RECUENTO DE MOHOS Y LEVADURAS RECUENTO DE ESPORAS CLOSTRIDIUM SULFITO REDUCTOR
TEORIA RELACIONADA
La contaminación microbiana de alimentos es un problema serio para la industria alimentaria por las grandes pérdidas económicas que trae consigo. Est Este fenó fenóme meno no es mi mixt xto o por por la part partic icip ipac ació ión n de bact bacter eria ias, s, hong hongos os filamentosos y levaduras, pero ha sido estudiado mayormente en bacterias y hongos filamentosos por su protagonismo en el daño. Los hongos y las levaduras se encuentran ampliamente distribuidos en el ambiente, pueden encontrarse como flora normal de un alimento, o como contaminantes en los equipos. Ciertas especies de hongos y levaduras son útiles en la elaboración de algunos alimentos, sin embargo también pueden ser ser caus causan ante tess de la desc descom ompos posic ició ión n de otro otross alim alimen ento tos. s. Debi Debido do a su crecimiento lento y a su baja competitividad, los hongos y levaduras se manifiestan en los alimentos donde el crecimiento bacteriano es menos favorable. Estas condiciones pueden ser bajos niveles de pH, baja humedad, alto lto contenid nido en sales les o carbohidratos, baja temper peratura de almacenamiento, la presencia de antibióticos, o la exposición del alimento a la irradiación. Por lo tanto pueden ser un problema potencial en alimentos lácteo lácteoss ferm ferment entado ados, s, fruta frutas, s, bebida bebidass de frutas frutas,, especi especias, as, oleagi oleaginos nosas, as, granos, cereales y sus derivados y alimentos de humedad intermedia como las mermeladas, cajetas, especias, etc. Los hongos y levaduras pueden utilizar ciertos sustratos como pectinas, carboh carbohidr idrato atoss como como polisa polisacár cáridos idos,, ácidos ácidos orgáni orgánicos cos,, proteí proteínas nas y lípidos lípidos.. También pueden causar problemas a través de: (a) síntesis de metabolitos tóxicos (micotoxinas), (b) resistencia al calor, congelamiento, antibióticos o irradiación irradiación y (c) habilidad para alterar sustratos sustratos no favorables favorables permitiendo permitiendo el crecimiento de bacterias patógenas. Pueden también causar malos olores y sabores y la decoloración de las superficies de alimento. Existe Existen n grupos grupos de levadura levadurass que ejerc ejercen en efecto efecto perjudic perjudicial ial sobre sobre los alimentos los cuales son pocos y están identificados en géneros y especies comunes, según los reportes de cada tipo de alimento revisado. Esto puede esta estarr dado dado por por la capa capaci cida dad d que que pose poseen en de resi resist stir ir fact factor ores es físi físico cos, s, comp co mpue uest stos os quím químic icos os y fact factor ores es ambi ambien enta tale less que que de form forma a natu natura rall o extrínseca contribuyen a proteger los alimentos de origen vegetal y animal; fresco o elaborado contra el ataque de microorganismos y en especial de levaduras.
Además de afectar la industria la contaminación microbiana de alimentos también afecta la salud. Algunos microorganismos produce enfermedades enfermedades la mayoría de carácter gastrointestinal los cuales son síndromes originado por la ingestión de alimentos y/o agua que contengan agentes etiológicos en cantidades tales que afecten la salud del consumidor a nivel individual o grupos de población. La Organización mundial mundial de la Salud (OMS) ha definido a las Enfermedades transm transmitid itidas as por aliment alimentos os (ETAs (ETAs)) como como “una “una enfer enferme medad dad de caráct carácter er infe infecc ccio ioso so o tóxi tóxico co que que es caus causad ada, a, o se cree cree que que es caus causad ada, a, por por el consumo de alimentos o agua contaminada”. Entre Entre las bacterias bacterias productoras productoras de ETAs encontramos encontramos el Clostridium entre las especies que mas se destacan en alimentos son: C. botulinum es el nomb nombre re de la bact bacter eria ia que que prod produc uce e la enfe enferm rmed edad ad del del botu botulis lismo mo.. Es formad formador or de espor esporas as y un potent potente e produc productor tor de neurot neurotoxi oxina, na, aunque aunque La incidencia de la enfermedad es baja es considerada de interés debido a la elevada tasa de mortalidad si no se diagnostica y trata apropiadamente. Y C. perfringens perfringens Está ampliamente distribuido en la atmósfera y se halla frecuentemente frecuentemente en el intestino humano y de muchos animales domésticos y salvaj salvajes. es. Las espora esporass del microo microorga rganis nismo mo están están presen presentes tes en el suelo, suelo, sedimentos y áreas sujetas a la polución fecal por humanos y animales.
