PRACTICA #9
Alumno: Correa Cortes
SEPARACION SEPA RACION DE DE AMINAOCIDO AMINAOCIDOS S POR CROMAT CROMATOGRAFIA OGRAFIA EN PAPEL PA PEL
Universidad Autónoma del Estado de Morelos Facultad de Medicina
LABORATORIO DE LABORATORIO BIOQUIMICA Catedrático: Leticia Garca G!me"
PRACTICA No.9 SEPA SEP ARACION DE AMINAOCIDOS POR CROMAT CROM ATOGRAF OGRAFIA IA EN PA P APEL
Alumno: Correa Cortes Francisco Equipo 6
Gru#o: $ %A&
PRACTICA #9 SEPARACION SEPA RACION DE DE AMINAOCIDO AMINAOCIDOS S POR CROMAT CROMATOGRAFIA OGRAFIA EN
Alumno: Correa Cortes
PAPEL PA PEL
OBJETIVO Al finalizar de está practica el alumno deberá conocer el método cromatografía por el cual cual se pued pueden en sepa separa rarr de una una mezc mezcla la los los comp compue uest stos os quím químic icam amen ente te semejantes para su identificación, en relación con los conceptos de cromatografía. HIPÓTESIS Los aminoácidos con un mayor peso molecular y con una mayor afinidad a la fase estacionaria quedarán en las partes más bajas de la tira de papel, mientras que los más livianos y con mayor afinidad por la fase móvil lograrán alcanzar una mayor altura dentro de la tira de papel. INTRODUCCIÓN La cromatografía es un método de análisis que permite separar, aislar e identificar componentes estrecamente relacionados presentes en mezclas complejos. !"isten diferentes tipos cromatografía en los cuales se utilizan una fase móvil y una fase estacionaria. #e acuerdo a los tipos de fase estacionaria y móvil, los tipos de cromatografía pueden ser$ en papel, en capa fina, gas, líquido, en gel y de afin afinid idad ad.. !n la croma cromato togr grafí afía, a, la sepa separac ració ión n de las las molé molécu cula lass en la mezc mezcla la depende de la tendencia relativa de ellas a asociarse con más fuerza a la fase móvil o a la estacionaria. La diferencia interacción se manifiesta por un movimiento diferencial. FUNDAMENTO !l proc proceso eso croma cromato togr gráf áfic ico o impl implic ica a la dist distri ribuc bució ión n dife difere renc ncia iall de un solu soluto to o sustancia absorbible entre dos fase, una de las cuales está inmóvil o estacionaria y la móvil. !n la cromatografía en papel para la separación de los aminoácidos, los solv solvent entes es util utiliz izad ados os son son mezc mezcla lass de agua, agua, alco alcool oles es y ácido ácidoss o base basess %por %por ejemplo, butanol, ácido acético, agua&. !l papel filtro utilizados utilizados sirve de soporte al componente más polar del solvente %agua& formando así la fase estacionaria. estacionaria. Los componentes componentes menos polares del solvente %alcool y ácido acético& constituyen constituyen la fase fase móvi móvill que que arras arrastr tra a dife difere renci ncial alme ment nte e las las molé molécu cula lass disu disuel elta tass en la fase fase estacionaria. #urante el proceso cromatográfico los aminoácidos son separados de acuerdo a su afinidad con la fase estacionaria o la fase móvil. 'ara permitir la visualización de los aminoácidos separados se ace uso de un (revelador) como es la ninidrina, la que reacciona con los alfa* aminoácidos libres o combinados, formando un compuesto de color azul %con e"cepción de la prolina e idro"iprolina que que forma forman n un comp compues uesto to de colo colorr amar amarilillo lo&, &, que que perm permitite e iden identitififica carr a los los aminoácidos al ser comprados c omprados con un estándar apropiado. +ambién +ambién en el valor f -ue es la relación entre la distancia recorrido por un aminoácidos y la distancia que viaja el frente del solvente, medidas ambas desde el punto de aplicación de la muestra, es de utilidad para la identificación de los aminoácidos.
