4. Siembra y to de Microorganismos Recuento

4  CRECIMIENTO CRECIMIENT CRECIMIE CRECIMIENTO NTO O POBLACIÓN POBLACIÓ POBLACIÓN N MICROORGANISMOS MICROORGANI MICROOR GANIS SMOS MICROORGANIS MICROORGANIS

4. SIEMBRA Y AISLAMIENTO MÉTODOS DE RECUENTO

29

DE

MICROORGANISMOS .

4.1. SIEMBRA Y AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS Para trasladar microorganismos de un medio de cultivo a otro se utilizan micropipetas, pipetas graduadas, asas de siembra y asas de siembra calibradas. a. El asa de Kolle consta consta de un mango mango aislante y de un filamento de platino o de niquelcromo (nicrom) recto recto o acabado en un anillo. Esta asa se esteriliza por por incineración a la llama del mechero, dejándola enfriar sin que toque ninguna superficie antes de la siembra. Las asas calibradas sirven para trasladar alícuotas de un volumen pequeño de muestra (p.ej. 0,01 ml o 0,001 ml). El hilo de siembra (asa de picadura) se emplea para sembrar por picadura en el fondo de un tubo conteniendo agar, el asa redondeada (asa de Kolle) para sembrar por estría e stría o en medios líquidos. b. Asa Digralsky, Digralsky, son varillas de de vidrio vidrio con una rama horizontal. c. Las pipetas graduadas se utilizan para trasladar alícuotas de determinados volúmenes de muestra (0,1-100 ml). Pueden ser de vidrio o de plástico. d. Las micropipetas constan de un mango y de una punta. Las puntas puntas son de PVC de diferentes medidas y colores dependiendo del volumen de muestra; se esterilizan en el autoclave.

Nunca dejar material contaminado sobre la mesa del laboratorio (asas de siembra, tapones de cualquier tipo) TÉCNICA DE SIEMBRA Se toma el tubo o erlenmeyer que contiene el inóculo con la mano izquierda (fig. 4.1) y con los 4º y 5º dedos de la mano derecha se estira o desenrosca el tapón. Con los dedos 1º y 2º se coge el material para trasladar la muestra (asa de Kolle, pipeta...) antes de quitar el tapón.

Fig. 4.1 Es muy importante flamear al mechero la boca de los l os tubos o erlenmeyers y el extremo de las pipetas antes de inocular las muestras. Las asas de Digralsky sirven para extender homogéneamente una alícuota sembrada sobre un medio sólido. Para esterilizarlas, se sumergen en un recipiente con alcohol y se pasan por la

4  CRECIMIENTO POBLACIÓN MICROORGANISMOS MICROORGANIS MICROORGANISMOS

30

llama de un mechero. Antes de sembrar, se espera un tiempo hasta que se enfríe al lado de la llama, sin que toque ninguna superficie. Los tubos y placas deben marcarse con rotulador de vidrio: 1. Código de identificación 2. Tipo de análisis 3. Concentración del inóculo En las placas de Petri dichas anotaciones se realizan de forma circular en el borde de la tapa. Incubar en posición invertida para que las gotas de agua de condensación no se depositen encima de las colonias.

4.1.1 SIEMBRA EN PLACA A) Siembra en estría o por agotamiento. Siembra escocesa. Se basa en arrastrar, con el asa de Kolle, un número cada vez menor de microorganismos sobre un medio sólido en placa de Petri. El objetivo es conseguir colonias aisladas.

