NAMA : VICKY ANDREAN NIM
: 08121006006
KELAS : GANJIL (A)
UJI BATAS MIKROBA
Uji ini dilakukan untuk memperkirakan jumlah mikroba aerob yang terdapat dalam sediaan farmasi (dari bahan baku sampai bahan jadi). Uji ini dapat dipakai sebagai pengganti uji yang akan disajikan dengan ketentuan cara uji ini telah divalidasi sedemikian rupa hingga menunjukan hasil yang sama atau mungkin lebih baik. Selama penyiapan juga pelaksanaan uji ini harus dilakukan secara aseptik, jika tidak dinyatakan lain, disebut “inkubasi”, menempatkan wadah dalam ruangan yang terkendali secara termostatik pada suhu antara 30°C dan 35°C selama 24 jam sampai 48 jam. Istilah tumbuh ditujukan untuk kemungkinan adanya perkembangan dari mik roba. UJI PENDAHULUAN Hasil uji disajikan berdasarkan bahwa spesimen uji tidak menghambat pertumbuhan mikroba yang terdapat dalam spesimen uji itu sendiri. Uji ini dilakukan dengan inokulasi secara terpisah dengan biakan variabel Staphylococcus aureus, Escherchia coli, Pseudomonas aeruginosa dan Salmonella, pengujian ini dilakukan dengan menambahkan 1ml dari tidak kurang biakan
berumur 24 jam kepada spesimen. Jika penambahan inakktivator dan peningkatan volume masih tidak dapat menumbuhkan variabel mikroba di atas serta tidak cocok diuji dengan penyaringan membran, maka dapat disimpulkan hal tersebut dapat dikatakan sebagai kegagalan isolasi mekroba yang mungkin disebabkan karena daya bakterisida dari sediaan. Pematauan perlu dilakukan untuk menetapkan besarnya daya hambat dan daya bakterisida dari bahan tersebut. Terdapat larutan dapar yang sering digunakan dalam uji batas mikroba ini, yaitu : larutan dapar fosfat pH 7,2. Dimana sebelum digunakan larutan ini sebelumnya diencerkan 1 bagian dalam 800 bagian air dan disterilkan. Sedangkan media yang sering dipakai dalam pengujian batas mikroba meliputi : media FCDSLP (Fluid Casein Digest-Soy Lecithin-Polysorbate 20 Medium), media SCDA ( Soybean Casein Digest Agar Medium), media FSCD ( Fluid Casein Digest Medium), dan masih banyak media yang lainnya terdapat dalam literatur Farmakope Fa rmakope Indonesia IV beserta pembuatannya. PROSEDUR Spesimen yang diuji dilarutkan atau disuspensikan sesuai prosedur uji yang akan dilaksanakan. Untuk bahan padat yang tidak seluruhnya tidak melarut, diusahakan untuk memperkecil ukuran bahan hingga cukup halus, lalu suspensikan ke dalam pembawa tertentu , dan lakukan uji angka mikroba aerob total, uji Staphylococcus aureus dan Pseudomonas aeruginosa, uji Salmonella sp dan Escherchia coli. Sedangkan spesimen cair disuspensikan ke dalam air atau suatu
pembawa hidroalkoholik yang mengandung etanol kurang dari 30%, dan untuk bahan padat yang
praktis larut sempurna dalam 90ml larutan fosfat pH 7,2. Lakukan pengujian angka mikroba aerob total, uji Staphylococcus aureus dan Pseudomonas aeruginosa, uji Salmonella sp dan Escherchia coli.
