metodo horizontal para el recuento de microorganismo tecnica de recuento de colonias a 30ºc NTC 4519

NORMA TÉCNICA COLOMBIANA

NTC 4519 2009-04-15

MICROBIOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS PARA CONSUMO HUMANO Y ANIMAL. MÉTODO HORIZONTAL PARA EL RECUENTO DE MICROORGANISMOS. TÉCNICA DE RECUENTO DE COLONIAS A 30 °C

E:

MICROBIOLOGY OF FOOD AND ANIMAL FEEDING STUFFS. HORIZONTAL METHOD FOR THE ENUMERATION OF MICROORGANISMS COLONY-COUNT TECHNIQUE AT 30 DEGREES C

CORRESPONDENCIA:

esta norma es modificada (MOD) con respecto a su documento de referencia, la norma ISO 4833:2003.

DESCRIPTORES:

microbiología; alimentos para consumo humano; alimentos para animales; detección y numeración de enterobacterias; técnica de NMP; técnica con pre-enriquecimiento.

I.C.S.: 67.240 Editada por el Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Certificación (ICONTEC) Apartado 14237 Bogotá, D.C. - Tel. (571) 6078888 - Fax (571) 2221435

Prohibida su reproducción

Primera actualización Editada 2009-04-28

PRÓLOGO

El Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Certificación, ICONTEC, es el organismo nacional de normalización, según el Decreto 2269 de 1993. ICONTEC es una entidad de carácter privado, sin ánimo de lucro, cuya Misión es fundamental para brindar soporte y desarrollo al productor y protección al consumidor. Colabora con el sector gubernamental y apoya al sector privado del país, para lograr ventajas competitivas en los mercados interno y externo. La representación de todos los sectores involucrados en el proceso de Normalización Técnica está garantizada por los Comités Técnicos y el período de Consulta Pública, este último caracterizado por la participación del público en general. La NTC 4519 (Primera actualización) fue ratificada por el Consejo Directivo el 2009-04-15. Esta norma está sujeta a ser actualizada permanentemente con el objeto de que responda en todo momento a las necesidades y exigencias actuales. A continuación se relacionan las empresas que colaboraron en el estudio de esta norma a través de su participación en el Comité Técnico 25 Microbiología. 3M COLOMBIA ALIMENTOS POLAR COLOMBIA S.A. ALPINA PRODUCTOS ALIMENTICIOS S.A. ANNAR DIAGNÓSTICA IMPORT LTDA. ARCHIVO DE BOGOTÁ – ALCALDÍA MAYOR DE BOGOTÁ ASBIOQUIM LTDA. BIANÁLISIS BIOCONTROL LTDA. BIOQUILAB LTDA. BIOTRENDS LABORATORIOS LTDA. CALIDAD INDUSTRIAL LTDA. CARULLA VIVERO S.A. CONGELAGRO S.A. CASA LUKER CREPES & WAFFLES S.A. CONGELAGRO S.A. CORPOLAC ECOKAPKA ENZIPÁN DE COLOMBIA LTDA. INDUSTRIAS ALIMENTICIAS ZENÚ S.A. INDUSTRIA PRODUCTORA DE ACEITES RENOVABLES. INSTITUTO DE GENÉTICA UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA

IVONNE BERNIER LABORATORIO LTDA. KOYOMAD S.A. LABCONTROL E.U. LABFARVE – LABORATORIO DE FARMACOLOGÍA VEGETAL LABORATORIOS ERMA S.A. LABORATORIOS GRAM LABORATORIOS MICROLAB LTDA. LABORATORIO SFC LTDA. MERCADEO DE ALIMENTOS DE COLOMBIA S.A. MICROBIÓLOGOS ASOCIADOS NULAB LTDA. PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA PURIFICACIÓN Y ANÁLISIS DE FLUIDOS LTDA QUALA S.A. SECRETARÍA DISTRITAL DE SALUD DE BOGOTÁ SUIZO S.A. UNIVERSIDAD DE LOS ANDES UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA VECOL S.A. VILASECA LTDA. VITROFARMA S.A.

