SEPARACION DE AMINOACIDOS POR CROMATOGRAFIA DE PAPEL Facultad de Ciencias Agrícolas – Programa de Ingeniería de Alimentos Universidad de Córdoba 27 de Agosto de 2004 Por : ose !uis "ía# $% Angell& $artine# $artine# '% Carlos os( )rta *% Cristian $angones A%
RESUMEN !a cromatogra+ía cromatogra+ía es una t(cnica de an,lisis an,lisis -uímico cu&o ob.etivo ob.etivo es la se/aración se/aración de sustancias /uras en me#clas com/le.as% sta t(cnica de/ende del /rinci/io de adsorción selectiva% "ebido a ciertas limitaciones -ue se /resentan /ara la identi+icación de sustancias se 1ace necesario recurrir a m(todos m,s con+iables tales como la cromatogra+ía de /a/el% n la cromatogra+ía en /a/el una muestra lí-uida 3Fase móvil +lu&e /or una tira vertical de /a/e /a/ell adso adsorb rben ente te 3Fas 3Fase e esta estaci cion onar aria ia sobr sobre e la cual cual se van van de/o de/osi sita tand ndo o los los com/onentes en lugares es/ecí+icos% !a cromatogra+ía de /a/el /uede ser desarrollada en el cam/o de la bio-uímica /ara la se/aración de Amino,cidos la determinación de /roteínas & /igmentos% l uso de la cromato cromatogra+ gra+ía ía est, am/liament am/liamente e e5tendi e5tendido do en el an,lisis an,lisis de alimento alimentos s medicinas sangre /roductos /etrolí+eros & de +isión radiactiva%
Palabras claves: Cromatogra+ía /a/el se/aración adsorción +ase% 1. INTR INTROD ODUC UCCI CION ON
cromatogr,+ica en /a/el & calcular su '+ /ara identi+icar una muestra determinada%
n *io*io-uí uími mica ca se em/l em/lea ean n
dive divers rsos os
m(todos m(todos /ara traba.ar traba.ar en el laborat laboratorio orio%% Uno
de
los
m,s
utili#ados
es
2. CONTENIDO
la
cromatogra+ía de /a/el%
!a cromatogra+ía es una t(cnica -ue se
!as diversas t(cnicas de cromatogra+ía se
basa basa en la migr migrac ació ión n di+e di+ere renc ncia iall de
utili#an /ara aislar & se/arar los diversos
sust sustan anci cias as
com/ues com/uestos tos medir su /eso molecular molecular &
similares -ue varían en carga & tama6o%
evaluar la /ure#a de los mismos% Adem,s
n todo ti/o de cromatogra+ía se re-uiere
/res /resen enta tan n una una vali valios osa a a&ud a&uda a /ara /ara el
de dos +ases una estacionaria 3lí-uido o
an,lis lisis
sólido & una +ase móvil 3lí-uido o gas
de
alim limentos tos
de
sangre &
con con
/ro/ /ro/ie ieda dade des s
+ísi +ísica cas s
diversas sustancias%
!as !as cuales cuales no no deben deben reacc reaccion ionar ar%%
l /resent /resente e articulo articulo /retend /retende e inter/re inter/retar tar
cromatogra+ía de /a/el es de ti/o lí-uido
un
cromatograma
de
una
corrida
!a
– lí-uido & se usa /ara sustancias sustancias mu& /olares 3amino,cidos & /roteínas%
Para la se/araci se/aración ón de amino,c amino,cidos idos /or
acetona & debe ser secado nuevamente
cromatog cromatogra+í ra+ía a de /a/el /a/el 3ascend 3ascendente ente se
/ara su /osterior an,lisis%
rere-uier uiere e
los los
sigu siguie ient ntes es
mate materi rial ales es
&
3. RESU RESUL LTADOS ADOS
reactivos:
-
Pa/el +iltro
Al reali#ar la cromatogra+ía cromatogra+ía de /a/el con
-
$uest $uestra ra 3ln 3ln de 8licin 8licina a Argin Arginina ina &
soluciones soluciones de amino,cidos se obtuvieron obtuvieron
-
-
-
Alanina Alanina
manc manc1a 1as s de colo colorr viol violet eta a las las cual cuales es
oluciones oluciones est,ndar est,ndar de amino,cidos amino,cidos
/resentaban ba.o /oder de resolución &a
0%9
%$-ue no se logró se/arar los amino,cidos