Untuk cair tidak bisa bercampur dengan air, salep, krim, dan malam dibuat suatu suspensi dengan menggunakan emulgator steril dalam jumlah sesuai. Dan lakukan uji sterilitas pengujian angka mikroba aerob total, uji Staphylococcus aureus dan Pseudomonas aeruginosa, uji Salmonella sp dan Escherchia coli. Sedangkan untuk spesimen cair yang berbentuk aerosol, dinginkan dalam wadah
campuran alkohol dan es kering selama lebih kurang 1jam, buka tutup wadah dan biarkan propelan terbebas. ANGKA MIKROBA AEROB TOTAL UNTUK spesimen yang cukuo melarut hingga dapat diuji dengan metode lempeng, atau hingga sampai dapat digunakan untuk metode tabung ganda. Metode lempeng diuraikan sebagai berikut. Cairan suspensi didiencerkan sampai mendapat 30-300 koloni dalam 1ml. Kemudian ditaruh dalam media SCDA yang berada dalam cawan petri. Tutup cawan petri kemudian inkbasi selama 48 jam hingga 72 jam. Setelah melakukan inkubasi hitung jumlah mikroba dan dari kedua lempeng nyatakan rata-rata jumlah mikroba tiap gram. Sedangkan metode tabung ganda dilakukan dengan menginokulasikan suspensi bakteri ka dalam tabung yang berisi media FSCD steril. Bagi dalam 12 tabung dimana mecakup ke dalam 4kelompok. Masing masing kelompok terdiri dari 3 tabung. Pada masing-masing kelompok diambil satu tabung dinyatakan sebagai kontrol, dan satu tabung masing-masing tiap kelompoknya diberi (100’’) kelompok 1, (10’’) kelompok 2, (1’’) kelompok 3. Dan sisa tabungnya dinyatakan sebagai tabung A dan B. Setelah dimasukkan suspensi bakteri, inkubasi, dalam tabung yang dinyatakan kontrol akan dihasilkan tabung yang jernih dan berdasarkan ada tidaknya pertumbuhan dikelompokan menjadi kelompok 1, kelompok 2, dan kelompok 3. UJI KOAGULASE (untuk Staphylococcus aureus), pindahkan koloni bakteri dengan permukaan media VJA ke dalam tabung berisi plasma mamalia ( kelinci dan kuda), inkubasi dalam penangas air
suhu 37°C amati tabung setelah 3 jam dan lakukan pengamatan setelah 24 jam. Spesimen dinyatakan bebas dari Staphylococcus aureus, jika sama sekali tidak terjadi koagulasi. UJI OKSIDASE DAN PIGMEN (untuk Pseudomonas aeroginosa). Pindahkan suspensi ke dalam media PAF untuk fluoresensi ke dalam cawan petri. Tutup dan balikkan media setelah diinokulasi dan inkubasi pada suhu 35°±2° selama tidak kurang dari 3 hari. Amati permukaan cawan yang telah diinokulasi di bawah cahaya ultraviolet untuk menghitung jumlah koloni. Letakkan kertas saring yang sebelumnya dicelupkan pada N,N-dimetil-p-fenilamida-dihidroksida. Jika tidak terjadai perubahan warna merah muda menjadi lembayung, spesimen dinyatakan bebas dari Pseudomonas aerugnosa. UJI Salmonella sp dan Escherchia coli , pindahkan bakteri dalam bentuk suspensi ke dalam media FLM hingga 100ml kemudian inkubasi. Amati pertumbuhan pada media dan jika ada pertumbuhan campur dengan cara mengocoknya secara perlahan. Kemudian ambil 1ml taruh dalam 10ml media FTM, campur, inkubasi 24 jam. UJI Salmonella sp, pindahkan suspensi bakteri ke permukaan media BGA yang terdapat dalam cawan petri, tutup, balikkan, dan inkubasi. Jika pada pengamatan tidak terdapat koloni yang bercirikan bewarna merah, pusat bewarna hitam, ukuran koloni kecil, warna koloni merah muda hingga putih buram, atau pun hitam, berarti spesimen tersebut bebas dari genus Salmonella.
UJI Escherchia coli , goreskan sisa media FLM ke dalam media MCA, tutup cawan, lalu balikkan, dan inkubasi. Jika pengamatan tidak ditemukan koloni bewarna merah bata dan dikelilingi endapan empedi serta bergram negatif dengan bentuk benang, batang atau pun bulat, maka spesimen tersebut dinyatakan bebas dari E. Coli .
UJI STERILITAS
Uji sterilitas ini bertujuan untuk menentukan bahan dari farmakope memenuhi syarat sterilitas seperti yang tertera dalam monografi. Hasil positif dapat diperoleh jika dilakukan dengan aseptik. Prosedur pengganti yang dapat menentukan apakah produk tersebut steril, asalkan hasil uji yang diperoleh setara dengan kendalanya. Kegagalan menunjukan adanya kontaminasi dari mikroba. Media Media untuk pengujian dapat dibuat seperti tertera dibawah ini, atau juga dapat digunakan campuran kering yang menghasilkan formulasi sama asalkan sesuai petunjuk pabrik, mempunyai sifat merangsang pertumbuhan yang sama atau lebih baik dari formula yang tertera di bawah ini ;
Media Tioglikolat Cair L-Sistin P
0,5g
Natrium klorida
2,5g
Glukosa P ( )
5,5g
Agar P, granul (kadar air tidak lebih dari 15%)
0,75g
Ekstrak ragi P (larut dalam air)
5,0g
Digesti pankreas kasein P
15,0g
Natrium Tioglikolat
0,5g
Asam tioglikolat
0,3ml
Larutan natrium rezurin P (1 dalam 1000) dibuat segar
1,0ml
Air
1000ml
pH setelah sterilisasi 7,1 0,2 Campur dan panaskan hingga larut. Atur pH larutan setelah sterilisasi 7,1 0,2 menggunakan Natrium hidroksida 1N. Jika perlu saring selagi panas menggunakan kertas saring. Tempatkan media dalam tabung yang sesuai, yang memberikan perbandingan permukaan dengan kedalaman media yang sedemikian rupa sehingga tidak melebihi dari setengah bagian atas media yang mengalami perubahan warna sebagai indikasi masuknya oksigen pada akhir masa inkubasi. Sterilisasi dengan autoklaf, jika lebih dari sepertiga bagian atas akan muncul warna merah muda, media dapat diperbaiki hanya Cuma satu kali dengan melakukan pemanasan di atas penangas air hingga warna merah muda hilang. Media siap digunakan jika tidak lebih dari sepersepuluh bagian atas media bewarna merah muda. Media ini digunakan untuk inkubasi kondisi aerob.