Además de las anteriores las siguientes empresas aportaron durante la consulta publica: ACEGRASAS S.A. ACUAGYR S.A. E.S.P. ALGARRA S.A. AQUALAB AREPAS DOÑA ALEJA ASEBIOL ASINAL ASOCIACIÓN COLOMBIANA DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA COSMÉTICA -ACCYTECASOCIACIÓN COLOMBIANA DE MICROBIOLOGÍA BAVARIA S.A. BECTON DICKINSON DE COLOMBIA LTDA. CALIDAD INDUSTRIAL LTDA. CARULLA VIVERO S.A. CERVECERÍA LEONA S.A. COLOMBIANA S.A. COMPAÑÍA NACIONAL DE CHOCOLATES S.A. CORPORACIÓN PARA EL AVANCE DE LA MICROBIOLOGÍA Y LA MICROSCOPIA MICROS

CORPOICA - CORPOLAB DUPONT QUALICON EMPRESA DE ACUEDUCTO Y ALCANTARILLADO DE BOGOTÁ E.S.P. FABRICA DE ESPECIAS Y CONDIMENTOS EL REY S.A. FRUGAL S.A. JOHNSON DIVERSEY KLIK S.A LABORATORIO A.B.B.A LABORATORIO BIOCONTROL LTDA. LABORATORIO DE GENÉTICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR LA CAMPIÑA MICROBIOLOGOS ASOCIADOS LTDA. MULTIDIMENSIONALES S.A. NESTLÉ DE COLOMBIA S.A. QUIK LTDA. ROCHE DIAGNOSTICS SERVICIOS DE LABORATIO CLÍNICO LTDA. UNIVERSIDAD MANUELA BELTRÁN

ICONTEC cuenta con un Centro de Información que pone a disposición de los interesados normas internacionales, regionales y nacionales. DIRECCIÓN DE NORMALIZACIÓN


NTC 4519 (Primera actualización)

CONTENIDO

Página INTRODUCCIÓN......................................................................................................................1

1.

OBJETO Y CAMPO DE APLICACIÓN ........................................................................1

2.

REFERENCIAS NORMATIVAS ...................................................................................2

3.

TÉRMINOS Y DEFINICIONES .....................................................................................2

4.

PRINCIPIO....................................................................................................................2

5.

MEDIOS DE CULTIVO Y DILUYENTES......................................................................2

5.1

DILUYENTES ...............................................................................................................3

5.2

AGAR PARA RECUENTO EN PLACA (PCA).............................................................3

5.3

MEDIO DE RECUBRIMIENTO ....................................................................................4

6.

APARATOS Y MATERIAL DE VIDRIO .......................................................................4

6.1

APARATO PARA ESTERILIZACIÓN EN SECO (HORNO) O ESTERILIZACIÓN HÚMEDA (AUTOCLAVE) .............................................................5

6.2

ESTUFA DE INCUBACIÓN..........................................................................................5

6.3

CAJAS DE PETRI ........................................................................................................5

6.4

PIPETAS.......................................................................................................................5

6.5

BAÑO DE AGUA..........................................................................................................5

6.6

EQUIPO DE RECUENTO DE COLONIAS...................................................................5

6.7

PH-METRO...................................................................................................................5

6.8

TUBOS DE ENSAYO ...................................................................................................5



Página

7.

TOMA DE MUESTRAS ................................................................................................5

8.

PREPARACIÓN DE LA MUESTRA PARA ANÁLISIS ................................................5

9.

PROCEDIMIENTO........................................................................................................6

9.1

PORCIÓN PARA ANÁLISIS, SUSPENSIÓN INICIAL Y DILUCIONES ......................6

9.2

SIEMBRA E INCUBACIÓN ..........................................................................................6

9.3

RECUENTO DE COLONIAS........................................................................................6

10.

EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS.........................................................................7

10.1

MÉTODO DE CÁLCULO..............................................................................................7

10.2

PRECISIÓN ..................................................................................................................7

10.3

INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS ANALÍTICOS .......................................7

10.4

LÍMITES DE CONFIANZA............................................................................................8

11.

INFORME DE ANÁLISIS..............................................................................................8

BIBLIOGRAFÍA......................................................................................................................10 ANEXOS ANEXO A (Informativo) UTILIZACIÓN DE LA DIFERENCIA CRÍTICA (DC) PARA LA INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS...........................................................................................................9 ANEXO B (Informativo) CUADRO DE DIFERENCIAS ENTRE LA NTC4519 (Primera actualización) y la ISO 4833:2003 .......................................................................................................................12



MICROBIOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS PARA CONSUMO HUMANO Y ANIMAL. MÉTODO HORIZONTAL PARA EL RECUENTO DE MICROORGANISMOS. TÉCNICA DE RECUENTO DE COLONIAS A 30 °C