Fig. 4.2

Metodología 1. Esterilizar el asa de Kolle y dejarla enfriar al lado del mechero. 2. Tomar una alícuota del cultivo (líquido o sólido) con el asa de siembra. 3. Para siembra en estría,poner el asa suavemente sobre el agar, haciendo un zig-zag hasta que se agote el inóculo. 4. Para siembra escocesa, hacer una serie de estrías paralelas y no superpuestas hasta que se agote el asa (fig.4.2) 5. Esterilizar el asa de siembra. 6. Hacer una nueva serie de estrías perpendiculares a las anteriores de manera que se arrastren parte de los microorganismos sembrados en la serie anterior. 7. Esterilizar el asa de siembra y repetir el proceso una o dos veces más. La última serie de estrías no se ha de superponer con la primera. 8. Incubar 24 - 48 h. a la Tª adecuada. Si la siembra ha sido correcta, los microorganismos quedarán aislados en las últimas estrías y se podrán observar colonias aisladas. Este método no permite saber el número de microorganismos por gr. o ml. de la muestra. B) Siembra por superficie o en masa Es un método cuantitativo de aislamiento y recuento de las bacterias presentes en una muestra problema. Se basa en repartir homogéneamente, alícuotas de la muestra por toda la superficie del medio de cultivo.


31

B.1. Siembra homogénea en superficie. Asa Digralsky Procedimiento: 1. Añadir 0,1 ml. de la muestra o de las diluciones correspondientes en placas de Petri con agar nutritivo. 2. Esterilizar el asa Digralsky. 3. Repartir el inóculo por toda la superficie con movimientos de rotación hasta que el líquido quede totalmente absorbido. 4. Esperar 10 min y incubar las placas invertidas, para evitar que el agua de condensación caiga sobre el medio. 5. Incubar durante 24 - 48 h. a la temperatura indicada. 6. Efectuar el recuento de las colonias sobre la superficie del medio (microorganismos aerobios). A medida que se hace el recuento se marcan con un rotulador sobre la placa . B.2. Siembra en profundidad ("pouring"). Procedimiento: 1. Añadir 1 ml de muestra o de las diluciones correspondientes en placas Petri. 2. Añadir entre 15-20 ml. del agar nutritivo en forma líquida atemperado a 45-47 ºC. 3. Agitar suavemente deslizando la placa de Petri encima de la mesa, en un movimiento en forma de ocho por espacio de dos minutos. 4. Esperar 10 min y incubar las placas invertidas, para evitar que el agua de condensación caiga sobre el medio. 5. Incubar durante 24 - 48 h. a la temperatura indicada. 6. Efectuar el recuento de las colonias en el medio. A medida que se hace el recuento se marcan con un rotulador sobre la placa (aerobios y anaerobios facultativos). B.3. Siembra en doble capa Procedimiento: 1. Sembrar 1 ml de muestra o de las diluciones correspondientes en placas Petri. 2. Añadir 15-20 ml de agar nutritivo líquido a 45-47 ºC. 3. Homogeneizar las placas con suavidad, para mezclar el medio y la alícuota. 4. Dejar solidificar el agar. 5. Tras solidificar añadir una nueva capa del mismo medio de cultivo (aproximadamente 10 ml por placa). No es necesario homogeneizar. 6. Esperar unos 10 minutos hasta que solidifique. 7. Incubar las placas invertidas. 8. Incubar durante 24 - 48 h. a la temperatura indicada. 9. Efectuar el recuento de las colonias en el medio. A medida que se hace el recuento se marcan con un rotulador sobre la placa (microorganismos anaerobios). 4.1.2 SIEMBRA EN TUBO EN MEDIO SÓLIDO a) Siembra por estría Es el método utilizado para el mantenimiento de cultivos puros y para determinar algunas características fisiológicas de los microorganismos. fig. 4.3


32

b) Siembra en picadura Es un método utilizado para determinar algunas características bioquímicas de los microorganismos. Los tubos o frascos con el medio de agar se dejan solidificar en posición vertical o inclinada. El medio se inocula introduciendo verticalmente en el centro del tubo, un alambre largo y recto, cargado con el inóculo. Fig. 4.3

fig. 4.3.