Media Tioglikolat Alternatif
(untuk media yang mempunyai lumen kecil) L-Sistin P
0,5g
Natrium klorida
2,5g
Glukosa P ( )
5,5g
Ekstrak ragi P (larut dalam air)
5,0g
Digesti pankreas kasein P
15,0g
Natrium Tioglikolat
0,5g
Asam tioglikolat
0,3ml
Air
1000ml
pH setelah sterilisasi 7,1 0,2 panaskan semua bahan dalam wadah yang sesuai dan larutkan. Campur, dan jika perlu atur pH campuran larutan hingga setelah sterilisasi 7,1 0,2 menggunakan natrium hidroksida 1 N. Media dibuat segar atau panas. Media ini tidak boleh dipanaskan kembali. Media ini digunakan untuk menjamin keadaan anaerob selama masa inkubasi.
Soybean- Casein Digest Medium Digesti pankreas kasein P
17,0g
Digesti papaik tepung kedele
3,0g
Natrium klorida
5,0g
Kalium fosfat dibasa P
2,5g
Glukosa P ( )
2,5g
Air
1000ml
pH setelah sterilisasi 7,3±0,2 larutkan semua bahan padat dalam air, panaskan hingga larut. Dinginkan larutan sampai suhu kamar. Atur pH dengan menggunakan natrium hidroksida 1 N. Ditaruh pada tabung yang sesuai, sterilisasi dengan uap air. Medium ini digunakan untuk inkubasi aerob. Dengan catatan penggunaan ketiga medium ini dapat digunakan untuk menetapkan spesimen yang mengandung antibiotik golongan penisilin atau sefalosporin, secara aseptik tambahkan penisilin ke dalam tabung media untuk menginaktifkan antibiotik dalam spesimen uji. Tetapkan jumlah penisilin yang dimasukkan dengan c ara menguji daya penginaktifannya.
Cairan Pengencer dan Pembilas Dengan membuat cairan A dilarutkan dalam 1g digesti peptik jaringan hewan P, indikator dan campuran larutan ditambah air hinggan 1L, saring hingga jernih, atur pH 7,1±0,2, masukkan ke dalam sejumlah wadah 100ml, sterilisasi dengan uap air. Catatan : jika cairan A digunakan untuk uji sterilitas pada spesimen yang mengandung antibiotik
penisilin, secara aseptik tambahkan penisilinase ke dalam cairan A yang digunakan dalam membilas membran untuk menginaktifkan residu antibiotik pada membran setelah larutan spesimen uji disaring.