INTRODUCCIÓN Dada la gran variedad existente de productos alimenticios destinados al consumo humano y animal este método horizontal puede no ser directamente aplicable para ciertos productos. En estos casos, se pueden emplear diferentes métodos, específicos para estos productos, si está absolutamente justificado por razones técnicas. Sin embargo, se debería intentar aplicar este método horizontal siempre que sea posible. Cuando se revise esta norma nacional, se tendrá en cuenta toda la información disponible en ese momento, sobre la aplicación de este método y las razones que han originado desviaciones para productos concretos. La armonización de los métodos de análisis no puede ser inmediata y, para ciertos grupos de productos pueden existir ya normas internacionales que no se ajusten a este método horizontal. Se espera que cuando esas normas se revisen, se cambien para que se ajusten a esta norma nacional y que solo se conserven las divergencias inevitables justificadas por razones técnicas. Esta norma es una adopción modificada (MOD) por traducción, respecto a su documento de referencia, la norma ISO 4833:2003. Microbiology of Food and Animal Feeding Stuffs. Horizontal Method for the Enumeration of Microorganisms Colony-Count Technique at 30 Degrees C

1.

OBJETO Y CAMPO DE APLICACIÓN

Esta norma nacional especifica un método horizontal para el recuento de microorganismos, contando las colonias que crecen en un medio sólido después de la incubación aeróbica a 30 °C. Esta norma nacional es aplicable a los productos destinados al consumo humano o animal, aunque sujeta a las limitaciones expuestas en la introducción. La aplicabilidad de esta norma nacional al examen de determinados alimentos fermentados y alimentos para animales es limitada. Para el examen de determinados alimentos fermentados y alimentos para animales, pueden ser más apropiados otros medios y/u otras condiciones de incubación.

1 de 12

NORMA TÉCNICA COLOMBIANA 2.


REFERENCIAS NORMATIVAS

Las normas que a continuación se relacionan contienen disposiciones válidas para esta norma nacional. En el momento de la publicación estaban en vigor las ediciones indicadas. Toda norma está sujeta a revisión por lo que las partes que basen sus acuerdos en esta norma nacional deben estudiar la posibilidad de aplicar la edición más reciente de las normas indicadas a continuación. Los miembros de CEI y de ISO poseen el registro de las normas internacionales en vigor en cada momento. NTC 4491-1, Microbiología de los alimentos para consumo humano y animal. Preparación de las muestras de ensayo, suspensión inicial y las diluciones decimales para examen microbiológico Parte 1: Reglas generales para la preparación de la suspensión inicial y de diluciones decimales NTC 4092, Microbiología de los alimentos para consumo humano y animal. Reglas generales para los exámenes microbiológicos GTC 78, Microbiología de alimentos y alimentos para animales. Guía para la preparación y producción de medios de cultivo. Guía general para el aseguramiento de la calidad para la preparación de los medios de cultivo en el laboratorio. ISO 8261, Leche y productos lácteos. Directrices generales para la preparación de muestras para análisis, suspensiones iniciales y diluciones decimales para el examen microbiológico. ISO 4833-2, Microbiology of Food and Animal Feeding Stuffs. Horizontal Method for the Enumeration of Microorganisms. Surface Colony Count Technique at 30 ºC.

3.

TÉRMINO Y DEFINICIÓN

Para los propósitos de esta norma nacional, se aplica el siguiente término y definición. 3.1 Microorganismo. Bacterias, levaduras y mohos que forman colonias contables, producidas en las condiciones especificadas en esta norma nacional .

4.

PRINCIPIO

4.1 Se siembran en profundidad dos cajas empleando un medio de cultivo determinado y una cantidad determinada de la muestra para análisis, si el producto es líquido, o empleando una cantidad determinada de una suspensión inicial en el caso de otros productos. Se preparan otros pares de cajas en profundidad, bajo las mismas condiciones, empleando diluciones decimales de la muestra para análisis o de la suspensión inicial. 4.2

Las cajas se incuban aeróbicamente a 30 ± 1 °C durante 72 h ± 3 h

4.3 El número de microorganismos por mililitro o por gramo de muestra se calcula a partir del número de colonias obtenidas en cajas seleccionadas (véase el numeral 10).

5.