4.1.3 SIEMBRA EN TUBO CON MEDIO LÍQUIDO Medio utilizado para determinar algunas características bioquímicas de los microorganismos o para la obtención de cultivos. Se basa en inocular, mediante el asa de Kolle, masa microbiana procedente de un cultivo (sólido o líquido) a un medio líquido. Procedimiento: 1. Esterilizar el asa de Kolle. 2. Cargar el asa con el cultivo que se quiere transferir. 3. Abrir el tubo con el medio de cultivo estéril y flamear la boca. 4. Introducir el asa de Kolle cargada con el inóculo dentro del medio y agitarla para que las bacterias queden resuspendidas. 5. Flamear el tubo y ponerle el tapón. Esterilizar el asa. 6. Homogeneizar la suspensión. 7. Incubar a la temperatura adecuada. 4.2. MÉTODOS DE RECUENTO MICROBIANOS Determinación de: 1. nº de células 2. masa celular 3. densidad bacteriana o magnitud proporcional (concentración, absorbancia)


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Métodos de determinación nº células: a. b. c. d.

nº de células viables (banco de diluciones) Cámara de recuento Método Breed Contador electrónico (se basa en la pérdida de conductividad de un electrolito cuando pasa una célula bacteriana a través de un orificio estrecho) e. Filtros de membrana

Métodos de determinación masa bacteriana : a. Métodos directos: 1. Centrifugación: I. Masa húmeda (por centrifugación) II. Masa seca (centrifugación y secado) 1. Determinación de nitrógeno o carbono. a. Métodos indirectos: 1. Turbidimetría / Nefelometría. 2. Magnitudes metabólicas (captación de O2, producción de CO2, ácido). Para la medida se pueden emplear métodos electroquímicos, titulaciones volumétricas,...)

4.2.1 RECUENTO VIABLES . Banco dilucionesi. Esta técnica de recuento nos permite conocer el número de microorganismos viables en una determinada muestra. La viabilidad en Microbiología se define como la capacidad del microorganismo para multiplicarse en un medio sólido formando una colonia. Frecuentemente las muestras que hay que estudiar tienen un número muy elevado de microorganismos, por lo que se requiere diluirlas para poder contarlos. Para ello se realizan diluciones seriadas, que posteriormente se siembran en placas con medio de cultivo. La siembra en placa en superficie es idónea para aerobios. Permite tomar las colonias para su resiembra en otro medio o para su posterior identificación. La siembra en profundidad ("pouring"), se utiliza principalmente para el recuento de hongos y en análisis de microorganismos mesófilos aerobios totales en aguas y alimentos.


34

Fig. 4.4

Procedimiento 1. Rotular los tubos de Ringer con el factor de dilución: 10-1, 10-2,10-3.10-4, 10-5,10-6 (1), (-2), (-3), etc. Colocar 9 ml de solución Ringer en cada uno de ellos. 2. Esterilizar los tubos Ringer. 3. Agitar la muestra inicial para homogeneizarla. 4. Tomar 1 ml de la muestra problema con la pipeta y depositarlo en un tubo de Ringer con 9 ml de Ringer, marcado como dilución 10-1 (-1). 5. Se agita bien el tubo (-1 ) y se toma 1 ml. que se depositara en el tubo de Ringer (-2). 6. Repetir la operación con las sucesivas diluciones. 7. Sembrar en placas de agar a partir de las diversas diluciones. Incubar. Lectura y recuento. Hay que contar las colonias a contraluz. A medida que se van contando se marcan con un rotulador, así no se deja de contar ninguna, ni se cuentan dos veces. Para realizar un recuento correcto, las colonias deben estar aisladas. En caso de encontrarse superpuestas, esta placa no es válida para efectuar el recuento. Para obtener el número de organismos por unidad de peso o volumen de la muestra analizada, se cuentan las colonias de las placas que contienen entre 30 - 300 colonias, se calcula la media aritmética, que se multiplica por la inversa de la dilución y por la inversa del volumen del inóculo sembrado en las placas. 1 1 ufc/ml,gr. = nº colonias · dilucio´n vol. ino´culo


35

4.2.2 RECUENTO DIRECTO A) MÉTODO BREED Por la técnica de método directo se coloca un volumen conocido de una suspensión bacteriana sobre un área conocida del portaobjetos. En el método Breed se extiende una muestra sobre un recuadro de un centímetro marcado sobre el porta y se tiñe. Utilizando un objetivo de inmersión se inspeccionan los campos microscópicos y se calcula el valor medio del número de bacterias que hay en cada campo.

