PRACTICAS DE LABORATORIO
CUESTIONARIO DE BIOTECNOLOGIA 1. ¿Cuáles son las causas más comunes de los errores para la cuantificación de biomasa biomasa utilizando estos métodos?
A. Errores Podemos agrupar a las fuentes potenciales de error
en 3 grandes grupos: grupos:
1. Errores del proceso analítico. 2. Errores en la medición. 3. Errores de cálculo. I.
Errores del proceso analítico a) Errores aleatorios comunes c omunes y
Pipeteo
y
Recuperación Dilución Separación de la fracción libre de la unida
y y
b) Errores aleatorios anormales ³outliers´ o ³flyers´ y y y y
Error en el uso de tubos Doble dispensamiento de algún reactivo en el mismo tubo Falta de un reactivo en algún tubo Generación de burbujas al dispensar
c) Errores sistemáticos Generan desviaciones del valor asignado como verdadero.
y y y y
UNT
Incorrecto tiempo de incubación Incorrecta temperatura de incubación Alteración en el proceso de separación de la fracción unida Errores técnicos (error en en el volumen dispensado dispensado de estándar, estándar, control, muestra, trazador o anticuerpos)
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II.
Errores en la medición. Dependen de la naturaleza de la señal que mido. En caso de radiactividad: a) Errores de fondo. y y y y
Ruidos térmicos del instrumento. Contaminación. Spillover (contribución de radiación de otros nucleídos). Crosstalk (actividad por irradiación de otro nucleído).
b) Errores de conteo y y y y
III.
Falta
de calibración del aparato de medición. Errores estadísticos (Tiempo de conteo incorrecto) Contaminación del algún tubo. Diferencias de eficiencia de medición.
Errores de cálculo. a) Errores de los calibradores o estándares. y y y
Errores en la concentración de los estándares. Errores en el cálculo de la curva Dosis ± Repuesta Naturaleza de la curva Dosis ± Repuesta
b) Errores en la interpolación en la curva Dosis - Respuesta y y
TURBIDIMETRIA:
UNT
Error en el cálculo de los desconocidos. Errores en la identificación de algún tubo.
El error de proceso analítico de pipeteo en el momento de las diluciones. La sedimentación rápida de la muestra, en el caso de las levaduras.
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PESO SECO
La principal causa de error de medición en este método es la dificultad de pesar menos de 1 mg con exactitud en las balanzas habituales de laboratorio.
También la muestra seca puede recobrar humedad durante el pesado, principalmente si el ambiente tiene una humedad relativa alta.
La presencia de sólidos en el medio
R ECUENTO EN PLACA
Una causa de error de proceso analítico en este método es el uso de un medio de cultivo inadecuado de enriquecimiento selectivo para la incubación del microorganismo.
También un mal manejo en la introducción de las campanas, pueden introducir gas y errar los resultados.
http://aulavirtual.usal.es/aulavirtual/demos/microbiologia/unidades/documen/uni_ 02/58/texthtml/cap804.htm http://www.qb.fcen.uba.ar/microinmuno/SeminarioR ecuento.htm
2. ¿Cuáles son las ventajas y desventajas de los métodos utilizados?
TURBIDIMETRIA
VENTAJAS
Es un método rápido y reproducible. DESVENTAJAS
UNT
Solo se puede aplicar a microorganismos unicelulares. Este método sólo da una estimación del número de microorganismo (viable y no viable) y sirve sólo para cargas altas. Es afectada por burbujas y sólidos no disueltos. Es sensible en un rango acotado de concentración (igualmente la muestra se puede diluir). Normalmente se usan longitudes de onda de aproximadamente de 540 nm.
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R ECUENTO EN PLACA
VENTAJAS
La técnica es apta para microorganismos unicelulares y para cultivo de esporas.
La capacidad de estimar tamaños poblacionales basados en atributos relacionados a un proceso (selectividad); por ejemplo: Se puede determinar la densidad poblacional de organismos que pueden nodular leguminosas en una muestra de suelo usando el método de infección de plantas.
Es posible enumerar también por este método microorganismos anaerobios utilizando en los tubos medio prerreducido, que se tapan con un tapón de vaselina-parafina luego de inocular y se incuban en condiciones a erobias.
