UNIVERSIDAD “ALAS PERUANAS” Facultad de Medicina Humana y Ciencias de la Salud Escuela Académico Profesional de Tecnología Médica Área de Laboratorio Clínico y Anatomía Patológica TEMA:
CROMATOGRAFÍA DOCENTE: Lic. Clovis Aguinaga
INTEGRANTES:
Córdova Ramírez, Carmen Violeta Cód: 2010211199
Vicuña Ubillus, Janet Del Pilar
ASIGNATURA:
Cód: 2010211192
QUÍMICA
“Año del Centenario de Machu Picchu para el Mundo” 0
INTRODUCCION
El presente trabajo trata sobre definiciones, tipos y términos en cromatografía, método muy utilizado en separación de un analito o varios analitos que contienen en una muestra. Este método es muy empleado para identificar o cuantificar analitos muy empleado en la industria farmacéutica, industria alimentaria, cosmética, en investigación de medicina forense, entre otros..
Ningún otro método de separación es tan potente y de aplicación tan general como la cromatografía.
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CROMATOGRAFIA
1.-DEFINICION
El termino cromatografía deriva del griego cromo = color, grafico = escrito. Descubiertas por el botánico MICHEL TSWETT quien separo pigmentos de planta en columnas de oxido de calcio. Según define la IUPAC, la cromatografía es un método, usado primariamente para la separación de los componentes de una muestra en la cual los componentes se distribuyen en dos fases, una de las cuales es estacionaria, (fase estacionaria) mientras la otra se mueve (fase móvil), ver figura 1.
ESQUEMA CROMATOGRAFICO
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Fig. 1
1.1 OBJETIVO DE LA CROMATOGRAFIA.- El objetivo principal
de un estudio cromatografía es lograr la separación de todos los componentes en una muestra, para ello es necesario jugar con una serie de factores cromatograficos, es por ello que es necesario conocer como están relacionados los diferentes factores experimentales con las ecuaciones cromatograficas.
1.2.- MODALIDADES DE CROMATOGRAFIA.
A pesar de evitar las definiciones, es claro que las clasificaciones permiten un estudio mas ordenado de tópicos. Así, clasificamos las modalidades cromatograficas en función de varios parámetros. -La naturaleza de la fase móvil.- Si la fase móvil es un gas la
modalidad cromatografica se denomina gaseosa (GC) y si es un liquido, cromatografía liquida (LC) a este ultimo grupo pertenecen la cromatografía en capa delgada (TLC) la cromatografía liquida en columna abierta, y la cromatografía liquida de alta performance (HPLC véase fig. 4), cromatografía en papel. A pesar de las diferencias entre las distintas modalidades, los principios que gobiernan la separación son los mismos en todos los casos. La cromatografía gaseosa se emplea para separar mezclas que contienen compuestos orgánicos volátiles pero suele presentar grandes dificultades si las sustancias analizar no son volátiles, si descomponen a altas temperaturas o poseen alto peso molecular. Se ha estimado que solo un 20% de las sustancias orgánicas conocidas pueden separarse por GC sin tratamiento previo. La diferencia fundamental entre HPLC y GC se encuentra en el tipo de detectores y en la influencia de la fase móvil. En GC es muy simple encontrar detectores que diferencien la muestra de la fase móvil (un gas inerte) esto no es tan simple en HPLC, ya que la fase 3
móvil no solo no es inerte si no que en su masa en sensiblemente superior. Por ese motivo cualquier dispositivo que mida una propiedad física del soluto (conductividad térmica, ionización en una llama, captura de electrones) es apropiado como detector de GC pero resulta de difícil aplicación en HPLC (aunque llegaron a comercializarse algunos dispositivos de ionización de llama, aparentemente con poco éxito) . En HPLC es necesario encontrar dispositivos que diferencien el soluto en solución de la fase móvil. Los mas difundidos son los detectores UV y en menor proporción los de fluorescencia, el de índice de refracción y el electroquímico. La otra diferencia fundamental entre la GC y la HPLC se refiere ala influencia de la fase móvil en la separación. En la GC la fase móvil es un simple carrier (transportador) del soluto y prácticamente o influye en la separación. El tipo de gas a utilizar se selecciona únicamente en función del detector a emplear. Por el contrario en HPLC la fase móvil es el parámetro fundamental que gobierna la separación en consecuencia en GC se necesitan muchas columnas para abarcar el rango de separaciones posibles, mientras que en HPLC con una sola columna es posible separa sustancias polares, iónicas, ionizables, y no polares simplemente modificando la composición de la fase móvil. Si bien la resolución puede ser mayor con los materiales actuales de HPLC, la eficiencia global es mayor en GC dado que la menor viscosidad d la fase móvil, un gas permite usar columnas mucho mas largas. Sin embrago la selectividad aportada por la amplia variedad de solventes aptos para ser empleadas como fase móvil en HPLC le otorga mucho mayor versatilidad. La mayor deuda de la HPLC con el analista es, tal ves, la existencia de un detector altamente sensible y universal.
