PENDAHULUAN Pada umumnya segala metode uji toksikologi dapat dibagi menjadi dua golongan. Golongan pertama terdiri dari uji toksikologi yang dirancang untuk mengevaluasi keseluruhan efek umum suatu senyawa pada pada hewan eksperimental. Pada dasarnya secara individu uji golongan ini berbeda antara satu dengan yang lainnya dalam kaitannya dengan lamanya uji berlangsung dan luasnya evaluasi kritis pada hewan eksperimental terhadap toksisitas umum. Uji- uji ini diidentifikasi sebagai uji toksisitas akut, uji toksisitas subakut, dan uji toksisitas kronik. Golonngan yang kedua dari uji toksikologi terdiri dari uji toksikologi yang dirancang untuk mengevaluasi dengan rinci tipe toksisitas spesifik. Uji umum toksisitas subkronis dan uji toksisitas kronis tidak dapat mendeteksi segala bentuk toksisitas, tetapi uji- uji tersebut mungkin mengungkapkan beberapa toksisitas spesifik dan menunjukkan perlunya studi yang lebih terperinci. Termasuk uji toksisitas spesifik adalah: 1. uji toksisitas yang menentukan efek suatu zat dengan adanya zat tambahan yang mungkin secara bersama- sama di jumpai, dan dimana toksisitas dari suatu zat atau yang lain di perkuat yaitu uji potensi. 2. Uji toksisitas untuk menentukan efek atas janin (fetus) pada hewan bunting, yakni uji teratogenik. 3. Uji toksisitas untuk menentukan efek atas kemampuan reproduksi hewan eksperimental , yakni uji reproduksi. 4. Uji toksisitas untuk menentukan efek pada sistem genetika, yakni uji mutagenik. 5. Uji toksisitas untuk menentukan kemampuan zuntuk menimbulkan tumor, yakni uji kemampuam tumorgenitas dan karsinogenitas. 6. Uji toksisitas untuk menentukan efek lokal zat bilamana zat- zat dipakai secara langsung pada kulit dan mata. 7. Uji toksisitas untuk menetapkan efek zat atas berbagai macam tingkah laku hewan, yakni uji perilaku.
DEFINISI A. Definisi Karsinogenik
Istilah karsinogenik ini biasanya didefinisikan sebagai induksi atau peningkatan neoplasia oleh zat-zat kimia. Meskipus secara etimologi arti tetapnya adalah induksi karsinoma, istilah ini digunakan secara luas untuk pembentukan tumor. Dengan kata lain istilah ini mencakup tidak hanya keganasan epitelial ( karsinoma ) tetapi juga tumor ganas masenkim ( sarkoma ) dan tumor-tumor jinak. Tumor jinak dimasukkan disini karena tidak ada karsinogen yang menimbulkan tumor jinak. Secara umum telah disetujui ( misalnya WHO,1969) bahwa respon suatu organisme terhadap karsinogen dapat berupa satu atau beberapa reaksi berikut ini : 1. Meningkatkan frekuensi satu atau beberapa jenis tumor yang juga muncul dalam kelompok pembanding. 2. Perkembangan tumor yang tidak tampak dalam kelompok pembanding. 3. Munculnya tumor lebih awal dari pada kelompok pembanding. 4. Lebih tingginya jumlah tumor pada masing-masing hewan uji dibanding dengan hewan pembanding ( Frank, 2006 ). Uji kekarsinogenikan suatu senyawa dibagi menjadi dua jenis, yakni uji jangka panjang dan uji jangka pendek. Pada dasarnya, uji jangka panjang dilakukan dengan memberikan senyawa uji pada suatu hewan uji selama masa hidupnya. Pada masa akhir uji, dilakukan nekropsi dan pemeriksaan histologi untuk menegaskan adan ya pertumbuhan tumor. Sedangkan dalam uji jangka pendek hasil akhirnya bukan perwujudan tumor melainkan untuk mendeteksi karsinogen kimia (WHO,1978). B. Definisi Mutagenesis
Mutagenesis adalah induksi terhadap berbagai perubahan kadar informasi (DNA) dari suatu organisma atau sel yang tidak disebabkan oleh proses rekombinasi normal ( Loomis,1978). Uji kemutagenikan di tujukan untuk menentukan pengaruh suatu senyawa terhadap sistem kode genetik. Mutagen adalah suatu substansi yang dapat menimbulkan perubahan DNA. Sedangkan mutasi, adalah suatu perubahan yang dapat menurun dalam urutan atau jumlah nukleotida. Selanjutnya dikenal dua jenis perubahan genetik, yang dapat terjadi secara spontan atau karena induksi fisik dan zat kimia, yakni mutasi tempat dan