Se prefiere también este método cuando los microorganismos son de lento crecimiento, o cuando han sido sometidos a condiciones adversas (temperatura alta, desecación, etc.).
Provee
Determina sólo organismos vivos y activos metabólicamente.
Suele ser más rápido e igual de confiable que los métodos tradicionales de esparcimiento en platos de cultivo, entre otros.
Este método es especialmente útil para determinar cargas microbianas bajas, menores de 10 por gramo, pero puede igualmente emplearse para cargas mayores utilizando las diluciones apropiadas.
una recuperación uniforme de las poblaciones microbianas de suelos diversificados.
DESVENTAJAS
Se considera semicuantitativo, porque sólo da una estimación.
Solo es posible utilizar este método para determinar la biomasa de microorganismos productores de gases.
UNT
Es un método muy lento (requiere más de 24 horas).
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PESO SECO
VENTAJAS
Esta técnica es útil para grandes volúmenes de muestra.
Es un método rápido. DESVENTAJAS
Se necesitan aproximadamente 24 hs para secar el material.
Interfieren los sólidos no disueltos del medio de cultivo.
No se discrimina entre material viable y no viable.
Es muy poco sensible.
Las pérdidas de componentes volátiles de la célula por el proceso de secado y existir alguna degradación.
No diferencia células vivas de muertas y su sensibilidad es limitada.
La muestra seca puede recobrar humedad durante el pesado, principalmente si el ambiente tiene una humedad relativa alta.
Es difícil pesar menos de 1 mg con exactitud en las balanzas habituales de laboratorio. 1 mg de peso seco equivale a unas 5x10 9 bacterias.
http://www.microbiologia.com.ar/bacteriologia/fisiologia.php?Mostrar=medida http://www.textil.org/extranet/inf/Revista9/pag20.pdf http://www.qb.fcen.uba.ar/microinmuno/SeminarioRecuento.htm
UNT
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3. ¿Esquematice y esplique el método de recuento de células por métodos electrónicos? 4. ¿Mencione otros métodos de estimación de biomasa? Existen varias formas de cuantificar las poblaciones microbianas, las cuales se pueden agrupar en dos tipos de procedimientos: métodos directos y métodos indirectos. MÉTODOS INDIR ECTOS:
I.
Usan parámetros que no son directamente el número de células, sino otros parámetros relacionados con la cantidad de población, como por ejemplo el peso seco, cantidad de proteínas, cantidad de clorofila, etc.
PESO SECO/FR ESCO
Como resultado del crecimiento, se produce nueva biomasa. Una técnica que permite realizar una estima indirecta de esta biomasa es la determinación del peso seco de una alícuota de un cultivo. Se toma una alícuota del cultivo y se retiran las células, bien por centrifugación o filtración. En la centrifugación previamente hay que pesar el tubo donde vamos a retirar las células, a continuación lo ponemos en una estufa para eliminar el agua, después se vuelve a pesar el tubo y por la diferencia sacamos el volumen de lo centrifugado. En la filtración, se pesa previamente el filtro, se seca y se vuelve a hacer la diferencia. Después se hacen los cálculos. Así, podemos saber cuánto pesa una célula.
DENSIDAD ÓPTICA
El método está basado en la ley de Lambert y Beer. Turbidimetría: Se mide la "opacidad" o "densidad óptica". El detector se ubica en la
misma dirección en la que incide el haz inicial. La Turbidimetría mide la cantidad de luz transmitida por una suspensión. Las poblaciones microbianas en medio líquido actúan como suspensiones de partículas, teniendo la capacidad de dispersar la luz que incide sobre estas. El grado de dispersión será proporcional a la concentración de células presentes. Podemos medir la cantidad de luz que pasa a través de esa dilución de partículas o cultivo y mediante una calibración saber el número de partículas de esa dilución aproximadamente y esto se hace con el espectrofotómetro. Log I0 / I t = A [x] l A este término se lo denomina "densidad óptica" Donde: I0=intensidad inicial It=intensidad transmitida A=constante (a baja concentración de biomasa) x=concentración de biomasa l=paso de luz
UNT
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Nefelometría: El detector se ubica en un ángulo distinto del haz incidente (normalmente 90 r). Donde:
Log I0 / Is = -B[x] l Is= intensidad de luz
CITOMETRIA DE FLUJO ( DENTR O DEL ELECTR ÓNICO) Permite, además de contar, determinar algunas de las características de las células en una suspensión líquida. Las células suspendidas una por una son llevadas a un detector por medio de un conducto de flujo, al pasar por el detector, sobre las células se incide una luz láser, de tal manera que se puede detectar fluorescencia, absorbancia y dispersión de luz, que permiten obtener información sobre propiedades celulares. Es similar al de conteo en campo eléctrico, pero el monitoreo del paso de las células es por un haz de láser. El detector registra la interrupción de este haz.
