación de colonias. Cada colonia se desarrolla a partir de la multiplicación de una célula, y cada colonia se denomina “Unidad Formadora de colonia” (UFC). Las colonias pueden diferenciarse de acuerdo a: •
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Tamaño: Grande (mayor a 1 mm de diámetro); media ( 1mm de diámetro); pequeña ( menor a 1 mm de diámetro) Elevación: plana, convexa, centro elevado, umbilicada, cóncava Forma: circular, filamentosa, irregular, puntiforme, rizoide, ovalada, fusiforme Margen o borde: entero, ondulado, lobulado, dentado, filamentoso, rizado Color: blanco, negra, crema, naranja, etc Apariencia de la superficie: brillante, opaca, suave, rugosa, granular Consistencia: observada al tomar la colonia con el asa, puede ser: cremosa, viscosa, granular (Figura 7)
Umbilicada
Figura 7: Características de las colonias
3 Normas generales para realizar siembra de microorganismos Para trabajar bajo condiciones de asepsia en el laboratorio y mantener la esterilidad de los medios de cultivo que serán sembrados, se deben seguir las siguientes indicaciones: 1. El trabajo es individual, por lo tanto cada alumno debe disponer de un mechero 2. Lavarse las manos con agua y jabón desinfectante 3. Desinfectar el área de trabajo con etanol 4. Encender el mechero 5. Dejar al alcance de sus manos el material a utilizar (medios de cultivo, asas, pipetas, cementerio, etc) 6. Debe flamearse a la llama del mechero la boca de los tubos de ensayo antes y después de tomar un inóculo 7. Las asas rectas y de loop deben esterilizarse al rojo cada vez que se utilizan y dejan de utilizar. Antes de tomar el inóculo deben enfriarse, dejándolas cerca del mechero 8. Las asas de Drygalsky deben esterilizarse por flameado en alcohol y enfriadas en la tapa de la palca, antes de ser utilizadas. Una vez utilizadas deben dejarse en alcohol. Para ello, se mantendrán en un vaso con etanol. 9. La boca y tapa de los pipeteros deben flamearse a la llama del mechero, cada vez que se saque una pipeta. Las pipetas utilizadas deben dejarse en un recipiente con solución desinfectante (cementerio) 10. Para la siembra en placas, éstas deben abrirse frente al mechero, sin dejar la tapa boca abajo sobre el mesón.
11. Una vez que la siembra se ha realizado, los tubos y placas serán incubados bajo condiciones controladas de temperatura. En el caso de las placas, debe incubarse invertidas.
Trabajo Práctico “Siembra de microorganismos” Materiales y equipos: -
Asa de loop Asa recta Asa de Drygalsky Pipetas de 1 ml Vasos pp con alcohol Etanol Mechero Gradillas Medios de cultivo esterilizados: agar nutritivo inclinado y recto, Agar nutritivo en placas, caldo nutritivo Cepas bacterianas en cultivos líquidos y sólidos
Actividades: Trabajo individual Cada alumno realizará las siguientes siembras: -
Siembra en medio líquido Siembra en picadura Siembra por estrías en tubo Siembra por estrías en placa Siembra homogénea
Resultados: Los resultados serán observados a la semana siguiente. El alumno deberá revisar cada siembra realizada y anotar los resultados obtenidos:
Tipo de siembra Picadura Estría en tubo
Crecimiento
Asa utilizada
Utilidad técnica
de
la
Medio líquido Características de las colonias (forma, color, elevación) Estrias placas
en
Homogénea
Autoevaluación:
1 ¿Por qué debe utilizar el mechero Bunsen durante la siembra? 2. ¿Cómo esteriliza el asa de loop y el asa de Drygalsky? 3 ¿Qué tipo de siembras puede realizar con el asa de loop? 4. Si tuviera que determinar la movilidad de una cepa bacteriana. a) ¿qué tipo de siembra realizaría? b) ¿Qué tipo de medio de cultivo utilizaría? c) Describa paso a paso el procedimiento que realizaría