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Alumno: Correa Cortes
PAPEL PA PEL
MATERIAL, REACTIVOS RE ACTIVOS Y APARATOS. APARATOS. Acido aspártico, milimol %// mgr 0& Leucina, milimol %/ mgr 0& 1utanol, ácido acético, agua %2$$& 3inidrina al 4.45 0 +ubos de ensayo / " 44 'ipetas pasteur 6 Atomizador 'apel filtro en tira 'arrilla para secado de papel. METODO . A un un e"tremo e"tremo de papel filtro filtro en en tira aga aga una peque7a peque7a marca marca con lápiz lápiz a un cm de de distancia. 6. 'onga un gota gota en la marca antes antes se7alada, se7alada, del del aminoácidos aminoácidos ácido ácido n8mero n8mero un %9c. Aspartico&. /. epetir epetir la misma operación operación con el el patrón patrón de aminoácidos aminoácidos n8mero dos %Leucina& %Leucina&.. 2. !n otro otro papel repetir repetir lo mismo, mismo, pero pero primeramen primeramente te se colocar colocar el aminoácido aminoácido uno y sobre este aplicar el aminoácido dos. 5. !n tres tubos tubos de ensaye ensaye 4.:5 mL de la mezcla mezcla butanol butanol,, ácido acétic acético, o, agua en cada uno, introduciendo las tiras de papel independientemente una en cada tubo. ;. +apar los tubos de de ensaye con papel papel aluminio aluminio.. :. #eja #ejarr avan avanzar zar el frent frente e del solven solvente te apro"i apro"imad madam ament ente e ast asta a 6 cm. cm. antes antes de llegar al borde borde superior. superior.
na vez seco seco el papel rocíe rocíe con una solución solución de ninidr ninidrina ina al 4.45 4.45 0. #ejándol #ejándolo o secar nuevamente. ?. @ale @alent ntar ar las las oja ojass de pape papell en la parri parrilllla, a, tenien teniendo do cuida cuidado do de no quem quemar arla las, s, asta que aparezcan una mancas de color, que representar el lugar donde se encuentran los aminoácidos que reaccionaron con la aniidrina. Rf = Distania !"#!!i$a !"#!!i$a %#! a&in#'i$#s ( $istania $istania !"#!!i$# %#! ") f!"nt" $") s#)*"nt". @omparar los resultados obtenidos con los estándares correspondientes. @uadro que indica los valores de f de los aminoácidos presentes en el estándar, utilizando como solvente una mezcla de butanol$ ácido acético, agua %2$$&, a una temperatura de 65 @. ABC3D9@C#D< #!L !<+93#A # E A'DFCBA#D
PRACTICA #9
Alumno: Correa Cortes
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Acido aspártico 'rolina Leucina
4.: 4.6? 4.5?
RESULTADOS Aminoácidos 9cido áspártico Leucina Bezcla # y L
ecorrido aminoácidos ;.2 cm 2.: cm 5 cm
de ecorrido solvente :. cm 5.: cm = cm
de E 4.?4 4.=62 4.;65
DISCUSIÓN @omparando los resultados obtenidos con los resultados estandarizados, se puede decir que difieren muco entre sí. !n los resultados estandarizados se nota que la leucina tiene un E apro"imadamente del triple del E del ácido aspártico, mientras que en los resultados resultados obtenidos se nota que el ácido aspártico tiene un E mayor al E de la Leucina, aunque ambos estén muy apro"imados. !n primer lugar, esto se debe a nuestra ine"periencia en este tipo de pruebas, puesto que fue nuestro primer e"perimento de este tipo. Además, al observar la tira, algunas mancas de color llegaban más distalmente que el color total, por lo que se tomaron mediciones asta ese e"tremo. Dtro factor que pudo influir fue que no se tomaron mediciones del solvente inmediatamente, sino que asta que ya estaba más seco, por lo que no se pudo observar muy bien la marca. Cndependientemente de los errores, tomando en cuenta el solvente utilizado, al ser no polar, se supone que el aminoácido no polar %Leucina& tendría un mayor E, al ser mayor su distancia recorrida. CONCLUSIÓN Las pruebas pruebas para para identi identific ficar ar aminoá aminoácid cidos, os, como como la cromato cromatograf grafía, ía, se basan basan en características propias de cada aminoácido, como es su punto isoeléctrico y su E. Bediante un buen uso de la técnica de cromatografía, se puede separar una mezcla compleja de aminoácidos. !l problema en este e"perimento fue que se llevó a cabo un mal manejo de las muestras, debido a la ine"periencia y falta de cuidado. +eniendo en cuenta los datos teóricos se nota que la Leucina tiene una mayor afinidad por la fase móvil que el ácido aspártico, quien siempre debe tener un menor E. E.
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Alumno: Correa Cortes
PAPEL PA PEL
CUESTIONARIO .
G-ué es la cromato atografíaH !s un método físico o de separación para la caracterización de mezclas complejas. !"iste cromatografía de papel y de columna. !ntre la cromatografía de papel se encuentra la de papel y capa fina. !ntre la cromatografía de columna está la de filtración, intercambio iónico, idrofóbica y afinidad.
6.
GBenc GBencio iona narr que que tipo tipo de de crom cromat atog ogra rafí fía a se usó usó en en esta esta prá práct ctic icaH aH @romatografía de papel. BIBLIO+RAFA http://es.wikipedia.org/wik http://es.wikiped ia.org/wiki/Cromatograf i/Cromatograf%C3%ADa %C3%ADa