Procedimiento 1. 2. 3. 4.

Desengrasar con cuidado un portaobjetos. Dibujar en él un cuadrado de 1 cm por lado. Dar la vuelta al porta y observamos una superficie bien delimitada de 1 cm2. Colocar en la superficie y extender en los límites del cuadrado 1 gota de micropipeta (16 l) de inóculo. 5. Inmediatamente secar y fijar por calor suavemente. Cubrir la extensión con azul de metileno durante 1 min. lavar con agua del grifo, secar y observar al microscopio con objetivo de 40-60 aumentos). 6. A continuación contar el número de microorganismos en varios campos, de manera que el número de campos es más grande cuanto más bajo es el de microorganismos. Si las células están homogéneamente repartidas, se puede aplicar la siguiente tabla. Número de bacterias / campo 0 - 3 4 - 6 7 - 12 13 - 25 26 - 50 51 - 100 > 100

Número de campos que se han de contar 64 32 16 8 4 2 1

Si la distribución no es homogénea se ha de contar un mínimo de 10 campos y en total como mínimo 300 células. Para obtener el nº de células/ml de la muestra problema, hay que aplicar la fórmula siguiente: (N) núm. células/ml. =

(media ce´lulas / campo) x nu´m. campos totales en 1 cm 2

núm. campos totales en cm2 =

volumen (ml )

1

r 2

(determinar "r " con cámara de recuento)


36

B) CAMARA DE RECUENTO Para los recuentos microscópicos directos se usa un portaobjetos especialmente diseñado llamado Cámara de Petroff-Hausser. Una cavidad de volumen conocido está excavado en la superficie del portaobjetos y se cubre con un vidrio fino marcado con cuadros de un área conocida. La cavidad se llena1 con la suspensión bacteriana. Se calcula la media del nº de bacterias de cada una de las series de cuadrados y se multiplica por un factor que proporciona el recuento por mililitro. Las bacterias móviles son difíciles de contar por este método y como pasa con otr os métodos microscópicos, las células muertas son demasiado similares a l as vivas que se quieren contar. Además se requiere una concentración bastante alta de bacterias, de unos 10 millones de bacterias por ml. La principal ventaja es que no se necesita ningún tiempo de incubación. Su uso se reserva en situaciones en que el tiempo es el factor principal.

1

Técnica de llenado de cámara de recuento : Tomar el inóculo con una pipeta Pasteur y acercarla al borde del cubre permitiendo que entre la muestra por capilaridad a la cámara de recuento. Observar con objetivo x60 aumentos.


37

4.3 CRECIMIENTO POBLACIÓN MICROORGANISMOS. El crecimiento de una población microbiana se mide siguiendo el incremento del número de células. La velocidad de multiplicación varía de una especie a otra y depende de las condiciones de cultivo (nutrientes, temperatura, pH, etc.). Para unas condiciones determinadas, el crecimiento no es uniforme sino que varía a lo largo del tiempo. Estas variaciones dependen de factores como el agotamiento de nutrientes, la acumulación de sustancias tóxicas, etc. Si se representan gráficamente estas variaciones en función del tiempo, obtenemos una curva en la cual se diferencian cuatro periodos diferentes:

1. Fase de latencia Periodo de tiempo entre inoculación y la tasa de crecimiento máxima. Depende de factores como: a. Edad cultivo b. Medio de cultivo 

