CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN POR TAMAÑO La cromatografía de exclusión por tamaño, que también se ha denominado cromatografía de penetrabilidad sobre geles o de filtración sobre geles, es una técnica muy valiosa que se aplica particularmente a especies de elevado peso molecular. Los rellenos para la cromatografía de exclusión por tamaño están constituidos por pequeñas partículas (10u m) m) poliméricas o de sílice que contienen una red de poros uniforme en los que puede difundir las moléculas del soluto y del disolvente. Las moléculas del soluto y del disolvente. Las moléculas son atrapadas eficazmente en los poros y eliminadas del flujo de la fase móvil. El tiempo de residencia medio en los poros depende del tamaño efectivo de las moléculas de los analitos. Las moléculas que son más grandes que el tamaño medio de poro del relleno son excluidas y de esta forma, esencialmente no se retienen y, por tanto, son las primeras que son significativamente menores que los poros, pueden penetrar a través del laberinto de poros y así resultan atrapadas durante más tiempo; éstas son las ultimas en eluir. Entre estos dos extremos, están las moléculas de tamaño intermedio cuya penetración media en los poros depende de su diámetro. Dentro de este grupo, tienen lugar el fraccionamiento, que está directamente relacionado con el tamaño molecular y en cierto modo con la forma molecular. Obsérvese que las separaciones por exclusión por tamaño difieren de los otros procedimientos que se han considerado, en que no implican una interacción química o física entre los analitos y la fase estacionaria. De hecho, se procura evitar este tipo de interacciones dado que originan una mala eficacia de la columna. Obsérvese también que a diferencia de otros tipos cromatografía, hay un límite superior para el tiempo de retención, ya que ningún analito es retenido más que aquel para el cual la penetración en la fase estacionaria es total. RELLENOS DE COLUMNA. En cromatografía de exclusión por tamaño se encuentran dos tipos de relleno: partículas poliméricas y partículas de sílice en ambos casos los diámetros oscilan de 5 a 10 u m. m. Los de sílice tienen la ventaja de gran rigidez, lo que facilita el relleno y permite el empleo de presiones más elevadas; una mayor estabilidad, lo que permite el uso de una gran variedad de disolventes incluyendo el agua; una equilibración más rápida al cambiar el disolvente; y una buena estabililidad a elevadas temperaturas. Los inconvenientes de las partículas de sílice son su tendencia a retener solutos por adsorción de las moléculas del soluto. En un principio, la cromatografía de exclusión por tamaño se llevó a cabo fundamentalmente utilizando como copolímeros estireno-divinilbenceno entrecruzados de estructura semejante (excepto en que los grupos de ácido sulfónico están ausentes). El tamaño de poro es estos polímeros se controla por el grado de entrecruzamiento entre las cadenas poliméricas y por tanto con la cantidad relativa de divenilbenceno presente en la producción. Como consecuencia, los rellenos poliméricos se han comercializado con distintos tamaños promedio de poro. Los geles de estireno-divinilbenceno son hidrofóbicos
y de este modo sólo pueden utilizarse con fase móvil no acuosas. Sin embargo, en la actualidad se dispone de geles hidrofilicos, que hacen posible el uso de disolventes acuosos para la separación de moléculas grandes solubles en agua como los azúcares. Estos geles hidrofílicos son por lo general polímeros sulfonados de divinilbenceno, o poliacrilamidas. Las partículas de vidrio y de sílice porosas, que se comercializan actualmente, tienen tamaños promedio de poro que oscilan entre 40 °A y 2.500. A fin de reducir la adsorción, las superficies de estas partículas se modifican por reacción con sustituyentes orgánicos. Por ejemplo, la superficie de relleno hidrofílico tiene la estructura siguiente:
La Tabla 28-6 indica las propiedades de algunos rellenos comerciales típicos de la exclusión por tamaño. TEORÍA DE LA CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN POR TAMAÑO El volumen total Vt, de una columna rellena con gel de sílice o con un polímero poroso viene dado por:
Donde Vg, es el volumen ocupado por la matriz sólida del gel, Vi es el volumen del disolvente retenido
en sus poros, y VO. es el volumen libre exterior a las partículas del gel. Suponiendo que no hay mezcla ni difusión, Vo, también representa el volumen teórico de disolvente que es