Bakteriostatik dan Fungistatik Sebelum melakukan uji sterilitas dengan cara inokulasi langsung terhadap suatu bahan, terlebih dahulu harus menetapkan tingkat bekteriostatik dan fungistatik. Uji ini dilakukan dengan membuat pengenceran pada biakan bakteri dan jamur. Inokulasi media uji dengan 10-100 mikroba. Inkubasi wadah tersebut selama 7 hari. Jika pertumbuhan mikroba sesuai dengan pertumbuhan dalam tabung kontrol gunakanlah media tersebut. Prosedur Umum Prosedur ini terdiri dari inokulasi langsung ke dalam media uji dan teknik penyaringan membran. Metode penyaringan membran berguna untuk cairan dan serbuk yang dapat larut dan bersifat bakteriostatik untuk memisahkan kontaminan dari penghambat pertumbuhan. Metode ini pun dapat digunakan untuk bahan minyak, salep, atau krim yang dapat melarut ke dalam larutan pengencer yang bukan bakteriostatik atau fungistatik. Cara Membuka Wadah Bersihkan permukaan luar ampul dan tutup vial menggunakan bahan dekontaminan yang sesuai dan ambil isi secara aseptik. Untuk kapas murni, perban, pembalut, benang, dan wadah sejenis, buka kemasan secara aseptis. Pemilihan Spesimen Uji dan Masa Inkubasi Untuk bahan cair digunakan volume dan media tertentu sesuai dengan jumlah tiap unit. Bahan dapat ditambahkan ke dalam dua media, gunakan wadah sebanyak dua buah. Untuk bahan bukan cairan, dilakukan uji 20 unit bahan dengan masing-masing media. Biasanya media yang paling sering digunakan dalam uji
sterilitas ini berupa media tioglikolat cair, inkubasi selama 14 hari
dengan suhu 30° hingga 35° atau media Soybean Casein Digest pada suhu 20°-25°. Produk Uji Inokulasi Langsung ke Dalam Media Uji CAIRAN Pindahkan cairan dengan jarum suntik steril. Inokulasikan secara aseptik ke dalam media tabung. Inkubasi tidak kurang dari 14 hari. Amati pertumbuhan pada media pada hari ke-3, hari ke-4, hari ke-5, hari ke-7, hari ke-8, dan hari terakhir pada masa uji. Jika zat uji menyebabkan kekeruhan sehingga ada atau tidaknya pertumbuhan mikroba tidak dapat ditentukan hanya dengan cara di atas saja, tetapi harus dialakukan pemeriksaan lanjut dengan cara memindahkan media yang keruh tadi ke dalam media baru yang sama, kekurangnya satu kali pada hari ke-3 dan ke-7 sejak pengujian dimulai. Lanjutkan ke tahap inokulasi dan inkubasi selama 14 hari. SALEP DAN MINYAK YANG TIDAK LARUT DALAM ISOPROPIL MERISTAT Pilih 20 wadah yang mewakili, dibagi atas 2 kelompok tediri dari 10 wadah, dam perlakukan wadah tiap kelompok berbeda dalam hal jumlah pengisian air steril, cairan 10ml alikot, dan lainnya. ZAT PADAT Ambil sejumlah bahan padat yang kering, tidak lebih dari 300mg tiap wadah. Inokulasikan masing-masing ke dalam 40ml media tioglikolat cair dan soybean casein digest. Wadah diinkubasi lalu diamati pertumbuhan mikroba seperti yang ada pada cairan.
KAPAS MURNI, PERBAN, PEMBALUT, BENANG BEDAH, DAN BAHAN SEJENISNYA Dari setiap kemasan kapas perban dan yang lainnya diuji secara aseptik dengan mengambil 100-500mg dari bagian yang paling dalam. Pindahkan bahan uji ini ke dalam wadah media yang sesuai, lalu inkubasi. Amati pertumbuhan bakteri seperti pada cairan di atas. ALAT KESEHATAN STERIL Untuk alat yang memungkinkan tercaelup keseluruhan, uji alat ini digunakan media yang sesuai, inkubasi seperti prosedur umum, serta amati media seperti yang tertera pada cairan. Sedangkan untuk alat yang mempunyai pipa seperti infus, bilas lumen masing-masing dari 20 unit dengan secukupnya media hingga diperleh kembali 15ml dari setiap media. Inkubasi media tersebut, lalu amati media tioglikolat yang tidak mengalir diinkubasi secar anaerob. Jika spesimen uji mempengaruhi uji ini karena bakteriostatik atau fungistatik bilas dengan cairan pembilas sesedikit mungkin. ALAT SUNTIK KOSONG ATAU TERISI STERIL Uji ini dilakukan sama dengan uji alat steril dalam ampul atau pun vial. Cara inokulasi langsung dapat digunakan untuk penetapan bakteriostatik dan fungistatik telah menunjukkan aktivitas yang tidak merugikan dalam kondisi pengujian. Untuk yang sudah terisi, keluarkan isi obat pasang jarum suntik steril. Alat yang sudah kosong ini dimasukkan ke dalam media steril yang sesuai, selanjutnya akan mengikuti prosedur dan cairan di atas. Prosedur Uji Menggunakan Penyaringan Membran Teknik