Durante algún tiempo hay poco o ningún cambio en el número de células debido a que no se reproducen inmediatamente en medio nuevo. Este periodo se llama fase de latencia y puede durar desde una hora a varios días. Pero en este tiempo las células no se encuentran inactivas. La población microbiana presenta una intensa actividad metabólica, particularmente de síntesis enzimática. Si el inóculo procede de un cultivo en fase estacionaria, o si ha cambiado de medio de cultivo, debe adaptarse primero a las nuevas condiciones de crecimiento: síntesis de RNA (aumenta entre 8-12 veces), ribosomas y enzimas.


38

Cerca del final de la fase de latencia algunas células doblarán o triplicarán su tamaño, preparándose para la reproducción. Fase logarítmica

Finalmente las células empiezan a dividirse y entran en un periodo de crecimiento exponencial. La reproducción celular adquiere una actividad máxima durante este periodo y el tiempo de generación llega a un mínimo constante. Existe aparentemente un tiempo de generación mínimo característico determinado genéticamente en cada especie (TD). Enterobacterias 15-30', Bacterias

del suelo 60-150' , Nitrosomas y Nitrobacter 5-10 h.

Como el tiempo de duplicación es constante la representación logarítmica del crecimiento durante esta fase exponencial es una linea recta. Durante esta fase logarítmica las células empiezan a mostrar sus características visibles: Morfología, color, densidad... Es también cuando son metabólicamente activas. Por otra parte durante la fase logarítmica del crecimiento, los microorganismos son mas sensibles de lo normal a las condiciones adversas. El tamaño celular y el contenido en proteínas es constante

en la fase logarítmica (células estándar). Ello implica la fiabilidad de las técnicas de medición indirecta. Fase idónea para estudiar influencia de factores ambientales (pH, temperatura, aireación, etc) o capacidad de usar diversos sustratos nutritivos. Fase estacionaria

Si el crecimiento exponencial continua sin control da lugar a un número de células asombrosamente altos. Pero esto no ocurre. Finalmente la velocidad del crecimiento disminuye el número de células muertas compensa al de células vivas y la población se estabiliza. Las actividades metabólicas de las células supervivientes también se hacen más lentas en esta fase. Este periodo se llama fase estacionaria.


39

Las razones del cese del crecimiento exponencial son siempre claras. Se acumulan productos de degradación tóxicos par las células y se agotan ciertos nutrientes esenciales. Disminución de presión

parcial de O2. También tienen lugar variaciones del pH y de temperatura. 



En fase estacionaria sólo las células muy sensibles mueren rápidamente, las células puede aún: a. utilizar materiales de reserva b. descomponer parte de los ribosomas c. sintetizar enzimas En muchos procesos microbianos la fase estacionaria es la fase de producción de un metabolitosecundario (p.ej. Penicilina).

En Biotecnología: a. Trofofase : Fase de nutrición o crecimiento b. Idiofase: Fase de producción Aunque las células no crezcan durante la idiofase, se añaden sustratos que actúan como precursores del producto objeto de la producción. Fase de muerte

Normalmente el número de células muertas supera al de células formadas y la población entra en la fase de muerte o fase de descenso logarítmico.

Causas poco conocidas en general. Algunas debido a:  

4.3.1

producción de ácidos (e.coli, lactobacilos) autolisis (por la acción de los propios enzimas) MEDIDA DEL CRECIMIENTO MICROBIANO.

Hay una serie de métodos para medir el crecimiento bacteriano. Algunos métodos miden el número de células (Breed, cámara de recuento), otros la masa total de la población, que es frecuentemente proporcional al número de células. Las medidas de población se refieren normalmente al número de células que hay en un mililitro de muestra o en un gramo de material sólido. Debido a que las poblaciones bacterianas suelen ser muy grandes la mayoría de métodos de cuantificación están basados en mediciones directas o indirectas de muestras muy pequeñas, después se determina mediante cálculos el tamaño de la población total.