MEDIOS DE CULTIVO Y DILUYENTES

Para las prácticas habituales de laboratorio, véanse las normas NTC 4092 e ISO/TS 11133-1. 2

NORMA TÉCNICA COLOMBIANA 5.1


DILUYENTES

Véase la parte adecuada de la NTC 4491-1 5.2

AGAR PARA RECUENTO EN PLACA (PCA)

5.2.1

Composición Digerido enzimático de caseína

5,0 g

Extracto de levadura

2,5 g

Glucosa anhidra

1,0 g

1)

Agar

de 9 g a18 g

Agua

1 000 mI

Cuando se examinan productos lácteos, añádase 1,0 g de leche en polvo desnatada por litro de medio de cultivo. La leche en polvo desnatada debe estar libre de sustancias inhibidoras. 5.2.2

Preparación

5.2.2.1 Preparación a partir de medio completo deshidratado comercial. Síganse las instrucciones del fabricante y añádase, si es necesario, la leche en polvo desnatada (véase el numeral 5.2.1). Se ajusta el pH, si fuera necesario, de manera que después de la esterilización sea de 7,0 ± 0,2 a 25 °C. 5.2.2.2 Preparación a partir de los componentes básicos deshidratados. Se disuelven y dispersan en el agua en el orden siguiente: el extracto de levadura, el digerido enzimático de caseína, la glucosa y, si fuera necesario, la leche en polvo desnatada. Si se calienta el agua se facilita la preparación. Se añade el agar y se calienta hasta ebullición agitando frecuentemente, hasta que el agar se disuelva completamente. Se ajusta el pH, si fuera necesario, de manera que después de la esterilización sea de 7,0 ± 0,2 a 25 °C. 5.2.2.3 Distribución, esterilización y almacenamiento. Se reparte el medio en tubos de ensayo (véase el numeral 6.8), en cantidades de 10 ml a 15 mI por tubo, o en matraces o frascos (véase el numeral 6.8) de capacidad no superior a 500 mI. Se esteriliza en autoclave a 121 °C De durante 15 min. Si el medio se va a usar inmediatamente, se enfría antes de su empleo a una temperatura entre 44 °C y 47 °C en un baño de agua (véase el numeral 6.5). En caso contrario, se almacena en oscuridad a una temperatura de 6 °C ± 2 °C por un período no mayor de 3 meses, bajo condiciones que no permitan ningún cambio de su composición ni de sus propiedades. Antes de comenzar el examen microbiológico, con el fin de evitar todo retraso en el momento de verter el medio, antes de su empleo se funde completamente el medio y a continuación se enfría a una temperatura entre 44 °C y 47 °C en un baño de agua (véase el numeral 6.5).

1)

Dependiendo de la capacidad de gelificación del agar.

3



Con el objeto de comprobar la temperatura del agar, se recomienda colocar un termómetro en una porción de una disolución control de 15 g/l de agar en un recipiente separado idéntico al empleado para el medio o se pueden utilizar termómetros por contacto. La temperatura de la disolución control debería ser expuesta a las mismas condiciones de calentamiento y enfriamiento que el propio medio. 5.2.3 Análisis de rendimiento para la garantía de calidad del medio de cultivo. Para analizar el rendimiento del medio, véase la GTC 78. 5.3

MEDIO DE RECUBRIMIENTO (si fuera necesario; véase el numeral 9.2.7)

5.3.1

Composición

Agar1) de

12 g a 18 g

Agua

1 000 mI

5.3.2

Preparación

Se añade el agar al agua y se calienta hasta ebullición agitando frecuentemente, hasta que el agar se disuelva completamente o se pone al vapor durante unos 30 min. Se ajusta el pH, si fuera necesario, de manera que después de la esterilización sea de 7,0 ± 0,2 a 25 °C. 5.3.3

Distribución, esterilización y almacenamiento

Se reparte el medio en tubos de ensayo (véase el numeral 6.8), en cantidades de 4 mI por tubo, o en matraces o frascos (véase el numeral 6.8) de capacidad adecuada. Se esteriliza en autoclave a 121 °C durante 15 min. Si el medio se va a usar inmediatamente, se enfría antes de su empleo entre 44 °C y 47 °C en un baño de agua (véase el numeral 6.5). En caso contrario, se almacena en oscuridad a una temperatura de 6 °C ± 2 °C o según las indicaciones dadas por el fabricante durante un máximo de 3 meses, bajo condiciones que no permitan ningún cambio de su composición ni de sus propiedades. Antes de comenzar el examen microbiológico, con el fin de evitar todo retraso en el momento de verter el medio, antes de su empleo se funde completamente el medio y a continuación se enfría a una temperatura entre 44 °C y 47 °C en un baño de agua (véase el numeral 6.5).

6.

APARATOS Y MATERIAL DE VIDRIO

El material de un solo uso es una alternativa aceptable al material de vidrio reutilizable, si las especificaciones son similares. El equipamiento de laboratorio microbiológico habitual y, en particular, lo siguiente:

1)

Dependiendo de la capacidad de gelificación del agar.