necesario para transportar a través de la columna a los componentes que son demasiado grandes para entrar en los poros del gel. Sin embargo, de hecho tiene lugar algo de difusión y de mezcla, y como consecuencia de ello los componentes que no son retenidos aparecen originando una banda de forma gaussiana con una concentración máxima a V o. Los máximos de banda de los componentes que son suficientemente pequeños para entrar libremente en los potos del gel, aparecerán al final de la columna con un volumen de elución que corresponderá a (Vl + Vo). Por lo general. Vi, Vo y Vg son del mismo orden de magnitud y, por tanto, una columna de gel permite separar con un volumen mínimo de eluyente los componentes grandes de los pequeños en una muestra. Las moléculas de tamaño intermedio pueden transferirse a una fracción K del disolvente que ocupa los poros; el volumen de elución Ve, para esas moléculas retenidas es Ve=Vo + KVi La ecuación se aplica a todos los solutos que pasan por la columna. Para las moléculas que son demasiado grandes para entrar en los poros, K=0 y V e = Vo: para las moléculas que pueden entrar en los poros libremente, K = 1 y V e = (Vo + Vi). Al deducir la ecuación se comidera que no existe interacción alguna, como la adsorción. entre las molé- culas del soluto y la superficie del gel. Si hubiera adsorción, la cantidad de soluto retenido intersticialmente aumentaría; con las moléculas pequeñas. K tendrá un valor de mayor que la unidad. La ecuación anterior puede reordenarse como K = (Ve – Vo)/Vi= Cs/CM donde K es el coeficiente de distribución del soluto. Los valores de K oscilan entre cero, para las moléculas grandes totalmente excluidas y la unidad en el caso de las moléculas pequeñas. El coeficiente de distribución es un parámetro que puede ser útil para comparar distintos rellenos. Además esto hace posible la aplicación de todas las ecuaciones de la Tabla 26-5 a la cromatografía de exclusión por tamaño. El intervalo útil de pesos moleculares para un determinado relleno de exclusión por tamaño, se una curva de calibrado como la que se muestra en la parte superior de la Figura 28- 27a. En este caso, se representa el peso molecular, que está directamente relacionado con el tamaño de las moléculas de soluto, frente al volumen de retención V R, donde es el producto del tiempo de retención y el caudal volumétrico. Obsérvese que la escala ordenadas es logarítmica. El límite de exclusión define el peso molecular de una especie por encima del cual no existe retención. Todas las especies que tengan pesos moleculares mayores que el limite de exclusión, son tan grandes que no se retienen, y eluyen conjuntamente para dar el pico A en el cromatograma que muestra la Figura 28-27b. El límite de penetración corresponde al peso molecular por debajo del cual las moléculas del soluto pueden pueden penetrar en los poros. Por debajo de este peso molecular, todas las moléculas del soluto son tan pequeñas que eluyen dando una sola banda, la indicada como D. A medida que los pesos moleculares disminuyen con respecto al límite de exclusión, las moléculas del soluto pasan cada vez más y más tiempo, en promedio, en los poros de las partículas y de este modo se mueven progresivamente con mayor lentitud. Es en la región de penetración selectiva en la que tiene lugar el fraccionamiento, dando lugar a picos de soluto individuales tales como los picos B y C del cromatograma. Las curvas de calibrado experimentales, semejantes a las teóricas de la figura 28-27a.
se obtienen fácilmente por medio de patrones. En muchas ocasiones, estas curvas las suministran los propios fabricantes de los materiales de relleno. Aplicación de la cromatografía de exclusión por tamaño Los métodos de exclusión por tamaño se dividen en cromatografía de filtración sobre gel y la cromatografía de penetrabilidad sobre gel. En el primer tipo se utilizan disolventes acuosos y rellenos hidrofilicos En el último, se emplean disolventes orgánicos no polares y los rellenos son hidrofobicos. Los métodos son complementarios en el sentido que en un caso se aplican a muestras hidrosolubles, y en el otro a sustancias solubles en disolventes orgánicos menos polares. Una de las aplicaciones más útiles del procedimiento de exclusión por tamaño consiste en sepa-
Figura 28-27 (a) curva de calibración en una columna de exclusión por tamaño. (b) cromatografía mostrando pico A que contiene todos los compuestos con pesos moleculares mayores que el limite de exclusión, los picos B y C corresponden a los compuestos dentro de la región de permeabilidad selectiva y el pico D contiene todos los compuestos de peso inferior al limite de penetración.
ración de las moléculas de alto peso molecular de productos naturales de las especies de bajo peso molecular y de las sales. Por ejemplo, un gel con un limile de exclusión de varios miles, puede separar bien Un proteínas de los aminoácidos y de los péptidos de bajo peso molecular. Otra aplicación útil de la cromatografía de penetrabilidad en gel es la separación de homólogos, y oligómeros. Estas aplicaciones se ilustran en los ejemplos que se muestran en la figura 28-28. El primero que muestra la separación de una serie de ácidos grasos con pesos moleculares entre 116 y 344 mediante un relleno de poliestireno con un límite de exclusión por tamaño de 1.000. El segundo es el cromatograma de una resina epoxi comercial de nuevo mediante un relleno de poliestireno; en este caso. n se refiere al numero de unidades monoméricas (Pm = 264) en las moléculas de resina.