OBJETIVOS
Generales •
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Realizar el recuento de mohos y levaduras presentes en un alimento
Real Realiza izarr el recu recuen ento to de espo espora rass de Clostridium sulfito sulfito reductor reductor presentes en un alimento.
Específicos
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Realizar Realizar adecuadamente adecuadamente mediante mediante el método método de cuenta cuenta en placa, el núme número ro de mo moho hoss y leva levadu dura rass viab viable less pres presen ente tess en prod produc ucto toss alimenticios destinados al consumo humano. Determinar e identificar la presencia de esporas de Clostridium sulfito reductor a partir de productos cárnicos.
PROCEDIMIENTO
Se prepar prepararo aron n dilucio diluciones nes logarít logarítmic micas as a base base 10 (10(10-1, 10-2 y 10-3). Se marco un frasco como dilución 10-1 y se adicionaron 90ml de agua
peptonada al 0.1%; marcamos dos tubos de vidrio tapa rosca como 10-2 y dilución 10-3 y adicionamos 9ml de agua peptonada al 0.1%. pesamo moss 10g 10g del del alim alimen ento to (can (cande de de cerd cerdo) o) y lo Diluc Dilución ión 10-1: pesa agregamos al frasco marcado como dilución 10-1 y mesclamos hasta homogenizar la mezcla. Dilución 10-2: tomamos 1ml de la dilución 10-1 y lo agregamos al tubo marcado como 10-2 y se mesclo hasta homogenizar. Dilución 10-3: tomó 1ml de la dilución anterior y se agrego al tubo marcado como 10-3.
Obteniendo así las tres diluciones:
A partir de estas tres diluciones realizamos la determinación para mohos y levaduras y la determinación de esporas de Clostridium sulfito reductor.
1. Determin Determinació ación n de mohos y levadura levaduras s en carne de cerdo. cerdo.
Se realizaron siembras en profundidad, para esto tomamos 3 cajas de petri estériles y las marcamos como 10-1, 10-2 y 10-3. Mezclamos unas diez veces con la pipeta de la dilución 10-1 y tomamos 1ml de esta dilución dilución y lo adicionam adicionamos os en la caja caja marcada marcada como 10-1, mezclamos de igual forma con la pipeta marcada como 10-2 y tomamos 1ml de la dilución 10-2 y lo adicionamos en la caja marcada con la misma dilución, de la misma forma se tomó 1ml de la dilución 10-3 y fueron agregados a la caja marcada como 10-3.
Adicionamos 15ml de agar Extracto de malta-oxitetraciclina (OGY) fundido a 45°C a cada una de las cajas.
Una vez agregado el agar mezclamos varias veces en forma de ochos en dirección de las manecillas del reloj con el fin de que se produzca una distribución homogénea de la muestra en el medio de cultivo, se dejó en reposo para que se solidificara el agar y se incubaron a 22°C por 7 días.
Determinación de esporas de Clostridium sulfito reductor. 2. Determinación
Para la determinación de Clostridium sulfito reductor se realizo por dos métodos. Recuento en placa y recuento en tubo.
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Recuento en placa.