4

NORMA TÉCNICA COLOMBIANA 6.1


EQUIPO PARA ESTERILIZACIÓN EN SECO (HORNO) O ESTERILIZACIÓN HÚMEDA (AUTOCLAVE)

Véase la NTC 4092 6.2

ESTUFA DE INCUBACIÓN

Capaz de operar a 30 °C ± 1 °C. 6.3

CAJAS DE PETRI

De vidrio o plástico y de 90 mm a 100 mm de diámetro. 6.4

PIPETAS

De capacidad nominal de 1 mI. 6.5

BAÑO DE AGUA

Capaz de operar a una temperatura entre 44 °C y 47 °C. 6.6

EQUIPO DE RECUENTO DE COLONIAS

Por ejemplo, puede emplearse uno consistente en una base iluminada con un fondo negro, equipado con una lente de aumento preferiblemente de unos 1,5x y un contador mecánico o electrónico digital. 6.7

PH-METRO

Que tenga una precisión de calibración de ± 0,1 unidades de pH a 25 °C. 6.8

TUBOS DE ENSAYO

Matraces o frascos de capacidad adecuada y no superior a 500 mI.

7.

TOMA DE MUESTRAS

Es importante que el laboratorio reciba una muestra que sea verdaderamente representativa y que no haya sufrido daños o cambios durante el transporte o el almacenamiento. La toma de muestras no constituye una parte del método especificado en esta norma nacional. Para ello véase la norma internacional específica referente al producto de que se trate. Si no existe una norma internacional específica, se recomienda que las partes interesadas adopten un acuerdo sobre este punto.

8.

PREPARACIÓN DE LA MUESTRA PARA ANÁLISIS

La muestra para análisis se prepara de acuerdo con la parte concerniente de la NTC 4491-1 y la norma ISO 8261, y con la norma específica referente al producto de que se trate. Si no existe una norma internacional especifica, se recomienda que las partes interesadas adopten un acuerdo sobre este punto. 5



9.

PROCEDIMIENTO

9.1

PORCIÓN PARA ANÁLISIS, SUSPENSIÓN INICIAL Y DILUCIONES

Véase la parte concerniente de la NTC 4491-1 y la norma nacional específica referente al producto de que se trate. 9.2

SIEMBRA E INCUBACIÓN

9.2.1 Se toman dos cajas de Petri estériles (véase el numeral 6.3). Mediante una pipeta estéril (véase el numeral 6.4), se transfieren a cada placa 1 mI de la muestra para análisis si es líquida, ó 1 ml de la suspensión inicial en el caso de otros productos (dilución 10-1). 9.2.2 Se toman otras dos cajas de Petri estériles (véase el numeral 6.3). Mediante otra pipeta estéril (véase el numeral 6.4), se transfieren a cada placa 1 ml de la dilución 10-1 (producto líquido) o 1 mI de la dilución 10-2 (otros productos). 9.2.3 Si es necesario, se repite el procedimiento con más diluciones, empleando una nueva pipeta para cada dilución decimal. 9.2.4 Si es adecuado y posible, se seleccionan sólo las secuencias de diluciones criticas (por lo menos dos diluciones decimales consecutivas) para la siembra de las cajas de Petri que den recuentos de colonias entre 30 colonias y 300 colonias por placa. 9.2.5 Se vierten aproximadamente de 10 ml a 15 ml de agar para recuento en placa (véase el numeral 5.2) que se encuentre a una temperatura entre 44 °C y 47 °C en cada una de las cajas de Petri. El tiempo transcurrido entre el final de la preparación de la suspensión inicial (o de la dilución 10-1 si el producto es líquido) y el momento en el que el medio (véase el numeral 5.2) se vierte en las cajas no debe superar los 15 min. 9.2.6 Se mezcla cuidadosamente el inóculo con el medio mediante rotación de las cajas de Petri y se permite solidificar la mezcla dejando reposar las cajas de Petri en una superficie horizontal lisa. 9.2.7 Después de que se haya completado la solidificación y, sólo en el caso en el que se sospeche que el producto que se esté examinando contiene microorganismos cuyas colonias sobrecrecerán en la superficie del medio, se vierten unos 4 mI del medio de recubrimiento (véase el numeral 5.3) que se encuentre entre 44 °C y 47 °C en la superficie del medio inoculado. Se deja solidificar como se describió anteriormente. 9.2.8 Las cajas de Petri preparadas se invierten y se sitúan en la incubadora (véase el numeral 6.2) a 30 °C ± 1 °C durante 72 h ± 3 h. No se deben apilar más de seis cajas una encima de la otra. Es conveniente que las pilas de cajas estén separadas una de otra y de las paredes y parte superior de la incubadora. 9.3