40

A) TURBIDIMETRÍA En algunos tipos de trabajos experimentales, la medida de la turbidez (turbidimetría) es un método muy práctico para seguir el crecimiento bacteriano.

Los cultivos bacterianos actúan como suspensiones coloidales, absorbiendo y reflejando la luz que incide sobre ellos. La turbidimetría mide la cantidad de luz transmitida por la suspensión. Por este procedimiento se puede estimar el número de bacterias en el cultivo, ya que, dentro de un rango, la luz absorbida por una suspensión bacteriana es directamente proporcional a la concentración de células en el cultivo. La dispersión depende de: 1. 2. 3. 4.

Tamaño y peso molecular de las partículas Longitud de onda de la luz incidente Longitud detector-cubeta Concentración partículas

Si las lecturas de absorbancia se comparan con el recuento en placa del mismo cultivo esta correlación se puede utilizar en estimaciones futuras del número de bacterias hechas directamente por turbidimetría. Para que sean visibles las primeras trazas de turbidez es necesario mas de un millón de células por ml., y entre 10 - 20 millones por ml. para que la sustancia sea suficientemente turbia como para ser medida por un espectrofotómetro. Por tanto la turbidimetría no es un método útil para medir la contaminación de líquidos para un número relativamente pequeño de bacterias.

ESPECTROFOTÓMETRO El espectrofotómetro es el aparato que se utiliza para la medida de la luz transmitida. Este aparato proporciona luz monocromática por medio de un filtro que permite sólo el paso de la longitud de onda elegida. La cantidad de luz transmitida por una suspensión bacteriana es medida por una célula fotoeléctrica, siendo inversamente proporcional a la cantidad de bacterias.


41

En general, el crecimiento bacteriano no se expresa como disminución de la luz transmitida (transmitancia), sino como aumento de la luz absorbida (absorbancia), ya que esta última es directamente proporcional al número de bacterias presentes en la suspensión (Ley de Beer2) La relación entre Transmitancia (T) y Absorbancia (A) se expresa matemáticamente por: Io ----->

7 -------> Is

I s

T = I 0

Para %T = 100 => Absorbancia = 0;

%T= Para %T = 0

I s I 0

· 100 => Absorbancia =

∞

Absorbancia = 2 - log % de Transmitancia

Fuente de luz. Luz monocromática ( única). Se obtiene seleccionando una onda de una fuente de luz policromática. La selección se realiza mediante: a. Filtros de vidrios coloreados que absorben las radiaciones no deseadas. b. Prismas o redes de difracción (espectro fotómetro) Cubeta. Recipiente donde se coloca la muestra (l = 1 cm en general) Detector. Convierte la energía luminosa que recibe en energía eléctrica. Sistema de registro Convierte señales eléctricas del detector en señales registradas de lectura.

Fases de utilización (con aparato calibrado) 1. Conectar el aparato 15 m. antes, para estabilizar componentes eléctricos y fuente de luz. 2. Seleccionar la longitud de onda adecuada. 3. Ajustar la absorbancia a 0 con el blanco (medio de cultivo empleado) 2

Ley de Beer. Establece la relación entre el grado de absorbancia de una disolución y otras dos variables: La concentración del absorbente y la longitud del trayecto que el haz recorre a través de la solución. Según esta ley la absorbancia de una solución es directamente proporcional a la concentración y a la longitud del paso de luz. (A = a·b·c), siendo: A = absorbancia b = longitud del paso de la luz en cm.

a = coeficiente de absorción c = concentración del absorbente


42

CURVA DE CRECIMIENTO Suponiendo que un cultivo bacteriano crece a razón de una división cada 20 min. Si se ha partido inicialmente de 1 célula, tendríamos: Tiempo en min.