DESVENTAJAS:
Alto costo del equipo Solo para microorganismos unicelulares.
PERMEABILIDAD DIELÉCTRICA
BIOLUMINISCENCIA Y QUIMIOLUMINISCENCIA
Determinación del ATP: El ATP se encuentra en todas las células vivas, ya que es el agente universal de
transferencia de energía, pero se deteriora rápidamente en el momento en que la célula muere. Por esto, la medida del AT P también se puede considerar como una medida indirecta de la biomasa Es útil, sobre todo, en productos acelulares como por ejemplo las bebidas, en las cuales es fácil separar las células de los microorganismos del resto del líquido. Pero es compleja en el caso de alimentos, en los cuales previamente habría que eliminar el AT P del alimento que no son células, sin tocar el AT P de los microorganismos. El ATP se puede medir gracias a una técnica muy sencilla, en la que se usa una enzima proveniente de un organismo (la luciérnaga), los cuales producen luz de forma natural, debido a una reacción enzimática. La luciferaza actúa sobre la luciferina y en presencia del ATP produce oxiluciferina, hidrolizando el AT P, produciendo CO2 y luz. A más ATP mayor será la cantidad de luz. Hoy en día se vende la luciferina y luciferaza purificada y en el momento en que se añade el ATP se produce luz, pudiendo calibrar la cantidad de luz emitida por una cantidad de ATP. UNT
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PRACTICAS
AB RATORIO
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ATP + l
FIG 1: La bi
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oxil
+ O2
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+ AMPi + PPi + CO2
ia del ATP puede emplearse para evaluar la limpieza de las superf i ies en cont acto con l os alimentos
©
La biomasa es expresada en t rminos de ATP, asumiendo que las células tienen una cantidad relati amente constante de ATP, que pierden cuando mueren. Sin embargo la concentrac i n de ATP var ía según el estado f isiol gico del microorgan ismo. Esto dio or igen a l dosa je del total de ATP, ADP y AMP, que ser ía constante independient ement e del estado f isiol gico de la célula.
FLUOR E
E
E PE TROSCOPIA DE INFR ARROJO CERCANO
IA
La cuenta de células somá ticas rea li ada mediante el Contador Infrarro jo de DeLava l y el Contador Electrónico (Fossoma tic) es tan conf iab le como la rea li ada con microscopía.
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Fi
MASA
2: Contador Infrarrojo de DeLaval
DE UN COMPONENTE CELULAR
Si la cantidad de una sus tancia es constant e en cada célula, la cantidad total de dicho constituyent e celular , estará directamente relacionada con la masa celular total. Por e jemplo para proteínas, ADN, AR N, clorof ila.
j
Nitrógeno celular: El método utili ado es el de K jeldahl. DESVE NTAJA:
El contenido de N var ía a lo largo del crecimiento. j
Proteí nas: El método más utili ado es el de Biuret. DESVENTAJAS: Depende de la composición de aminoácidos (los reactivos se ca li bran genera lmente contra seroa l bumina).
j
DNA: El ensayo es una co lor imetr ía basada en la reacción entre la deoxir i bosa y la difenilamina. VENTAJA: La concentración de DNA es bastante constante durante los procesos. DESVENTAJAS Es poco sens i ble Se usan reactivos peligrosos.