RECUENTO DE COLONIAS

9.3.1 Después del período de incubación especificado (véase el numeral 9.2.8), se cuentan las colonias de las cajas (véase el numeral 10.1), empleando el equipo de recuento de colonias (véase el numeral 6.6). Se examinan las cajas de Petri bajo luz tenue. Seria importante que las colonias en punta de alfiler sean incluidas en el recuento, pero es esencial que la persona que realiza la lectura evite confundir las partículas no disueltas o precipitadas con colonias en punta de alfiler. Se examinan con atención los elementos dudosos, empleando una lupa cuando sea necesario, con el objeto de diferenciar las colonias de partículas extrañas. 6



Incluir la forma de hacer el recuento (que se referencia en la norma de coliformes) NOTA

Si es necesario, se pueden adicionar reactivos que faciliten la visualización de las colonias.

9.3.2 Las colonias invasoras deben ser consideradas como una sola colonia. Si menos de un cuarto de la placa está invadida por dichas colonias, se cuentan las colonias de la parte no afectada de la placa y se calcula el número correspondiente a la placa entera. Si está invadido más de un cuarto de la placa, se desecha el recuento.

10.

EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS

10.1

MÉTODO DE CÁLCULO

Véase la NTC 4092 10.2

PRECISIÓN

10.2.1 Generalidades Los datos de precisión han sido calculados para cajas que contienen entre 30 colonias a 300 colonias. Los datos de precisión dependen de la flora en asociación y de la matriz de la muestra. Los datos presentados se derivan de estudios en colaboración (véanse las referencias [1], [2] y [3]) Y son válidos para leche cruda y pasterizada. Pueden utilizarse como estimación en el caso de recuentos en otros productos. Véase la NTC 4092. 10.2.2 Repetibilidad La diferencia absoluta entre dos resultados analíticos individuales independientes, obtenidos empleando el mismo método sobre material analítico idéntico, en el mismo laboratorio, por el mismo analista y empleando el mismo equipo en un intervalo de tiempo corto, no debería ser mayor que el límite de repetibilidad, r= 0,25, en log10 microorganismos por mililitro (correspondiente a 1,8 en la escala normal de microorganismos por mililitro). NOTA Este límite de repetibilidad proviene de estudios colaborativos realizados sobre leche cruda y pasteurizada (véanse las referencias [1], [2] y [3]) y puede ser aplicado a dichos productos.

10.2.3 Reproducibilidad La diferencia absoluta entre dos resultados analíticos individuales, obtenidos empleando el mismo método sobre material analítico idéntico, en diferentes laboratorios, por analistas diferentes y empleando equipos diferentes, no debería ser mayor que el límite de reproducibilidad, R = 0,45, en log10 microorganismos por mililitro (correspondiente a 2,8 en la escala normal de microorganismos por mililitro). NOTA Este límite de reproducibiliIdad proviene de estudios colaborativos realizados sobre leche cruda y pasteurizada (véanse las referencias [1], [2] Y [3]) Y puede ser aplicado a dichos productos.

10.3

INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS ANALÍTICOS

En los siguientes ejemplos, se consideran los datos promedio de la precisión, un nivel de probabilidad del 95 % y el análisis de una muestra. Se debería tener en cuenta que, en la práctica, se emplea a menudo el promedio de varias muestras. Las cifras se expresan en microorganismos por mililitro. 7

NORMA TÉCNICA COLOMBIANA a)


Condiciones de repetitibilidad Primer resultado:

105 = 100 000

La diferencia entre el primer y segundo resultado no debería ser superior a 0,25 unidades log10, Segundo resultado: log 104,75 = 56 000 ó log 105,25 = 178 000 La diferencia entre el primer y segundo resultado es aceptable si el segundo resultado no es inferior a 56 000 o no es superior a 178 000. b)

Condiciones de reproducibilidad Resultados obtenidos en el primer laboratorio (media de la determinación duplicada): 10 5 = 100 000 La diferencia entre el primer y segundo resultado obtenido en el segundo laboratorio no debería ser superior a 0,45 unidades log10. Segundo resultado: log 104,55 = 36 000, ó log 105,45 = 280 000 La diferencia entre los resultados obtenidos en el primer y segundo laboratorio es aceptable, si el segundo laboratorio obtiene un resultado que no es inferior a 36 000 y no es superior a 280 000.