olvente 3900 /artes de n – butanol
de la mues muestr tra a /rob /roble lema ma & así así /ode /oder r
0 de ,cido +órmico & 2; de agua
di+ere di+erenci nciar ar sus sus com/o com/one nent ntes es de +orma +orma
'evel velador:
nin1idri idrin na
0%9<
en
cualitativa%
acetona%
-
C,mara cromatogr,+ica
n el an,l an,lis isis is de la mues muestr tra a 3ln 3ln de
-
=ubos ca/ilares
amino amino,ci ,cido dos s /ara /ara la ident identi+i i+ica cació ción n de
-
stu+a 900>C%
8lic 8licin ina a la dist distan anci cia a reco recorr rrid ida a /or /or el amino,cido amino,cido es de %@ cm mientras -ue el
Para la se/arac se/aración ión de los amino,c amino,cidos idos
solvente recorrió ; cm obteniendo así un
/or cromatogra+ía de /a/el se reali#ó un
'+ 0%7B /ara la 8licina en cambio /ara
corte de /a/el +iltro ? 5 4 cm en el cual se
la identi+icación de la Arginina la distancia
marcó marcó con l,/i# l,/i# 9cm en sus e5tremo e5tremos s
recorrida /or el amino,cido es de 4%cm
tom,ndola como línea de re+erencia /ara
mientras -ue el solvente recorrió ;cm /or
colocar las muestras a anali#ar%
lo -ue -ue el '+ 0%@B% Al com/arar los amin amino, o,ci cido dos s
de la mues muestr tra a con con los los
Posteriormente se a6adieron las muestras
est,ndares
en
com/ com/ar ar,n ,ndo dola las s
/resentaron manc1as a la misma altura
con con
los los
/atr /atron ones es de
8licina 8licina & Arginina Arginina 0%9$ 0%9$ res/ecti res/ectivame vamente nte
ambos
casos
se
del /a/el%
/ara /ara lueg luego o ser ser llev llevad ados os a la c,ma c,mara ra cromatogr,+ica -ue contenía el solvente
3. 3.11.
Anl! nl!ss!s "e res res# #l$a" l$a"%s %s..
de.ando -ue (ste ascienda /or ca/ilaridad 1asta 1asta -ue se deteng detenga% a% !uego !uego el /a/el /a/el
!os !os datos datos del del /rese /resente nte artícu artículo lo +uero +ueron n
+ilt +iltro ro debe debe ser ser seca secado do reve revela lado do /or /or
obtenidos
ba6ado
crom cromat atog ogr, r,+i +ica cas s
con
nin1idrina
al
0%9<
en
mediante en
/a/e /a/el% l%
/ruebas Una Una
ve# ve#
terminados
los
ensa&os
ba.o
los
&. CUES CUESTI TION ONAR ARIO IO
/ar,metr /ar,metros os &a estable establecido cidos s & reali#ar reali#ar la manc manc1a 1as s
seme.an#as en ' stable#ca di+erencias o seme.an#as
estric estrictas tas & manc manc1a 1as s de conce concentr ntrac ación ión
el ti/o de se/aración se/aración -ue se logra cuando
cono conoci cida da se /udo /udo dete determ rmin inar ar -ue -ue la
se a/lic a/lica a la t(cnic t(cnica a cromat cromatog ogr,+ r,+ica ica de
se/aración de los amino,cidos 38licina &
/a/el & de ca/a +ina%
com/ com/ar arac ació ión n
cual cualit itat ativ iva a
de
Arginina no +ue mu& e+iciente debido al
cromatog togra+ ra+ía ía de ca/a ca/a +ina +ina R$a((: !a croma
e+ecto de cola -ue se /rodu.o bien sea
/res /resen enta ta las las vent venta. a.as as de una una ma&o ma&or r
/or el inadecuado mane.o de la muestra
ra/ide# resolución & +acilidad de mane.o
o
se
en com/aración con la cromatogra+ía de
/resentan entre la +ase móvil D muestra &
/a/el% /a/el% n la cromatog cromatogra+í ra+ía a de /a/el se
+ase estacionaria%
/ued /uede e a/li a/lica carr gran grande des s vol volme mene nes s de
el
ti/o
de
interacciones
-ue
mue muestra tra Para
me.orar
estos
resultados
lo
-ue
/ermit rmite e
la
eluc lución ión
es
/osterior de un amino,cido en /articular
conveniente cambiar las concentraciones
/ara su /osterio /osteriorr /uri+ica /uri+icación ción & an,lisis an,lisis