penyaringan membran digunakan untuk bahan cair yang dapat diuji dengan cara inokulasi langsung ke dalam media uji. Alat penyaring membran yang sesuai terdiri dari seperangkat yang aseptik dan membran telah diproses dapat dipindahkan secara aseptik untuk inokulasi ke dalam media yang sesuai. Membran yang sesuai biasanya mempunyai ukuran porositas 0,45 mikrometer, diameter 47 mm, kecepatan penyaringan air 55-75 ml permenit pada tekanan 75cmHg. Jika bahan uji berupa minyak, membran dapat disterilkan terpisah, dan setelah melakukan pengeringan, unit dirakit secara aseptik. CAIRAN YANG DAPAT BERCAMPUR DENGAN PEMBAWA AIR Secara aseptik pindahkan volume tertentu ke dalam corong penyaring membran, atau ke dalam tabung penampung steril. Jika volume cairan dalam wadah kurang dari 50 ml atau 50-100ml dan tidak dimaksudkan untuk pemberian intravena, diperlukan 20 wadah untuk mewakili satu membran. Jika cairan ini dimaksudkan untuk pemberian intravena atau jumlah volume 100-500ml, pindahkan isi ke dalam tidak kurang 10 wadah melalui tiap penyaringan dari dua rakitan membran saring. Jika cairan sangat kental dan tidak mudah disaring melalui satu atau dua membran maka perlu gunakan dua rakitan penyaring. CAIRAN YANG TIDAK BERCAMPUR DENGAN PEMBAWA AIR (KURANG DARI 100 ML PER WADAH) Menggunakan isi tidak kurang dari 20 wadah pindahkan volume media yang diinginkan ke dalam dua media, langsung ke dalam satu atau dua corng penyaringan membran terpisah ke dalam dua tabung steril. Lewatkan tiap spesimen melalui penyaringan dengan bantuan pompa vakum atau tekanan. Jika bahan berupa cairan kental atau suspensi yang tidak sesuai dengan penyaringan cepat,
secara aseptik ditambahkan cairan pengencer secukupnya, ini akan menambahkan kecepatan alir dari penyaringan spesimen. Jika spesimen bersifat bateriostatik atau fungistatik yang mengandung pengawet, bilas membran satu sampai tiga kali dengan cairan A. Dan jika spesimen uji mengandung lesitin atau minyak bilas dengan cairan D ZAT PADAT YANG DAPAT DISARING Ambil ± 6 g spesimen dalam bentuk padatan kering. Secara aseptik masukkan ke dalam tabung berisi 200 ml cairan A, aduk hingga larut. Jika spesimen tidak larut sempurna tambahkan sampai 400 ml cairan A dan uji tiap 200 ml. Pindahkan larutan campuran ke dalam satu atau dua corong penyaring membran, saring dengan bantuan pompa vakum atau takanan. Jika spesimen mengandung bakteriostatik, bilas dengan cairan A sampai 3 kali tiap 100 ml. SALEP DAN MINYAK YANG LARUT DALAM ISIPROPIL MIRISTAT Larutkan tidak kurang dari 100 mg dari tiap isi wadah dalam tidak kurang 100 ml isopropil miristat dengan pH air tidak kurang dari 6,5. Goyang labu untuk melarutkan salep. Saring salep yang talah larut. Secara aseptik pindahkan cairan salep yang telah disaring ke dalam satu atau dua corong penyaring membran. Lewatkan spesimen melalui penyaringan dengan bantuan vakum atau takanan. Jika zat yang diuji mengandung petrolatum, gunakan cairan K. Basahi membran dengan lebih kurang 200 mikroliter media pembilas sebelum melakukan penyaringan. ZAT PADAT YANG TIDAK DAPAT DISARING Uji spesimen ini dilakukan dengan cara penyaringan yang tidak dianjurkan kecuali dinyatakan spesimen tidak menyumbat filter. ALAT KESEHATAN Alat yang mempunyai saluran steril dapat dilakukan dengan cara mengalirkan cairan D dengan volume tertentu. Kumpulan cairan dalam wadah aseptik lalu dimasukkan ke dalam media yang sesuai, kemudian di taruh ke dalam satu atau dua corong membran penyaringan dan penyaringan dilakukan. Penafsiran Hasil Uji Sterilitas TAHAP PERTAMA Pada interval waktu tertentu dan akhir waktu inkubasi, amati isi semua wadah akan adanya pertumbuhan mikroba seperti kekeruhan pada media. Jika tidak terjadi kekeruhan berarti spesimen uji memenuhi syarat. Jika pertumbuhan mikroba teramati pada tahap pertama hal tersebut belum absah dan harus melewati tahap kedua. TAHAP KEDUA Jumlah spesimen uji diseleksikan minimun dua kali pada tahap uji pertama. Jika tidak ditemukan pertumbuhan mikroba bahan uji memenuhi syarat, jika ditemukan pertumbuhan mikroba pada tahap pertama perlu dilakukan uji dengan tahap kedua. Jika dapat dibuktikan pada uji tahap kedua tidak absah karena kesalahan teknik aseptik tidak memadai, maka tahap kedua dapat diulang.