El Anexo A muestra los cálculos y el empleo de las diferencias críticas (DC) para interpretar los resultados. 10.4

LIMITES DE CONFIANZA

Véase la NTC 4092

11.

INFORME DE ANÁLISIS

El informe del análisis debe especificar lo siguiente: a)

toda la información necesaria para la identificación completa de la muestra;

b)

el método de toma de muestras empleado, si se conoce;

c)

el método analítico utilizado, con referencia a esta norma;

d)

todos los detalles operativos no especificados en esta norma o considerados opcionales, junto con los detalles de todo tipo de incidencias que pudieran haber afectado a los resultados;

e)

los resultados obtenidos. 8


NTC 4519 (Primera actualización) ANEXO A (Informativo)

UTILIZACIÓN DE LA DIFERENCIA CRÍTICA (DC) PARA LA INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS En los siguientes ejemplos, se consideran los datos de precisión media, un nivel de probabilidad del 95 % y el análisis de una muestra. Se debería tener en cuenta que, en la práctica, se emplea a menudo la media de varias muestras. Las cifras se expresan en microorganismos por mililitro. a)

Condiciones de reproducibilidad Resultados obtenidos en el primer laboratorio (media de la determinación duplicada): 105 = 100 000. La diferencia entre este resultado y un resultado obtenido en un segundo laboratorio (media de n determinaciones; n = 2 en este ejemplo) es aceptable si no excede la diferencia crítica (DC), en unidades log10, CD =

1⎞ ⎛ R 2 − r 2 ⎜1 − ⎟ n⎠ ⎝

=

R2 −

r2 = 2

0,45 −

0,25 2 2

= 0,41

en donde r

es el límite de repetitibilidad;

R

es el límite de reproducibilidad.

La diferencia entre los resultados obtenidos en el primer y segundo laboratorio es aceptable si el segundo laboratorio obtiene un resultado que no es inferior a 104,59 = 39 000 o no es superior a 105,41 = 257 000. b)

Comparación con un límite (test unilateral) Límite: 105 = 100 000. La diferencia entre el límite y el resultado del laboratorio (media de n determinaciones; n = 2 en este ejemplo) ha de compararse con el límite de diferencia critica (LDC): CDL = 0,84 2 x

1⎞ ⎛ R 2 − r 2 ⎜1 − ⎟ n⎠ ⎝

= 0,84 2 x

R2 −

r2 2

= 0,24

Los resultados hasta 105,24 = 174 000 no indican una no conformidad con el límite.

9


NTC 4519 (Primera actualización) ANEXO B (Informativo)

Cuadro de diferencias entre la NTC 4519 (Primera actualización) y la ISO 4833:2003 NTC 4519 (Primera actualización) OBJETO: Esta norma nacional especifica un método horizontal para el recuento de microorganismos, contando las colonias que crecen en un medio sólido después de la incubación aeróbica a 30 °C.

ISO 4833:2003

Sustentación Técnica

OBJETO: Esta norma da directrices generales para el recuento de microorganismos presentes en productos destinados al consumo humano o alimentación animal, contando las colonias que crecen en un medio sólido después de la incubación aeróbica a 35 °C ± 2°C.

El documento de referencia ISO 4833 de la NTC 4519 fue actualizado en el año 2003, modificando la temperatura de 35 °C a 30 °C para la técnica, cambio sustentado técnicamente en la necesidad de que el método permitiera tener recuentos verídicos teniendo en cuenta la posible contaminación ambiental del proceso o por mala limpieza en el proceso además porque se busca estudiar microorganismos mesófilos y psicrófilos y una parte de los termotolerantes; de esta manera la temperatura de 30 °C es utilizada para determinar el deterioro del alimento y la calidad del procesamiento de los alimentos. En Colombia el Comité 25- realizó pruebas interlaboratorios teniendo en cuenta como comparativo condiciones de incubación a 30 °C, durante 48 h a 72 h y a 35 °C de incubación durante 48 h a 72 h. Al finalizar el tratamiento estadístico en el país se da validez al sustento ténico internacional (ISO e Instituto Pasteur) para adoptar la temperatura a 30 °C. (Acta No.113 2008-07-15). El tiempo de incubación (72 h) se encuentra estandarizado por la ISO, adicionalmente el consenso del Comité define darle un rango de ± 3 h armonizando de esta forma con las condiciones de tiempo de incubación estipuladas en los métodos y documentos normativos colombianos.