-La naturaleza de la fase estacionaria.- Si la fase estacionaria es
un sólido y la fase móvil es un líquido la cromatografía se denomina cromatografía líquido - solida (LSC). Análogamente existirá una cromatografía liquida - liquida (LLC), gas – liquido (GLC) y gas sólido (GC). 4
-El fenómeno que ocurre dentro de la columna.- Así,
la cromatografía puede clasificarse en modalidades de afinidad y por tamaño molecular. Entre las primeras se encuentra la cromatografía en fase normal, en fase ligada, y la de intercambio iónico. Entre las segundas se encuentra la GPC y GFC. En las modalidades de afinidades el analito interactúa directa o indirectamente, a través del solvente, con la fase estacionaria, mientras que en las separaciones por tamaño molecular no existen (al menos teóricamente) ninguna interacción con la fase estacionaria. Si la cromatografía seleccionada para una separación no destruye la muestra (TLC, HPLC o columna abierta) es posible es posible recuperar el analito separado de su matriz ala salida de la columna. Aumentando la cantidad de muestra es posible obtener desde ug hasta kilogramos de una sustancia pura en una sola corrida. Evidentemente las escalas de trabajo son diferentes, pero las bases que gobiernan a la separación son exactamente las mismas. Así es posible definir la cromatografía analítica en el rango de pg. hasta ug. un rango semipreparativo que abarca desde los ug hasta los gramos y un rango preparativo, que comprende las separaciones de analitos mayores que el gramo. -La
cantidad
de
muestra
aplicada.-
2.- CLASIFICACION DE LAS TECNICAS CROMATOGRAFICAS
2.1.-LA CROMATOGRAFIA EN PAPEL.
Es un proceso muy utilizado en los laboratorios para realizar análisis cualitativos ya que pese a no ser una técnica muy potente no requiere de ningún tipo de equipamiento. La fase estacionaria está constituida simplemente por una tira de papel de filtro. La muestra se deposita en un extremo colocando pequeñas gotas de la solución y evaporando el disolvente. Luego 5
el disolvente empleado como fase móvil se hace ascender por capilaridad. Esto es, se coloca la tira de papel verticalmente y con la muestra del lado de abajo dentro de un recipiente que contiene fase móvil en el fondo. Después de unos minutos cuando el disolvente deja de ascender o ha llegado al extremo se retira el papel y seca. Si el disolvente elegido fue adecuado y las sustancias tienen color propio se verán las manchas de distinto color separadas. Cuando los componentes no tienen color propio el papel se somete a procesos de revelado. Hay varios factores de los cuales depende una cromatografía eficaz: la elección del disolvente y la del papel de filtro. Dentro de la cromatografía en papel tenemos: - La Cromatografía en papel descendente.- En done la fase móvil
fluye hacia abajo en la hoja cromatografica. El equipo esencial para este tipo de cromatografía comprende de lo siguiente: Una cámara hermética al vapor provista de entradas para agregar el disolvente o para liberar la presión interna. Preferentemente, la cámara se construye de vidrio, acero inoxidable o porcelana y esta diseñada de manera que se pueda observar el progreso de la corrida cromatografica sin abrir la cámara. -La cromatografía en papel ascendente.- El borde inferior de la hoja (o tira) se sumerge en la fase móvil para permitir que la fase móvil ascienda en la hoja cromatografica por capilaridad. El equipo esencial es el mismo que en la cromatografía descendente.
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2.2.- CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA (TLC).
La cromatografía en capa fina se basa en la preparación de una capa, uniforme, de un absorbente mantenido sobre una placa, la cual puede ser de vidrio, aluminio u otro soporte. Los requisitos son un absorbente, placas, un dispositivo que mantenga las placas durante la extensión, otro para aplicar la capa de absorbente, y una cámara (cuba) en la que se desarrollen las placas cubiertas.
La fase móvil es líquida y la fase estacionaria consiste en un sólido. La fase estacionaria será un componente polar y el eluyente será por lo general menos polar que la fase estacionaria, de forma que los componentes que se desplacen con mayor velocidad serán los menos polares. Cromatografía capa fina
F a s e M ó v i l 7
2.3.- CROMATOGRAFIA EN COLUMNA.