de la +ase móvil /ara -ue el e+ecto de
+actor +actor -ue -ue tiene tiene gran gran im/ort im/ortan ancia cia en la
re/art re/arto o varíe varíe /ara /ara lo cual cual se /ued /ueden en
ide identi+i i+icac cación ión
de
util utili# i#ar ar +ase +ases s móvi móvile les s /ola /olare res s -ue -ue en
desconocido
de
algu alguno nos s caso casos s se usa usa como como +orm +orma a de
cromat cromatog ogra+ ra+ía ía de ca/a ca/a +ina +ina tiene tiene gran gran
se/aración% se/aración% n este caso a la +ase +ase móvil
ace/tación
se le /odría aumentar la concentración de
carac caracter teríst ística icas s como como la resolu resolució ción n del del
sust sustan anci cias as /ola /olare res s como como el agua agua n D
soluto soluto & la /osibili /osibilidad dad de re/roduc re/roducir ir los
buta butano nol l mien mientr tras as -ue -ue vari varian ando do el /E
resultados -ue se consideran de buenos
cambian las /ro/iedades el(ctricas -ue
a e5celentes casi todas las se/araciones
de/endiendo de/endiendo del amino,cido amino,cido & el solvente
se e+ectan con ra/ide# 30%; a 1%
un la
/or-ue
con constit titu&en &ente muestra%
combina
!a
las
se /roduce una se/aración determinada% es un +enómeno +enómeno de cola cola & como como ' GHue es Para Para am/lia am/liarr los los resul resultad tados os se /ued /uede e
/uede corregirse
utili#ar
bidimensional
R$a((: "ebido a -ue los absorbentes son
cambi cambian ando do los los siste sistema mas s de solven solventes tes
sustancias de naturale#a /olar en el caso
segn su /olaridad & su solubilidad solubilidad con la
de los solutos /olares a/arece un cierto
+ase móvil%
grad grado o de adso adsorc rció ión n -ue -ue ocas ocasio iona na la
la
corrida
a/arición de colas en las manc1as% in embargo este e+ecto de adsorción /uede
ser ser e5al e5alta tado do mini minimi mi#a #and ndo o a la ve# ve# el
)tras )tras aminas aminas disti distinta ntas s a
e+ecto e+ecto de la solubilid solubilidad ad utili#an utili#ando do +ases +ases
tambi(n reaccionan con nin1idrina dando
móviles /olares lo -ue se usa en algunos
un color a#ul /ero sin /roducir C) 2% Por
casos casos como +ormas de se/araci se/aración ón /or
lo tant tanto o la +orm +ormac ació ión n de C) 2 indica indica la
e.em/lo en la cromatogra+ía en /a/el de
/resencia de
amin amino, o,ci cido dos s en la -ue -ue se util utili# i#a a una una
& los /e/tido /e/tidos s tambi(n tambi(n reaccion reaccionan an /ero
solución acuosa de amoníaco como +ase
con ma&or lentitud -ue un
móvil%
3Ker +igura 9%
' scriba la reacción -ue ocurre entre la
"escriba -ue otras otras sustanci sustancias as /ueden /ueden ' "escriba
nin1idrina & los amino,cidos% 5/li-ue el
ser
+undamento de la reacción%
amino,cidos%
R$a((: !os !os amino amino,ci ,cido dos s /arti /artici/ ci/an an en
1an descr descrito ito otros otros reacti reactivo vos s R$a((: e 1an
muc1as
m,s
reacciones
en
interv intervien ienen en las +unci +uncion ones es
las
cuales
D amino
D
D amino,cido amino,cido
D amino,cido% l amoniaco
utili#adas
como
es/ecí+icos
amino,cidos
cu&o
D amino,cido% amino,cido%
revelados
/ara
de
algunos
uso
a&uda
carbo carbo5il 5ilo o & los los di+er di+eren entes tes gru/o gru/os s '% !a
signi+icativamente a su identi+icación%
reacción con la nin1idrina /roduce colores
!os di+erent di+erentes es reactivo reactivos s de locali#a locali#ación ción
-ue
la
/ued /ueden en a/lic a/licars arse e bien bien sea sea a disti distinto ntos s