penyimpangan kromosom ( mutasi struktural ). Mutasi tempat adalah perubahan yang terjadi dalam pasangan nukleotida tunggal tertentu dalam diri molekul DNA. Penyimpangan kromosom mungkin berupa pecahnya kromosom dan penyusunan ulang kromosom ( mutasi struktural ), atau perubahan jumlah kromosom. Perubahan-perubahan ini, dapat dideteksi dengan cara pemeriksaan sitologis terhadap kromosom-kromosom itu. Uji kemutagenikan suatu senyawa dapat dilakukan secara in vitro maupun in vivo ( Donatus, 2005) Uji kemutagnikan in vitro dikerjakan dengan subyek uji bakteri tertentu. Bakteri merupakan sistem biologi yang sederhana sehingga memungkinkan analisis yang rinci terhadap komposisi genetiknya. Uji kemutagenikan in vivo dapat dilakukan dengan mengikuti tiga tata cara yang telah direkomendasikan, yakni penetapan letal dominan (the dominant lethal assay), penetapan inang penengah (the host-mediated assay), dan sitogenetikain vivo (in vivo cytogenetics) (Donatus,2005).
Uji karsinogenik Tujuan dan sasaran uji
Penelitian ini bertujuan untuk memperoleh informasi pasti tentang efek karsinogenik berbagai zat kimia pada hewan coba( Frank, 2006 ). Tata cara pelaksanaan
1. Pemilihan hewan uji Tikus dan mencit biasanya dipilih karena ukuranya yang kecil, masa hidup pendek, mudah didapat, dan banyaknya data mengenai responnya terhadap karsinogen lain. Marmut juga digunakan terutama dalam penelitian tentang kanker kandung kemih, payudara, saluran cerna dan saluran nafas. Anjing digunakan karena respon positifnya terhadap 4-aminobinefil dan 2-naftilamin dan primata bukan manusia digunakan karena tingkat filogenetiknya yang tinggi. Tetapi penggunaanya terbatas karena ukuranya besar dan usianya relatif panjang sehingga membutuhkan pajanan zat kimia selama 7-10 tahun ( Frank, 2006 ). 2. Pengelompokkan hewan uji Kelompok pembanding yang tanpa obat terdiri atas jumlah hewan yang sama besar atau lebih besar dari setiap kelompok perlakuan. Selain kelompok pembanding negatif , harus diikutsertakan juga kelompok lain yang diberi zat yang telah diketahui bersifat karsinogenik pada dosis tertentu. Pembanding positif membuat hasil uji lebih handal karena bertindak sebagai bukti sensitifitas kelompok hewan yang dipakai, disamping sebagai bukti bahwa fasilitas dan prosedur dalam laboratorium itu telah memadai. Kelompok pembanding ini
kurang lebih juga akan menunjukkan potensi relatif zat kimia yang diuji. Bila akan digunakan suatu pelarut misalnya aseton atau dimetilsulfoksid, efek yang mungkin timbul juga harus diuji dalam sekelompok hewan. 3. Dosis Pada uji karsinogenisitas ini biasanya dipakai 2 atau 3 tingkat dosis, selain itu diikutkan juga kelompok pembanding. Dosis dipilih berdasarkan penelitian jangka pendek dan data metabolisme agar dosis cukup tinggi untuk menghasilkan sedikit tanda toksisitas. Tetapi tidak sampai memperpendek masa hidup hewan-hewan itu. Dua dosis yang lebih rendah biasanya ditentukan sepersekian dari dosis tertinggi ( misalnya ½ atau ¼ ) dan diharapkan akan memungkinkan hewan-hewan itu terus hidup dalam keadaan sehat atau sampai tumor muncul. Dosis maksimal yang dapat ditoleransi biasanya dipakai sebagai dosis yang tinngi. Ini diperhitungkan dari penelitian 90 hari dan didefinisikan sebagai dosis yang tidak akan menimbulkan toksisitas secara morfologi sedemikian besar sehimngga mempengaruhi interpretasi penelitian jangka panjang, dan tidak merupakan bagian yang begitu besar dalam diet hewa itu sehingga mengakibatkan ketidak seimbangan gizi( U. S. ISGC, 1986).