Tomamos tres cajas de petri estériles las cuales marcamos como 10-1, 10-2 y 10-3. Luego con una pipeta tomamos 1ml de las diluciones preparadas anteriormente y se agregaron a cada una de las respectivas cajas de petri. Posteriormente agregamos 15ml de agar SPS fundido a 45°C en cada una de las cajas, se mezclaron de igual forma que el procedimiento anterior y dejamos solidificar. Colocamos las cajas con las tapas hacia arriba en la jarra de anaerobiosis y se incubaron a 37°C por 48 horas.
Jarra de anaerobiosis •
Recuento en tubo.
Marcamos tres tubos como 10- 1, 10-2 y 10-3. Tomamos 1ml de la dilución 10-1 y se los agregamos al tubo marcado de igual, de igual forma con la pipeta marcada como 10-2 tomamos 1ml de la dilución 10-2 y lo adicionamos en el tubo de esta misma dilución , de la misma forma se tomó 1ml de la dilución 10-3 y se agregaron al tubo marcado como 103.
Después procedimos a calentar los tubos en baño serológico a 80°C por 10 minutos, pasados estos enfriemos los tubos en un beaker con agua y hielo. Una vez fríos les agregamos 12 ml de agar SPS fundido a 45°C en cada uno de los tubos y lo dejamos solidificar, para luego agregar una segunda capa de 3ml de agar SPS fundido a 45°C. Se incubaron en anaerobiosis a 37°C por 72 horas.
Jarra de anaerobiosis
RESULTADOS
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Recuento de mohos y levaduras.
Pasados los 5 días de incubación se procedió a evaluar el crecimiento de las colonias.
Dilución 10-1: presento crecimiento de colonias de aspecto mucoide compatibles con levaduras mayor de 300 UFC. Y el crecimiento de 9 colonias de aspecto filamentoso compatibles con mohos.
Diluc Dilucion ion 10-2: esta dilución presento un crecimiento similar al de la dilución anterior siendo las colonias de aspecto mucoide mayores de 300 UFC y las colonias de hongos filamentosos se redujeron a 2 UFC.
Dilucion 10-3: es esta dilución se observó el crecimiento conglomerado de colonias de aspecto mucoide, imposibilitando se recuento.
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Recuento de esporas Clostridium sulfito reductor.
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Recuento en placa
Al revisar los medios de las distintas diluciones no se observo crecimiento de colonias negras características de Clostridium. En ninguna de estas. Sin embargo se observo e crecimiento de colonias bancas cremosas y otras de color amarillo claro en todas las siembras.
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Recuento en tubo
No se observo crecimiento de ningún tipo de colonia.
PRELABORATORIO
1. Cual Cual es el fundamen fundamento to del agar OGY? OGY? El agar OGY (Agar-Oxitetraciclina-glucosa-extracto de levadura) es un agar selectivo para la demostración y numeración de mohos y levaduras en todo todo tipo de material de investigación (alimentos, material clínico, etc.) El agaroxitetrac oxitetraciclinaiclina-gluco glucosa-ex sa-extrac tracto to de levadura levadura ha sido recomenda recomendado do como medio de rutina para la investigación de mantequilla. Est Esta co com mpue puesto por por extr extrac acto to de Oxitetraciclina 0,1 o Gentamicina 0,05.