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ACTIVIDADES METABÓLICAS R elaciona biomasa con alguna velocidad de reacción metabólica Se pueden monitorear por ejemplo: La producción de gases como CO2. El consumo de sustratos o de O2. Reacciones de reducción de colorantes específicos.
En el caso del consumo de sustratos, se debe tener en cuenta que parte del consumo se destina al mantenimiento y solo una parte de estos se destina al crecimiento de la biomasa. II.
MÉTODOS DIR ECTOS:
Son los que permiten estimar directamente el número de células de la muestra.
CONTEO EN CAMPO ELÉCTRICO (R ECUENTO ELECTR ÓNICO)
Para
realizar recuentos de microorganismos se pueden utilizar un instrumento electrónico llamado contador de partículas de Coulter. Lleva una sonda en cuya base lleva un orificio, en ese tubo lleva un electrodo conectado a una fuente de voltaje y por fuera del tubo lleva otro electrodo El tubo lleva dentro una solución electrolítica (conduce la electricidad). El circuito se cierra con la muestra, colocándola en una cubeta con una solución electrolítica y ya puede pasar la corriente. Al Coulter se le puede indicar el volumen que me interesa contar, porque está asociado a una bomba de vacío que chupa a través del orificio el volumen que interesa. Al chupar la bomba, las células comienzan a entrar por el orificio y cuando pasa una partícula cae la corriente y después se vuelve a recuperar. Este cambio de corriente además es proporcional al tamaño de la partícula y le podemos indicar que sólo cuente las partículas de un tamaño determinado, mediante un calibrado. Uno de los inconvenientes es que pueden pasar más de una célula junta o también que pueden pasar partículas que no son células y se cuentan como células. Se hace pasar las células por una pequeña apertura en la cual está aplicado un campo de corriente eléctrica constante. Como las células son generalmente no-conductoras, al pasar por la apertura generan un incremento en el voltaje (resistencia). La concentración de la muestra debe de ser tal que pase una sola célula a la vez por la ranura. También se puede calcular el tamaño de la célula, ya que el cambio en la resistencia es proporcional al tamaño. Esto es importante si se quiere monitorear los cambios en la evolución del cultivo.
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F ig. 3: El Contador Electrónico (Fossomatic)
DESVENTAJAS:
Está restr ingido a medios de cu ltivo def inidos (por la conductividad del medio). Solo aplicable a microorgan ismos unicelulares. Equi po costoso (Coulter counter)
VOLUMETR ICO
Si es poco volumen de mues tra se hace como un hema tocr ito (en cap ilar).Si el volumen es mayor se cen tr ifuga en un tubo graduado. En cua lquier caso se debe es tandar i ar las condiciones en las que se sedimenta la biomasa. Volúmenes mayores : se determina el empaquetado celular (CPV= cell pack volume) por simple decantación.
t=5
min
Fig 4: A non-invasive method f or the routi n-estimation of fresh wieg ht of cell grown batch suspension culture.
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DESVENTAJA:
La manera en que sedimenta la biomasa depende de la morfología del cultivo (ejemplo: hongos filamentosos) esto trae un sesgo importante en los datos.