4. Pengamatan
Berat badan dan konsumsi makanan Diketahui berat badan dan konsumsi makanan memungkinkan kita menghitung asupan kimia dalam mg/kg BB. Selain itu, BB merupakan petunjuk peka untuk status kesehatan hewansehingga harus diukur setiap minggu selama tiga bulan pertama, ketika hewan itu sudah tumbuh dan setiap dua minggu seelah itu
Pengamatan umum Hewan harus diamati setiap hari untuk melihat ada tidaknya hewan yang mati atau sakit. Hewan yang mati atau sakit harus disingkirkan dari kandang untuk diperiksa secara makro dan mikroskopis bila keadaan jaringa memungkinkan. Hewan yang sakit harus diratuh dalam kandang tersendiri sebagai karantina dan untuk mencegah kanibalisme. Kalau ada indikasi, hewan itu boleh diobati, tetapi setiap terapi arus dicatat.
Pengobatan
jangka
panjang
harus
dihindari
untuk
menyingkirkan
kemungkinan pengaruhnya terhdap zat yang sedang diuji. Mulanya, letak,ukuran, dan pertumbuhan setiap masa jaringan yang aneh dan tanda-tanda toksisitas serta efek farmakologi harus diperiksa dengan cermatt dan dicatat.
Uji laboratorium
Berbeda dengan penelitian toksisitas jangka pendek dan panjang yang semua toksiknya harus diteliti, tujuan utama penelitian karsinogenisitas adalah menentukan aktifita karsinogen suatu zat kimia.
Pemerikaan pasca mati Semua hewan yang ditemukan mati atau sekarat harus diperiksa secara makroskopik melalui autopsi. Hewan yang bertahan hidup pada akhir penelitian kemudian dibunuh dan diperika. Disamping itu, sejumlah alat tubuh harus ditimbang, termasuk hati, ginjal, jantung, testes dan otak. Pemeriksaan mikroskopis harus dilakukan pada semua pertumbuhan tumor dan semua jaringan yang scara mekroskopis menunjukkan kelainan fisik.
Pelaporan tumor Beberapa istilah yang sering dipakai untuk menjelaskan tumor misalnya hepatoma. Hal-hal yang perlu dicatat dengan munculnya karsinogenesis yaitu jumlah berbagai jenis tumor baik jinak maupun ganas ataupun tumor yang tidak normal, jumlah hewan yang mengandung tumor, jumlah tumor pada setiap hewan, permulaan munculnya tumor bila dapat ditentukan.