lev levadur adura, a,
D-glu -gluccosa, osa,
Agar gar-aga -agarr,
2. Cual Cual es la importancia importancia de la determinac determinación ión de mohos y levadura levaduras s y en que tio t io de alimentos se determinan? El papel de los mohos y las levaduras es secundario en la contaminación microbiana de alimentos, las condiciones ambientales de preservación de estos, que tienden a inhibir el crecimiento de bacterias, han favorecido la apar aparic ició ión n de leva levadu durras cont ontamin aminan anttes, es, caus causan anttes igual gualm mente nte de afec afecta taci cion ones es en los los pará paráme metr tros os orga organo nolé lépt ptic icos os de buen buena a calid calidad ad en alimentos frescos, semi-elaborados y elaborados. La importancia de estos microorganismos es que Las levaduras alteradoras de alimentos, se definen como especies particulares capaces de causar deterioro en alimentos y bebidas que han sido procesados y empacados según las Normas de Buenas Prácticas para producción, manejo y empaque de los alimentos. Estas Estas se deter determin minan an en alimen alimentos tos de origen origen veget vegetal, al, frutos frutos,, verdu verduras ras y granos granos;; produc productos tos de panade panadería ría;; alimen alimentos tos elabor elaborado adoss en salmue salmueras ras y ácidos; leche y productos lácteos; l ácteos; así como carnes frescas y curadas. 3. Cual es el fundamento del agar SPS? El agar agar SPS se utiliza utiliza para la detecc detección ión y la enumer enumeraci ación ón de Clostridium perfringens en los alimentos. alimentos. Los medios propuestos para para enumeración enumeración de anaerobias sulfito reductoras de Clostridium en los alimentos. Cont Co ntie iene ne pept pepton ona a co como mo fuent uente e de carb carbon ono, o, nitr nitróg ógen eno, o, vita vitami mina nass y minerales. minerales. Suministr Suministro o de extracto extracto de levadura levadura complejo complejo B, las vitaminas que estimula estimulan n el crecimien crecimiento to bacteriano. bacteriano. Citrato Citrato férrico férrico y sulfito sulfito de sodio sodio son indica indicador dores es al ser reduc reducidos idos por los Clostr Clostridiu idium m en sulfu sulfuro, ro, que reacciona con el hierro a partir del citrato férrico para formar de un sulfuro de hierro hierro precipitad precipitado o negro. negro. Polisorba Polisorbato to 80 es un un agente agente dispers dispersente ente.. Sulfato de polimixina B y la sulfadiazina son inhibidores de otros organismos de Clostridium spp. Tioglicolato de sodio es un agente reductor. El agar es el agente solidificante
4. Cual Cual es la impo import rtan anci cia a de l dete determ rmin inac ació ión n de Clastridium perfringes en los alimentos? C. perfringens perfringens Está ampliamente distribuido en la atmósfera y se halla
frecuentemente frecuentemente en el intestino humano y de muchos animales domésticos y salvaj salvajes. es. Las espora esporass del microo microorga rganis nismo mo están están presen presentes tes en el suelo, suelo, sedimentos y áreas sujetas a la polución fecal por humanos y animales. Y es uno de los microorganismos productores de ETAs.
BIBLIOGRAFIA
GAMAZO Carlo rlos y LOPEZ GOÑI Ignacio. Manual Pract actico de Microbiología. 3ra Edición. Ed. MASSON.
PASC PASCUA UALL ANDE ANDERS RSON ON Marí María a del del Ro Rosa sari rio o y CALD CALDER ERON ON Vice Vicent nte. e. Microb Microbiol iologí ogía a Alimen Alimentar taria ia Metodo Metodolog logía ía Analít Analítica ica para para Alimen Alimentos tos y Bebidas. 2da Edición.
www.google.com.co
Resolución 4282 de 2007
CONCLUSIONES
La identificación de levaduras y mohos en alimentos tiene un interés desde el punto de vista estético de la carne, pero a nivel de salud pública no repr repres esen enta ta inter interés és algun alguno o ya que que co conf nfor orma man n meno menoss del del 25 % de las especies identificadas y de éstas, un número muy bajo son de forma dañina. Por otro lado es de gran de interés la determinación de bacterias entre ellas Clostridium Clostridium ssp. Ya que esta esta relaci relaciona onada da con difere diferente ntess síndro síndrome mess que afecta afectan n a nivel nivel gastr gastroint ointest estina inall llegan llegando do a compro compromet meter er la vida vida de los consumidores. Por tal razón ha sido de gran importancia la realización de este informe que nos ha dado a conocer la importancia de la determinación de microorganismos en alimentos y el método para poder evaluar y cuantificar la presencia de estos, aprendiendo a su vez los parámetros microbiológicos permisibles para cada alimento.
COMPARACIÓN DE PARÁMETROS