R ECUENTO DE VIABLES
La técnica se basa en el plaqueo de la muestra y el recuento de colonias. Su demora en la obtención de los resultados lo hace poco práctica para el monitoreo de procesos. Técnicas
de recuento en placa: Es el mejor método para determinar células vivas. Se realiza sembrando un determinado volumen de la muestra sobre placas con medio de cultivo, el cual debe permitir el crecimiento o de una gran cantidad de microorganismos o sólo de los que nos interesan. Se basa en la hipótesis de que todas las células formarán una colonia y que todas las colonias surgen de una sola célula (aunque no va a ser así exactamente). Dentro de los medios de cultivo tenemos: medios selectivos, medios enriquecidos y medios diferenciales. En general, todos los medios de cultivo son selectivos, porque no permiten el crecimiento de todos los microorganismos. Antes de hacer las siembras hay que hacer las diluciones seriadas. A partir de cada dilución hay que hacer una siembra y una vez que está incubado se escoge para contar aquella placa que nos dé un contaje entre 30 y 300 colonias y sabemos de qué dilución procede. Existen tres métodos para hacer el recuento: R ecuento
por siembra en superficie: A partir de la dilución madre se hacen las seriadas, de ellas se toma una parte y se añade a la placa que tiene el medio de cultivo sólido y con un asa se extiende la siembra por la superficie de la placa y después de incubada se hace el recuento. Las ventajas son que permite ver la morfología , color y textura de las colonias y además es el mejor métodos para el crecimiento de aerobios estrictos , la desventaja es que lleva más tiempo , hay que usar el asa de Drigalski que hay que esterilizar y además sólo permite sembrar volúmenes muy pequeños ( hasta 0'1 ml ) . R ecuento por siembra en inclusión: Se siembra en placas Petri vacías y
a continuación se añade el medio de cultivo fluido todavía y con movimientos circulares ligeros se homogeniza. Por lo que los microorganismos crecen dentro del agar una vez solidificado. R ecuento
por filtración de membrana: Un volumen conocido se filtra a través de una membrana estéril de 0'22 micras, con lo que las bacterias quedan retenidas en el filtro y después es el filtro el que se coloca sobre el medio de cultivo y se incuba. Para facilitar la filtración cuando el
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volumen de muestra es muy pequeño, esta se disuelve en un volumen indeterminado de una solución estéril. Este volumen no influye en el recuento porque está estéril, y se está filtrando toda la muestra, por lo que sólo se recuenta lo que hay en 1 ml de muestra.
Método de las gotitas de Agar: La muestra se diluye realizando diluciones seriadas
en tubos con el medio de cultivo sólido, pero fundido, y luego se transfiere a una placa Petri gotitas de 0'1 ml de cada dilución, se incuba y se cuentan las colonias con una lupa de 10 aumentos. Este método suele ser más rápido que los métodos convencionales de recuento en placa y gasta mucho menos material. Técnicas
del número más probable también de viables: La técnica consiste en sembrar en distintos tubos, conteniendo un medio de cultivo líquido apropiado, distintos volúmenes de la muestra problema. Una vez realizada la incubación de los tubos se valora aquellos en los que se produjo crecimiento de los microorganismos que nos interesa cuantificar, anotando el número de tubos de cada dilución realizada que dieron positivos. Con este resultado se va a unas tablas estadísticas realizadas para esto (tablas del NMP), que dan el número más probable de microorganismos considerados por unidad de volumen, junto con el intervalo de confianza para este valor. A veces este método se considera semicuantitativo, porque sólo da una estima.
R ecuento
microscópico con cámara de recuento: Cuando nos interesa realizar un recuento de células totales, uno de los métodos más usados es el de la cámara de contaje usando un microscopio. Es un método directo, ya que determina directa y exactamente el número de células en un determinado volumen. Para ello, se coloca una suspensión de los microorganismos en las cámaras de recuento, las cuales permiten determinar el número de partículas que hay en un determinado volumen. Las partículas se cuentan visualmente, con ayuda de un microscopio. Uno de los tipos de cámaras más utilizadas, son las de Neubauer: Es una cámara que se utiliza para en conteo de células en distintas variedades y está diseñada de manera de contener una cantidad fija de líquido y que Consta de un cuadrado central de 1 mm de lado dividido en 25 cuadraditos con una altura de 0.1 mm entre el cubreobjetos y la cámara. Ésta determina que el líquido quede contenido en un volumen de 0.1 mm3.