La Figura 28-29 ilustra una aplicación de la cromatografía de exclusión por tamaño a la determinación de glucosa, sacarosa y fructosa en cuatro tipos de zumos de fruta. El relleno con un límite de exclusión de 1.000, era un polímero de poliestireno entrecruzado de características hidrofilicas por la incorporación de grupos sulfónicos. Una columna de 25 cm con este relleno tenía 7.600 platos a una temperatura de trabajo de 80 “C.
Otra gran aplicación de la cromatografía de exclusión por tamaño es a la determinación rápida de los pesos moleculares, o de la distribución de pesos moleculares en los grandes polímeros o en los productos naturales. En este cuso, se comparan los vo-
Figura 28-28. Aplicaciones de la cromatografía de exclusión por tamaño. (a) separación de ácidos grasos. Columna: de poliestireno, de 7.5 x 600mm, un limite de exclusión de 1 x 10 3. Fase móvil: tetrahidrofurano. Caudal: 1,2mL/min. Detector: índice de refracción. (b) análisis de una resina epoxi comercial (n = numero de unidades monomericas en un polímero). Columna: de sílice porosa, 6,2 x 250mm. Fase móvil: tetrahidrofurano. Caudal: 1,3 mL/min. Detector: absorción UV.
lúmenes de elución de la muestra con los volúmenes de elución de compuestos estándar que tengan las mismas características, químicas. Las ventajas mas importantes de los procedimientos de exclusión por (amaño son. (I) tiempos de separación cortos y bien definidos (todos los solutos sales de la columna entre Vo y (Vo + Vi) véase la Figura 28-27; (2) batidas estrechas, que conducen a una buena sensibilidad; (3) no hay pérdida de muestra, porque los solutos no
Figura 28-29 determinación de glucosa (G), fructosa (F) y sacarosa (S) en zumos enlatados.
interaccionan con la fase estacionaria; (4) no se desactiva la columna debido a la ausencia de interacción del soluto con el relleno. Las desventajas son: (1) solo se pueden acomodar un numero limitado de bandas en el cromatograma debido a que la escala de tiempos es corta y (2) no es aplicable a muestras de componentes de tamaño semejante, como las mezclas de isómeros. Por lo general, para que la resolución sea aceptable se necesita que la diferencia sea de al menos un 10 por 100 en los pesos moleculares.
Métodos que dependen del tamaño o la masa.
CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN MOLECULAR La cromatografía de exclusión molecular o gel- filtración permite separar a las proteínas en función de su tamaño. Esta técnica se realiza en una columna que está rellena con un gel poroso insoluble en forma de esferas, cuyos tamaños de poro son conocidos. Las moléculas proteicas de menor tamaño penetran por los poros, por lo que el recorrido que han de hacer realiza a través de la disolución es mayor que el de las moléculas de gran tamaño, que no penetran en los poros por impedimento estérico; esto hace que las moléculas de gran tamaño eluyan antes que las pequeño tamaño. Por lo tanto, una mezcla de proteínas se separarán en función del tamaño, primero eluirán las de mayor tamaño y en último lugar las de menor tamaño, las proteínas de tamaños intermedios eluirán entre ambos extremos en función de su masa. Para poder saber la masa molecular de una proteína, previamente ha de hacerse un calibrado de la columna con proteínas cuya masa molecular se conoce, y cuyo volumen de elución se determina experimentalmente La cromatografía se basa en un conjunto de técnicas asociadas al principio de retención selectiva. Permite separar los distintos componentes de una mezcla, permitiendo identificar y determinar las cantidades de dichos componentes. Posee:
Fase móvil: consiste en un fluido (gas, líquido o fluido supercrítico). Fase estacionaria: se trata de un sólido o un líquido fijado en un sólido. Cromatografía significa
"Escribir en Colores“.
El químico F.F.Runge, que trabajaba con tintas, descubre que los cationes orgánicos se podían separar por migración cuando se colocaba una solución que los contenía sobre un material poroso, como papel. Biografias SKOOG.HOLLER.NIMEN. Principios de ANÁLISIS INSTRUMENTAL. MC GRAW HILL. QUINTA EDICIÓN FUNDAMENTOS TERCERA EDICIÓN.
DE BIOQUÍMICA ESTRUCTURAL.
Proteínas.