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

220

240

Nº de bacterias (N)

1

2

4

8

16

32

64

128

256

512

1.024

2.048

4.096

N = 2n

20

21

22

23

24

25

26

27

28

29

210

211

212

n = nº divis. celulares

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

Se produce un crecimiento exponencial. Siendo N = No ·2n , si aplicamos logaritmos log N −log N 0 log N = log No + n·log 2 y n= log 2 La tasa de crecimiento (v = número de divisiones celulares/hora) será: log N −log N 0 v = nt = (t −t 0 )$log 2 El tiempo necesario para un ciclo de división es el tiempo de generación: g = nt = 1v En la representación gráfica del crecimiento bacteriano, se obtiene una curva exponencial. Dicha curva no es apropiada para expresar un número grande de divisiones celulares, porque según que escala escojamos , se reconocerán únicamente, o bien las primeras divisiones, o bien las últimas.

El crecimiento exponencial se caracteriza por una relación lineal entre el tiempo y el logaritmo del número de células, se habla por tanto de crecimiento logarítmico. Por ello se prefiere la representación semilogarítmica, en la cual se coloca en ordenadas el logaritmo del número de células. En este tipo de representación se obtiene una recta. La pendiente de dicha recta refleja la velocidad del crecimiento celular.


43

Cálculo del Tiempo de duplicación (T d) y la Tasa específica de crecimiento ( ) En los cálculos se toma como base la densidad bacteriana (x) o alguna magnitud proporcional a ella (número de células, absorción). La tasa de crecimiento (pendiente de la recta) El tiempo de duplicación es td =

=

ln

x t −ln x o (t −t o )

ln 2

==================================================================

Ejercicio: Cálculo de los parámetros (T d) y ( ) Microorganismo utilizado Escherichia coli Medio de cultivo utilizado TSB Longitud de onda 540 nm Anota en la tabla siguiente los resultados obtenidos: Se utilizará como datos de cálculo, las absorciones siguientes medidas en un espectrofotómetro de un cultivo de E.Coli. Tiempo 0 30' 60' 90' 120' 150' 180' 210' 240'

Absorbancia 0,104 0,180 0,360 0,587 0,990 1,356 1,750 1,852 1,850

2

Efectuar el cálculo del tiempo de duplicación (Td) y de la tasa específica de crecimiento ( ) del microorganismo en el tramo: 60' - 150' (fase exponencial del crecimiento).

1,5 s a i c n a b r o s b A

1

0,5

0 0

50

100

150

200

250

300

tiempos ( min)

Tiempo de duplicación. Td (min) Tasa específica de crecimiento (h -1)


TIPOS DE MORFOLOGÍAS COLONIALES (siembra en placa)

TIPOS DE MORFOLOGÍAS COLONIALES (siembra en tubo)

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PRÁCTICA 4.1) AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS Muestra problema: Disolución ringer , Escherichia coli, Staphylococcus epidermidis. A) Aislamiento por dilución 1. 2. 3. 4.

Preparar 2 placas (xG) de agar nutritivo Preparar 4 tubos con 9 ml. de dº Ringer 3. Esterilizar. Preparar un banco de diluciones decimales (-1, -2, -3, -4) con la muestra disponible. Sembrar en superficie 0,1 ml. de cada una de las diluciones con asa Digralsky en placas con agar nutritivo (G1: -1, -3; G2: -2, -4). 5. Incubar 48 h. a 37 ºC. 6. Realizar el cálculo del nº de U.F.C./mL en la muestra con los resultados obtenidos. 7. Describe las morfologías coloniales observadas (A, B, C, ...). 8. Completar la tablas de observaciones. 9. Hacer un esquema del banco de diluciones y de las siembras que has realizado. 10. Proseguir con el procedimiento B.