Analisis dan evaluasi Evaluasi Karsinogenik a. Penilaian Pendahuluan
Berbagai jenis informasi dapat digunakan dalam evaluasi pendahuluan mengenai potensi karsinogeniksuatu zat kimia. a. Struktur Kimia Sejumlah zat kimia diketahui bersifat karsinogenik. Suatu daftar karsinogenik manusia yang dikenal dan dicurigai disajikan dalam apendiks 7-1. Selain itu, sejumlah besar zat kimia telah terbukti bersifat karsinogenik pada hewan. Zat kimia yang strukturnya mirip dengan salah satu karsinogen/ mutagen itu tidak selalu bersifat karsinogenik ; tetapi zat kimia tersebut harus diberi prioritas utama dalam program pengujian karsinogenisitas. Faktanya, struktur kimia tertentu memang terbukti berkolerasi dengan karsinogenesitas (Ashby dan Tennant, 1988). b. Mutagenesis Pada dasarnya , zat mutagenik menghasilkan perubahan genetik yang diturunkan lewat pengaruhnya terhadap DNA. Jadi cara kerjanya mirip dengan cara kerjanya
mirip dengan cara kerja karsinogen genotoksik. Uji mutagenesis juga memberi informasi mengenai cara kerja disamping informasi apakah aktivasi metabolik dibutuhkan untuk mutagenesis.Dilain pihal, hasil negatif tidak membuktikan keamanan suatu zat kimia. c. Uji Karsinogenisitas Terbatas Hasil akhir uji ini adalah pembentukan tumor. Karena itu, zat kimia tertentu ,misalnya kokarsinogen yang memberi hasil negatif dalam uji mutagennesis, dapat positif dalam uji ini. Hasil positif pada lebih dari satu uji karsinogenisitas terbatas ini dapat dianggap sebagai bukti kualitatif yang pasti tentang karsinogenisitas. b. Penilaian Definitif
Data penelitian karsinogenisitas jangka panjang yang dirancang dengan baik dan dilaksanakan dengan tepat biasanya memberikan suatu dasar yang kuat untuk menilai potensi karsinogen. a. Pertimbangan Umum Hasil penelitian ini biasanya lebih dapat dipercaya daripada hasil uji saring cepat. Tetapi kepastian hasil bergantung pada sejumlah faktor, seperti ukuran dosis yang diberikan. Kecermatan pemeriksaan postmortem juga amat berperan. Ini berlaku untuk pemeriksaan makroskopik dan mikroskopik. Tumor dalam jaringan dan organ dapat terlewatkan kalau hanya diperiksa sambil lalu, mungkin diperlukan teknik khusus untuk pemeriksaan organ tertentu. Kejadian yang muncul bersamaan harus dicari dan dicatat ada atau tidaknya. b. Insidens Tumor Bentuk yang paling biasa dari karsinogenik adalah peningkatan jumlah hewan yang mempunyai tumor. Munculnya tumor yang tidak biasa merupaka peristiwa penting kalau jumlahnya cukup banyak, bila hanya satu atau hanya sedikit yang dideteksi, dibutuhkan pemeriksaan kritis lebih jauh. Memendeknya masa laten dengan mudah terlihat pada tumor kulit dan tumor subkutan. Masa laten tumor viseral, pada prakteknya, sama dengan masa hidup hewan itu karena tumor umumnya baru di diagnosis pasti pada saat autopsi. Tumor pada hewan coba mungkin tidak berada dalam tahap perkembangan yang sama. Tumor yang sama jenisnya tetapi berbeda tahapnya harus ditabulasi secara terpisah, tetapi kemudian harus digabungkan untuk analisis statistik.
c. Hubungan Dosis-Respons Biasanya, hubungan dosis-respons yang positif akan kentara. Namun, dalam kelompok dosis tinggi insidens tumor mungkin lebih rendah. Fenomena ini biasanya terjadi akibat sedikitnya hewan yang dapat hidup karena pengaruh efek-efek toksik zat kimia. d. Reprodusibilitas Hasil Suatu karsinogenisitas lebih dapat dipercaya kalau hasil yang serupa diperoleh pada strain hewan lain. Berulangnya hasil pada spesies lain ini bahkan lebih bermakna. Akan tetapi, kalau diperoleh hasil negatif pada spesies lain, fakta ini tidak dapat menghapuskan penemuan yang positif, melainkan menunjukan bahwa diperlukan penyelidikan lebih jauh. Evaluasi keamanan/ Risiko
Meskipun uji yang dirinci diatas merupakan suatu dasar berharha untuk penilaian risiko/ keamanan, data lain yang berhubungan dengan cara kerja dan pengaruh faktor pemodifikasi juga penting (US ISGC,1986). Perbedaan nyata antara karsinogen genotoksik dan epinergik juga dipertimbangkan sebagai alasan sah untuk menilai risiko mereka secara berbeda. Selain itu, ada zat kimia yang memperlihatkan karsinogenisitas sekunder terhadap efek biologik non karsinogenik atau efek fisik yang hanya muncul pada dosis yang tidak pernah dapat dicapai dalam kehidupan sehari-hari. Dosis toksikan yang sangat tinggi dapat mengakibatkan penyebaran, detoksikasi, dan eliminasi toksikan yang berbeda secara kualitatif. Karena itu respon pada dosis semacam itu mungkin tidak dapat diterapkan pada keadaan sehari-hari yang lebih realistis. Baikan Selain itu, bukti kerusakan jaringan yang luas, gangguan fungsi hormon, pembentukan batu saluran kencing, dan kejenuhan fungsi perbaikan DNA harus ditinjau secara seksama (US ISGC,1986).