Se emplea para la separación de mezclas o purificación de sustancias a escala preparativa. Como fase estacionaria se usa, generalmente, gel de sílice o alúmina dentro de una columna. La elección del disolvente es crucial para una buena separación. Dicho disolvente pasa a través de la columna por efecto de la gravedad o bien por aplicación de presión (cromatografía flash). La columna se prepara mezclando el soporte con disolvente y se rellena la columna poniendo en el fondo de ésta un poco de algodón o lana de vidrio, para evitar que la silica o la alúmina queden retenidas en la columna y que el disolvente se enrasa hasta el nivel del soporte. A continuación se introduce la muestra por la parte superior de la columna y se eluye con el disolvente elegido, recogiéndose por lo general en tubos de ensayo. Una columna de cromatografía es un tubo de vidrio relleno con una sustancia sólida de propiedades adsorbentes constituida por pequeñas partículas: gel de sílice y alúmina son las más usadas, véase fig.3. Este relleno es lo que se conoce en cromatografía como la fase estacionaria. A través de la columna se hará pasar una corriente de un disolvente o mezcla de disolventes denominada eluyente y/o fase móvil. La mezcla de compuestos a separar se disuelve en una pequeña cantidad de disolvente y se coloca sobre el adsorbente, en la parte superior de la columna, quedando adsorbida por el mismo. A continuación se pasa un flujo de eluyente a través de la columna. Los compuestos constituyentes de la mezcla son arrastrados por el eluyente a su paso, haciéndoles avanzar a lo largo de la columna. Sin embargo, no todos los compuestos avanzan a la misma velocidad, y esta es precisamente la clave de la cromatografía. Algunos compuestos se ven más fuertemente retenidos por el adsorbente (fase estacionaria) y por lo tanto avanzarán más despacio. Por el contrario, otros apenas son retenidos y avanzarán a mayor velocidad. 8
CROMATOGRAFIA EN COLUMNA
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2.4.-CROMATOGRAFIA DE GASES (CG).
La Fase Móvil es un Gas (llamado Gas Portador o Acarreador) y la Fase Estacionaria puede ser un sólido (Cromatografía Gas-Sólido) o una Película de líquido de alto punto de ebullición (Generalmente Polietilén-Glicol o Silicón) recubriendo un sólido inerte (Cromatografía Gas-Líquido). Diagrama de un Cromatógrafo de Gases(CG). Los compuestos que se pueden separar por cromatografía de gases deben ser Volátiles y Térmicamente Estables. Ilustración en donde se visualizan los tipos de Cromatografía más comunes.
Cromatografía de gases (Gas-Líquido
Distribución de un componente entre una fase móvil gaseosa y una líquida inmovilizado sobre la superficie de un sólido inerte. Componentes básicos - Gas portador según detector (He, Ar, N2, CO2, H2)
- Sistema de inyección de muestra - Columnas
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2.5.-CROMATOGRAFIA DE LIQUIDOS DE ALTA PRESION (HPLC).
A veces llamada Cromatografía de líquidos de alta resolución, es una técnica de separación basada en una fase estacionaria sólida y una fase móvil liquida. Las separaciones se logran por procesos de partición. Adsorción o intercambio iónico, según el tipo de fase estacionaria empleada. El HPLC tiene ventajas distintivas sobre la cromatografía de gases para el análisis de compuestos orgánicos. Los compuestos se van a analizar se disuelven en un disolvente adecuado y la mayoría de las separaciones tienen lugar a una temperatura ambiente. Entre ellas tenemos:
- Cromatografía Liquido – Liquido (LLC) o de partición.
En esta modalidad, las moléculas de soluto se distribuyen entre dos líquidos: uno es en fase móvil, y el otro en fase estacionaria, que se encuentra homogéneamente dispersa en un soporte sólido, finamente dividido. El desarrollo de este método le valió a Martín y Singe la obtención del premio Nóbel de química de 1952. Sin embargo, varios, inconveniente, especialmente derivados del tipo de fijación de la fase estacionaria al soporte (meramente mecánica) se sumaron para que este método haya sido totalmente desplazado. Estos inconvenientes se debía la necesidad de pre saturar la fase móvil con fase estacionaria, la necesidad de disolver la muestra en fase móvil saturado con fase estacionaria, la imposibilidad de efectuar gradientes de elución, de programar caudales o temperatura para evitar el desprendimiento de fase estacionaria, etc. De todos modos las columnas distaban mucho de ser estables y los resultados reproducibles al nivel que hoy se pretende. - Cromatografía de Fase Ligada (BPC).