B) Aislamiento por agotamiento en placa 1. Preparar y esterilizar los medios sólidos: Mc Conkey, Manitol Salt; G:2 Sabouraud CAF, Levine. 2. Marcar placas Petri. Distribuir los medios. Enfriar. 3. Rotular en la parte posterior de cada placa (excepto Levine), tantos sectores como microorganismos se tengan que sembrar. ( A. Sabouraud 1 sector más) 4. Tomar del agar nutritivo una colonia del tipo "A" obtenida en el protocolo nº 4.1 y sembrarla en estría por agotamiento, en agar Mc Conkey, en uno de los sectores. 5. Repetir la operación con los agares Manitol Salt, Sabouraud. 6. Proceder de igual manera con las colonias del tipo "B" , "C", .... Evitar que se superpongan las estrías. 7. Sembrar Saccharomyces cerevisiae en un sector del A. Sabouraud 8. Incubar las placas en la estufa de cultivos a 37 ºC durante 48 h.(A.Sabouraud a 27 ºC) 9. Hacer un esquema con la metodología seguida. 10. Observar los resultados obtenidos, completando los cuadros correspondientes. 11. A partir de una colonia que haya dado positivo en el Agar Mc. Conkey, resembrar en siembra escocesa en medio agar Levine (xG). 12. En otra placa de Agar Levine realizar una siembra escocesa a partir de un cultivo puro de Enterobacter cloacae. 13. Incubar 24-48 h a 37 ºC. 14. Efectuar lectura de los resultados obtenidos. Obtener conclusiones. Cuestionarios. 15. Consultar la composición y características de los medios de cultivo que se emplean en esta práctica e indicar que función cumplirá cada uno de ellos.


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PRACTICA 4.2 Crecimiento población microorganismos. Turbidimetría. A)Crecimiento población Saccharomyces cerevisiae. Cálculo parámetros (v) y (g).

1. Disolución nutritiva: En un frasco de 250 ml, preparar una de solución de 25 ml de vino blanco (sin tratar), en 25 ml de agua destilada, y añadir 1,2 g de azúcar. 2. Inóculo. Resuspender 2 g de levadura en 100 ml de solución salina. 3. En dos tubos de ensayo con S.S. preparar diluciones decimales -1, -2, del inóculo. 4. En 1 erlenmeyer de 100 ml., colocar 50 ml de solución nutritiva. Sembrar 1 ml de inóculo de la dilucion (-2). 5. Incubar a 22 ºC durante 7 días. Agitar suavemente el cultivo con periodicidad 6. Hacer un recuento de levaduras en cada sesión de prácticas, mediante: a. Cámara de recuento. b. Método Breed. 7. Calcular la tasa de crecimiento v (número de dividiones celulares por día) y el tiempo de generación g (en horas). B) Curva crecimiento Escherichia coli. Turbidimetría. 1. Preparar un tubo inclinado con agar nutritivo. 2. Sembrar en estría un inóculo de E. coli. Incubar 48 h. a 37 ºC 3. Añadir solución salina estéril al tubo inclinado de E. coli hasta cubrirlo completamente (entre 2 y 3 ml) y resuspender las bacterias en la solución salina por agitación. 4. Tomar 1 ml de la suspensión bacteriana con una pipeta estéril y añadirlos a un matraz con 100 ml de TSB estéril. 5. Incubar el matraz en la estufa de cultivos a 37 ºC, con agitación 200 rpm (si disponible) 6. Medir la absorbancia del cultivo a distintos tiempos: 0, 30, 60,....y 180 minutos (longitud de onda aconsejada: 540 nm). Ajustar el espectrofotómetro a 0 % de absorbancia con un tubo de TSB estéril antes de cada medida (blanco). 7. Dibujar una curva de crecimiento, en papel milimétrico, con los datos obtenidos, colocando en el eje de abscisas los valores del tiempo y en el de ordenadas los de absorbancia. 8. Efectuar el cálculo del tiempo de duplicación (Td) y de la tasa específica de crecimiento ( ) del microorganismo en fase exponencial del crecimiento.

4. Siembra y to de Microorganismos Recuento

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