DEMAS PARTES DEL DEMAS PARTES DEL DOCUMENTO QUE REFIEREN A DOCUMENTO QUE REFIEREN LA TEMPERATURA DE A LA TEMPERATURA DE INCUBACIÓN INCUBACIÓN

4.2 Las cajas se incuban 4.2 Incubación aeróbica de las aeróbicamente a 30 ±1 °C durante cajas a 35 °C ± 2 °C durante 48 h 72 h ±3 h.

5.2.2.1 Se ajusta el pH, si fuera necesario, de manera que después de la esterilización sea de 7,0 ± 0,2 a 25 °C.

MEDIO DE CULTIVO ... Se ajusta el pH, si es necesario, de tal modo que después de la esterilización sea de 7,0 °C a 25 °C. 5.2.2.3 ... Se reparte el medio en 5.2.2.3 ... Se reparte el medio tubos de ensayo (véase el en tubos de ensayo (véase el numeral 6.8), en cantidades de 10 numeral 6.8), en cantidades de 12 ml a 15 mI por tubo ... ml a 15 mI por tubo ...

Las unidades de pH se establecen en un rango de ± 0,2. Armonizando las unidades de acuerdo con el documento de referencia ISO 4833. Las metodologías implementadas en el país estipulan utilizar volúmenes de medio de 10 ml en tubos de ensayo, ya que 10 ml es más práctico para medir en material volumétrico (pipetas etc).

9.2.5...Se vierten aproximadamente 12 ml a 15 mI por tubo 5.2.2.3 ... En caso contrario, se La temperatura estipulada para estas almacena en oscuridad a una condiciones en la ISO 7218:2008 es de 2 °C a 8 °C, con el rango que se define en este temperatura de 3 °C ± 2 °C documento se cumple requisito. 5.3.3 ... 6 °C ± 2 °C 5.3.3 ... 3 °C ± 2 °C 6.5 BAÑO DE AGUA 6.5 BAÑO DE AGUA El consenso colombiano define que las condiciones de operación de estos equipos se Capaz de operar entre 44 °C y 47 °C O aparato similar, con capacidad encuentra entre estas temperaturas. de operar 45°C ± 0,5 °C

9.2.5...Se vierten aproximadamente 10 ml a 15 mI por tubo 5.2.2.3 ... En caso contrario, se almacena en oscuridad a una temperatura de 6 °C ± 2 °C

Continúa...

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NTC 4519 (Primera actualización) ANEXO B (Informativo) (Continuación)

NTC 4519 (Primera actualización) 9.2.4 Si es adecuado y posible, se seleccionan sólo las secuencias de diluciones criticas (por lo menos dos diluciones decimales consecutivas) para la siembra de las cajas de Petri que den recuentos de colonias entre 30 colonias y 300 colonias por placa.

ISO 4833:2003

Sustentación Técnica

9.2.4 Si es adecuado y posible, se seleccionan sólo las secuencias de diluciones criticas (por lo menos dos diluciones decimales consecutivas) para la siembra de las cajas de Petri que den recuentos de colonias entre 15 colonias y 300 colonias por placa.

Las normas técnicas colombianas que relacionan estas especificaciones de recuento, contemplan el recuento entre 30 colonias y 300 colonias

9.3.1 ... NOTA Si es necesario, se 9.3.1 ... No contempla la nota pueden adicionar reactivos que aclaratoria faciliten la visualización de las colonias.

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Es necesario aclarar que se pueden utilizar este tipo de reactivos que son válidos para la aplicación de la técnica en el país.


NTC 4519 (Primera actualización) BIBLIOGRAFÍA

[1]

PITON, C., GRAPPIN, R. A Model For Statistical Evaluation Of precision Parameters Of Microbiological Methods: Application To Dry Rehydratable Film Methods And IDG Reference Methods For Enumeration Of Total Aerobic Mesophilic Flora And Coliforms In Raw Milk. J AOAC, 74, 1991, pp. 92-103.

[2]

SCOTTER, S., ALDRIDGE. M., BACK, J., WOOD, R. Validation of European Community Methods for Microbiological and Chemical Analysis of Raw and Heat-Treated Milk. J. Assoc. Publ. Analyst., 29, 1993, pp.I-32.

[3]

DAHMS. S., WEISS, H. Estimation of Precision Values for Microbiological Reference Methods: Standardized Pour Plate Technique. Milchwiss., 53, 1998, pp.555-559.

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metodo horizontal para el recuento de microorganismo tecnica de recuento de colonias a 30ºc NTC 4519

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