Las virtudes de la LLC eran claras, tanto como sus limitaciones. Por ello resulta también razonable pensar que reemplazando el tipo de unión de la fase estacionaria a su soporte haciéndola perdurable por medio de una unión química covalente, el éxito del material 11
estaría asegurado. Así, prácticamente el 90% de las separaciones cromatograficas modernas se efectúan sobre material químicamente modificado, el cual permite optar según el reactivo empleado para su fabricación, entre materiales altamente hidrofóbicos o altamente hidrofilicos, con un amplio rango de polaridad y de selectividad: octadecilo, octilo, hexilo, butilo, etilo, ciano, diol, fenilo, amino, nitro, amonio, amonio cuaternario, restos sulfónico, etc. -Cromatografía de Intercambio Iónico (IEC). En este caso se emplean rellenos en los cuales la partícula esta constituido por un polímero o por silica gel, en cada caso unida a un grupo funcional anionico o cationico (típicamente sulfónico para el intercambio de cationes amonio cuaternario para el intercambio de aniones). La selección del tipo grupo funcional permite escoger entre intercambiadores débiles y fuertes.
-Cromatografía de Exclusión de Tamaño (SEC).
Esta modalidad emplea materiales de porosidad controlada que funcionan con un filtro o tamiz y clasifica las moléculas de la muestra según un orden decreciente de tamaño molecular (las moléculas mas grandes son la s primeras en eluir, y las pequeñas son las ultimas). Si se dispone de estándares apropiados, de peso molecular adecuado (proteínas para el análisis de proteínas, dextrano para el ensayo de dextranos, etc.), puede evaluarse el peso molecular de un compuesto desconocido, o bien la distribución de pesos moleculares de un polímero sintético.
GLOSARIO 12
Fase estacionaria.- Puede ser un sólido un líquido retenido sobre
un sólido o un gel. La fase estacionaria puede estar extendida como una capa o distribuida como una película, etc. Fase móvil.- Puede ser liquida o gaseosa. Es el medio q va a
transportar sobre la fase estacionaria los analitos. Analito.- Es la substancia que se va a separar durante la
cromatografía. Cromatografía analítica.- Se emplea para determinar la existencia
y posiblemente también la concentración de un analito en una muestra. Es una fase estacionaria que se une de forma covalente a las partículas de soporte o a las paredes internas de la columna. Fase enlazada.-
Cromatograma.- Es el resultado gráfico de la cromatografía. En el
caso de separación óptima, los diferentes picos o manchas del Cromatograma se corresponden a los componentes de la mezcla separada.
En el eje X se representa el tiempo de retención, y en el eje Y una señal (obtenida, por ejemplo, a partir de un espectrofotómetro, un espectrómetro de masas o cualquier otro de los diversos detectores) correspondiente a la respuesta creada por los diferentes analitos existentes en la muestra. En el caso de un sistema óptimo, la señal es proporcional a la concentración del analito específico separado.
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Es el equipo que permite una separación sofisticada. Por ejemplo, un cromatógrafo de gases o un cromatógrafo de líquidos. Cromatógrafo.-
Tiempo de retención.- Es el tiempo característico que tarda un
analito particular en pasar a través del sistema (desde la columna de entrada hasta el detector) bajo las condiciones fijadas. Muestra.- Es la materia que va a ser analizada en la cromatografía.
Puede consistir en un simple componente o una mezcla de varios. Cuando la mezcla es tratada en el curso del análisis, la fase o fases que contienen los analitos de interés es llamada igualmente muestra mientras el resto de sustancias cuya separación no resulta de interés es llamado residuo. Soluto. Es cada uno de los componentes de la muestra que va a
ser separado. Disolvente es toda sustancia capaz de solubilizar a otra, y
especialmente la fase líquida móvil en cromatografía de líquidos.
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BIBLIOGRAFIA
-Introducción al HPLC Aplicación y Práctica: Oscar Alberto Quattrocchi.
-Farmacopea de los Estados Unidos de América. USP Edición 33
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INDICE
Introducción………………………………………………… pág. 1, Cromatografía 1.-Definición…………………………………………………..pág. 2 1.1 Objetivos de la cromatografía………………………….pág. 3 1.2 Modalidades de la cromatografía. -La naturaleza de la fase móvil -La naturaleza de la fase estacionaria………………… …pág. 4 -El fenómeno que ocurre dentro de la columna………….pág. 5 -Cantidad de muestra aplicada 2.-Clasificación de las técnicas cromatograficas 2.1 Cromatografía en papel -Cromatografía en papel descendente…………………….pág. 6 -Cromatografía en papel ascendente 2.2 Cromatografía en capa fina…………………………......pág. 7 2.3 Cromatografía en columna……………………………...pág. 8 2.4 Cromatografía de gases………………………………...pág. 10 2.5 Cromatografía de líquidos de alta presión HPLC…….pág. 11 - Cromatografía de liquido líquido (LLC) - Cromatografía fase ligada (BPC) -Cromatografía de intercambio iónico……………………...pág. 12 -Cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) Glosario……………………………………………………..…pág. 13
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Bibliografía………………………………………………….….pág. 15 Índice…………………………………………………………...pág.16.
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