Uji mutagenetik
Tujuan dan sasaran uji
Uji mutagenitas ditujukan untuk mempelajari lebih lanjut cara kerja karsinogen dalam individu. Dalam perkembanganya uji ini lebih banyak dipergunakan karena nilainya sebagai suatu penyaring cepat untuk karsinogenisitas terutama dengan fakta bahwa sebagian besar mutagen terbukti bersifat karsinogen.
Tata cara pelaksanaan
1. Pemilihan hewan uji Pada uji ini digunakan mikroorganisme prokariot dan eukariot. Mikroorganisme prokariotik terdiri atas beberapa strain bakteri. Untuk mendeteksi adanya mutasi titik bakteri yang biasa digunakan adalah Salmonella typhimurium dan Escherichia colli. Sebagian besar sistem bakteri dimaksudkan untuk mendeteksi mutasi balik, contohnya uji ames ( Ames. 1971 ). E. colli jenis liar lebiih mampu mengatasi efek mutagen pada DNA lewat mekanisme perbaikan yang normal, sementara mutanya tidak dapat. Mikroorganisme
eukariot
terdiri
atas
Sacharomises
,
Schizosaccharomises,
Neurospora, dan Aspergillus dikembangkan terutama untuk mendetetksi mutasi balik dan pada tingkat terbatas mutasi maju. Serangga, contohnya lalat buah Drosophyla melanogaster adalah serangga yang paling sering digunakan karena lalat ini dapat memetabolisme toksikan dengan cara yang mirip dengan mamalia, namun lebih baik karena waktu generasinya hanya 12-14 hari serta dapat diuji dalam jumlah yang mencukupi dengan biaya yang jauh lebih murah. Tikus dan mencit biasanya dipilih karena ukuranya yang kecil, masa hidup pendek, mudah didapat, dan banyaknya data mengenai responnya terhadap karsinogen lain. 2. Pengelompokan hewan uji 3. Dosis 4. Pegamatan
Analisis dan evaluasi EVALUASI MUTAGENESIS
a. Kebutuhan akan Penelitian Mutagenesis Mutagenesis dapat berguna pada penelitian etiologi penyakit biasa, misalnya pada penyakit jantung, katarak, diabetes militus, epilepsi, skizofrenia, hipertensi esensial,
penuaan, dan kanker. Selain itu, banyak penyakit bawaan diduga berkaitan dengan aberasi kromosom serta mutasi gen dominan dan resesif. Dengan demikian ada tantangan besar bagi ahli toksikologi untuk mengidentifikasi mutagen yang mengenai manusia dan menghitung resikonya. b. Pemilihan Sistem Uji Kerana mempengaruhi zat genetik dengan cara yang berbeda-beda, mutagen dapat memberi hasil negatif pada satu uji dan positif pada uji lainnya. Untuk menyingkirkan hasil negatif palsu sebaiknya dilakukan beberapa uji, lebih baik uji dari kategori berbeda. Disarankan bahwa uji mutagenesis ditempatkan dalam tiga tingkatan. Deretan tingkat I terdiri atas 1. Uji Salmonella/ mutasi gen mikrosom, 2. Uji mutasi gen sel mamalia, 3. Uji patah kromosom sel mamalia. Kalau semua uji itu negatif, zat kimia diduga nonmutagen bagi mamalia. Kalau dua dari uji ini positif, zat ini digolongkan sebagai “ diduga mutagen bagi mamalia”. Kalau hanya satu yang positif, perlu dilakukan uji deretan II (mutasi letal terangkai seks pada Drosophila). Uji lokus khusus dianjurkan untuk zat kimia yang