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Tabla 1: Métodos de determinación del número Método
Microorganismos
Tipo de
para los que se utiliza
recuento
de microorganismos. Usos / Limitaciones
Indirecto
Turbidez
La mayoría de las bacterias y levaduras
Total
Peso seco
Cualquier microorganismo
Total
Actividad metabólica
Cualquier microorganismo viable
Viables
Determina la turbidez con un espectrofotómetro; rápido y reproducible; la suspensión debe contener más de unos l0 millones de células por ml; se requiere una curva patrón Tedioso y requiere un cierto tiempo, pero preciso y reproducible Requiere un cierto tiempo y puede ser impreciso; puede utilizarse con materiales complejos
Directo
Recuento microscópico
Cualquier microorganismo unicelular
Total
Recuento electrónico
Cualquier microorganismo unicelular
Total
Recuento en placa
Cualquier microorganismo unicelular viable
Viables
Numero más probable
Cualquier microorganismo viable
Viables
Filtración
Cualquier microorganismo viable
Viables
Muy
útil para el recuento de un tipo de células de una mezcla; requiere un cierto tiempo; no es adecuado para cultivos diluidos Muy útil para el recuento de células de un cultivo axénico; rápido y preciso; no debe estar presente material extralio Muy sensible - puede detectar incluso una célula; lento y tedioso; para evitar el error debido al muestreo, se debe recontar un gran número de colonias Utilizado para microorganismos que son difíciles de cultivar en medio sólido y para determinar contaminación por Escherichia coli en aguas; requiere un cierto tiempo Se concentra una muestra, de manera que se puede recontar un pequeño número de células a partir de grandes volúmenes de un líquido o de un gas
http://html.rincondelvago.com/control-microbiologico-de-calidad.html http://weblogs.madrimasd.org/alimentacion/archive/2008/01/31/83638.aspx
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http://www.monografias.com/trabajos10/10cincrec/10cincrec.shtml?relacionados http://64.233.169.104/search?q=cache:f MhXeXVGDwJ:www.ffyb.uba.ar/micro_ind/biot1/ Teoricos/estimacion%2520biomasa2004.ppt+estimacion+biomasa2004&hl=es&ct=clnk&c d=1&gl=pe http://www.fcv.unl.edu.ar/archivos/grado/catedras/tecnologialeche/informacion/tp4.pdf
5. ¿Porque se agrega sal al agua antes de diluir la levadura? Las levaduras crecen mejor que la mayoría de las bacterias en sustratos que contienen elevadas concentraciones de soluto (sal). Las levaduras y hongos toleran mejor los ambientes hipertónicos que la mayoría de las bacterias las cuales son sensibles a las presiones osmóticas, pero existen algunas bacterias que resisten altas presiones osmóticas. Las levaduras requieren pH altos, medios poco salados dependiendo poco de las concentraciones de glucosa, para obtener un verdadero desarrollo. Además que la levaduras tienen una actividad de agua entre 0,88 y 0,94 para el lograr un crecimiento óptimo.
.C. Frazier, D. C. Westhoff, ³ Microbiología de los alimentos´, 4ta Edición Acribia, Zaragoza-España, 1993. W
6. ¿Qué es nefelometría? La nefelometría es un procedimiento analítico que se basa en la dispersión de la radiación que atraviesan las partículas de materia. Cuando la luz atraviesa un medio transparente en el que existe una suspensión de partículas sólidas, se dispersa en todas direcciones y como consecuencia se observa turbia. La dispersión no supone la pérdida neta de potencia radiante, solo es afectada la dirección de la propagación, porque la intensidad de la radiación es la misma en cualquier ángulo. La intensidad depende de: El número de partículas suspendidas, su tamaño, su forma, los índices refractivos de la partícula y del medio dispersante, y la longitud de onda de la radiación dispersada. La relación entre variables y es más factible un tratamiento teórico, pero debido a su complejidad raras veces se aplica a problemas analíticos específicos. El procedimiento generalmente es empírico y sólo se consideran 3 factores:
La concentración: Mayor
Tamaño
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sea el número de partículas, mayor es la dispersión.
de la partícula: Factores como el pH, la velocidad y orden de la mezcla, concentración de los reactivos, duración del estado de reposo y la fuerza iónica.
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Longitud
de onda: Generalmente las muestras se iluminan con luz blanca, pero si están coloreadas, se debe escoger una porción del espectro electromagnético en la que la absorción del medio se reduzca al mínimo.