cuanti cuanti+ic +icaci ación ón de los amino amino,ci ,cido dos% s% !a
cromatogramas o cuando se a/lican a un
nin1idrina nin1idrina descarbo5ila descarbo5ila /or o5idación o5idación de
solo cromato cromatogram grama a siguiend siguiendo o un orden orden
D amino,cidos a C) 2 JE & un alde1ído
dado /ara /revenir inter+erencias de un
con un ,tomo de carbono menos -ue el
reactivo /or otro%
amino,cido /recusor% !uego la nin1idrina
Algunos Algunos de los reactivos reactivos /ara la detección detección
sirven
como
redu reduci cida da reac reacci cion ona a
base
/ara
con con el amon amonia iaco co
colim(trica de los amino,cidos son:
liberado +ormando un com/le.o a#ul -ue absorbe al m,5imo la lu# a una longitud
-
Isatina: 'eacciona al calentar a 90;>c
de onda de ;70 nm%
F!. 1 Reacc!n "e #n a-!n%c!"% c%n la N!n!"r!na O R ) * + C + N*2 ) COO*
A-!n%c!"%
))
,
)) O
N!n!"r!na
O O*
))
O )) N +
l
O* )) O
* )) O
A/#l 0#r0re%
, RC* O , C O
2
duran durante te 2 ó minuto minutos s reacci reaccion ona a sobre sobre
-
Para reali#ar una me.or cromatogra+ía
todo con la /iolina /iolina /ero tambi(n tambi(n con los
en /a/el de amino,cidos se sugiere
amino,cidos -ue tienen a#u+re con los
utili ili#ar #ar
arom, arom,tic ticos% os% Color Color /rodu /roducid cido o /ro: /ro: a#ul a#ul
corridas bidimensionales /ara -ue la
oscuro E & P: a#ul L verde Ala: gris L a#ul:
se/aración sea e+iciente%
As/: a#ul a#ul claro: 8lu: 8lu: /ardo%
-
+ases ses
móv móvile iles
/olare lares s
&
!a cromatogra+ía /resenta una valiosa a&ud a&uda a al an,li an,lisis sis de alimen alimentos tos de
-
1ilic1: 'eacciona 'eacciona con los índoles las
sang sangre re a la medi medici cina na
amidas arom,ticas los urerdos% e
/etrolí+eros & +isión radioactiva%
/rod /roduc ucto tos s
usa usa des/ des/u( u(s s de la nin1 nin1id idri rina na en
5I5LIOGRAFIA
tinciones mlti/les% =r & P: rosa L ro.o%
-
Paul&:
'eacciona
con
algunos
Eolme Eolme "% *io-uími *io-uímica ca analític analítica% a% d Acribia %A %A 9?@7
imidosol imidosoles es com/uest com/uestos os +enólico +enólicos s sales de amonio – su color varía entre ro.o
–
marrón
–
amarillo%
-
Usar
*o1in o1insN sNii
–
'obe 'obert rt%%
*io*io-uí uími mica ca –
Pearson ducación ;>a d% 9??@%
des/ des/u( u(s s de la nin1 nin1id idri rina na isat isatin ina a o 1rlic1 en tinciones mlti/les%
-
E!: ro.o = & !: naran.a%
$urra $urra& & – 'obe 'obert rt – *io*io-uí uími mica ca de Ear/e Ear/err d el manua manuall mode moderno rno %A% %A% 9>a d% 9??4%
-
Cianuro nitro/rusiato: 'eacciona con algunos algunos amino,ci amino,cidos dos -ue contien contienen en a#u+re%
u
color
se
-
desarrolla
"ía#
uan
–
*io-uímica%
Interamericana% $cBraa Eill% egunda
alrededor de 0 minutos%
d% 9??;%
C M cistina: /r/ura%
-
4. CONC CONCLU LUSI SION ONES ES
Carreras !uis – $(todos modernos de An,lisis
Huímico
de
carnes
&
/roductos c,rnicos% d% Acribia% 9?7%
-
!a crom croma atogr togra+ a+ía ía de /a/e /a/ell es un m(todo m(todo de se/araci se/aración ón mu& sencillo sencillo r,/ido & económico%
ANE6O A. CROMATOGRAFIA CROMATOGRAFIA EN PAPEL PARA SEPARACI7N DE AMINOACIDOS AMI NOACIDOS PROCEDIMIENTO
O1atman J>9
C%r$e "el Pa03l
Filtro ? 4 cm
$arcado de Puntos 9 cm !íneas de re+erencia
A0l!cac!n "e la -#es$ra
": 0; cm =ubos ca/ilares est,ndares
Formación del cilindro
C-ara cr%-a$%r8!ca $arca alcan#ada /or el solvente
Seca"% Revela"%
Jin1idrina en acetona 09<
Seca"% A/arición de manc1as manc1as
C%-0arac!n e !"en$!8!cac!n Clc#l%s
st,ndares
'+ s
C%ncl#s!%nes e !n$er0re$ac!%nes