mempunyai potensi mutagenisitas pada sel germinal mamalia, dan uji letal dominan harus dilakukan untuk zat kimia yang menunjukkan berbagai efek kromosom. c. Kemaknaan Hasil Hubungan antara karsinogenisitas dan mutagenisitas Beberapa penyelidik telah memperlihatkan hubungan antara karsinogen dan mutagen. Contohnya McCann dkk 1975 melaporkan penelitian mereka mengenai mutagenisitas 300 zat kimia dengan uji Salmonella atau mikrosom. Hasilnya dibandingkan dengan laporan karsinogenisitas / nonkarsinogenisitas zat- zat ini. Dengan uji itu mereka menunjukkan kolerasi yang tinggi antara kedua efek toksik itu: 90% karsinogen juga bersifat mutagen. Hanya sedikit zat nonkarsinogen yang memperlihatkan sifat mutagenisitas. d. Efek Turunan Pada waktu ini tidak ada korelasi langsung antara uji laboratoriun untuk mutasi turunan dan pengalaman manusia. Namun, kalau suatu zat telah terbukti dapat bersifat mutagen dalam berbagai jenis sistem uji termasuk mutasi turunan pada mamalia utuh, zat itu harus dianggap suatu mutagen manusia kecuali kalau ada bukti sebaliknya (Frank, 2006)
Reviuw jurnal Mutagenetik Tujuan dan sasaran uji
Penelitian ini bertujuan mempelajari efek mutagenik isolat a-karoten terhadap inisiasi karsinogenesis pada kulit dan paru-paru tikus akibat pemberian DMBA. Beberapa alasan pemilihan paru-paru sebagai organ yang diinisiasi kanker antara lain karena paru-paru merupakan organ yang mudah diserang oleh karsinogen dan sering menjadi tempat matastasis kanker dan secara visual kelainan yang terjadi mudah diamati. Adanya kejadian tumor pada beberapa organ kemungkinan karena induksi DMBA dilakukan secara per oral, sehingga dapat menyerang beberapa jaringan pada hewan uji.
Tata cara pelaksanaan
1. Pemilihan hewan uji Hewan uji yang digunakan dalam penelitian ini adalah mencit jantan galur Balb/C berumur lima minggu dengan berat 30-40 gram. 2. Pengelompokkan hewan uji
Kelompok 1 sebagai kontrol : 10 ekor
Tahapan uji mutagenik yang dilakukan meliputi: a.Induksi karsinogenesitas dengan DMBA dan perlakuan isolat β-karoten Tikus diaklimatisasi selama dua minggu dan secara teratur diberi makanan dan minuman yang sama. Pada tahap ini dilakukan pengamatan terhadap keadaan umum dan berat badan tikus. Tikus yang sakit tidak diikutsertakan dalam percobaan. Setelah diaklimatisasi hewan uji dikelompokkan secara acak menjadi 5 kelompok, masing-masing 20 ekor, kecuali kontrol (kelompok I)sebanyak 10 ekor. Perlakuan terhadap hewan uji dapat dilihat pada Tabel 1. Kelompok II adalah kelompok perlakuan DMBA, yang merupakan model kanker dengan pemberian DMBA dalam minyak wijen per oral dengan dosis 20 mg/kg BB sebanyak sepuluh kali, yang dilakukan mulai umur satu setengah bulan, seminggu sebanyak dua kali selama lima minggu. Dua minggu sebelum perlakuan mencit hanya mendapat pakan kontrol, yaitu pelet AD2. Kelompok III, IV dan V masing-masing diberi perlakuan β-karoten dengan peringkat dosis 1,82 mg/