En las muestras se agregan agentes tensoactivos (como gelatina), para prevenir la coagulación del coloide. Sólo se obtienen datos confiables si se controlan escrupulosamente las variables que afectan el tamaño de partículas.
http://es.wikipedia.org/wiki/Nefelometr%C3%ADa 7. ¿Describe el método del número más probable? Se basa en la determinación de la presencia o ausencia de un determinado tipo de microorganismo (en función de que crezcan o de que produzcan determinada reacción en el medio), en diferentes cantidades de muestra. Según el tipo de microorganismo que se desea contar se utilizan medios de enriquecimiento selectivos, o medios de propagación. En función de esto se pude considerar como positivos aquellos tubos en los que: a) hubo crecimiento visualizado por aparición de turbidez b) hubo crecimiento visualizado por desaparición del sustrato (reacción química coloreada) y/o aparición de producto final del metabolismo (ej. nitritos o nitratos en medio con sales de amonio). Cada tubo positivo, significa que en la cantidad de muestra en él sembrada había por lo menos 1 microorganismo de los que se está contando. La interpretación de los resultados, se hace en base a una distribución de tipo Poisson, y en general se emplean tablas, como la de Mc Grady, con 3 o 5 tubos por cada dilución, preparadas de acuerdo a la cantidad de muestra que se siembra en cada serie de tubos. Fermentación de fuentes carbonadas: se usa YNB con el azúcar correspondiente pero en
medio liquido y con campana de Durham donde se acumularan burbujas de gases si existe fermentación.
Descripción del método del numero mas probable: 1. Preparación del Material
Se seleccionaron ocho frascos de vidrio de 300 ml, en el interior de cuyas tapas se colocó papel de aluminio. Seguidamente se envolvieron los mismos en papel de diario, junto con juegos de tres pipetas a utilizar en cada muestreo y se colocaron en la estufa de esterilización. 2. Recolección de las muestras
Se tomaron tres muestras de agua en cada uno de los cuatro sitios se seleccionaron, utilizando en cada uno de ellos los mismos métodos. UNT
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3. Preparación del medio de cultivo:
En el laboratorio se preparó Caldo Mac Conkey, en simple y doble concentración, como medio de cultivo para las muestras. Posteriormente se procedió a calentar las mezclas en dos erlermeyers para obtener soluciones homogéneas. Luego, el medio es distribuido en 60 tubos de ensayo con sus respectivas campanitas, a razón de 5 ml por tubo, y 12 con Caldo Mac Conkey de doble concentración, a razón de 10 ml por tubo. Por último, los tubos con el caldo Mac Conkey fueron puestos en la autoclave a 121º C durante 15 minutos, para luego ser trasladados a la heladera. 4. Siembra de las muestras:
Se unificaron los contenidos de los dos frascos, para obtener así una muestra representativa de cada sector del río. Luego se repartió el agua de cada frasco resultante en los tubos de ensayo preparados con caldo de la siguiente manera por cada muestra: 10 ml en cada tubo de doble concentración (3) ,1 ml por cada tubo de simple concentración (3), y 0,1 ml, por cada tubo de simple concentración (3) con una pipeta previamente esterilizada. Los tubos fueron ubicados en una gradilla y se colocaron en el baño termostático durante 48 horas a 37º C. con los tubos que dieron positivos se tomo una alícuota de cada uno y se colocaron nuevamente en el baño termostático, pero esta vez a 44º C.
5. Análisis y recuento de los resultados:
Tras la primera incubación los tubos que presentaron viraje de color, de magenta oscuro a amarillo, y en los que además se observó producción de gas, se contabilizaron en nuestra carpeta de campo como positivos, lo que quiere decir que en esta muestra había presencia de bacteria coliformes. Luego se procedió a sacar el NMP de bacterias coliformes consultando la tabla de NMP. Éstos fueron cultivados nuevamente, pero esta vez a 44º C, repitiendo el mismo procedimiento. Luego de la segunda incubación con los tubos que dieron resultado positivo, seleccionando muestras que llamaron nuestra atención, por ejemplo si formaban un velo sobre la campanita o si su color era particular, se procedió a aislar las bacterias mediante estrías en placa de petri estériles con medio agar Levine (EMB), brindado por el laboratorio LAC, que se utiliza para la detección de bacilos coliformes, para así poder observar el desarrollo de las colonias de
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b cte i li.
que e incub
n, c m
ejem l ,
el b ill met lic de l
http://www.coopeducativamoreno.com.ar/ uemquemtreu/metodos.html http://usuarios.l cos.es/zando li/web3/Tab la%20NMP.htm
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che ichi
