0ráctica idrolisis de una proteína ) ensa)os para proteínas ) aminoácidos. / de 4ctu(re de 251 6rupo 27*2 Equipo 25 Ca(rera +end!n Citlalli 4daliz 6onzález 8ournier *agali 9nne 0lata 4rtíz *ario 9l(erto 0rofesora +osa *aría a:uelos 9#ila
Objetivos
1.- Efectuar la hidrolisis total de una proteína. 2.- Identificar algunos aminoácidos presentes en un hidrolizado de proteína, por medio de sus propiedades físicoquímicas. 3.- Identificar por cromatografía en capa fina algunos de los aminoácidos presentes en un hidrolizado.
Presentación de resultados
Como parte del desarrollo eperimental se realizaron reacciones de identificaci!n, como m"todo cualitati#o para #erificar la hidrolisis de proteínas, en primera instancia la reacci!n $antoproteica, que sigui! un mecanismo de reaccion % &ig.1 &ig.1'' de sustituci!n electrofilia aromática, siendo la al(umina quien d io resultados positi#os, aminoácido cu)o nom(re es tirosina.
&ig. 1. *ecanismo de reacci!n $antoprot"ica en al(umina, con aminoácido tirosina.
En la reacci!n de precipitaci!n para identificar aminoácidos azufrados se ilustra la reacci!n general, reacci!n que dio positi#a en soluci!n de al(umina, dando a relucir la eistencia del aminoácido metionina ) cisteína. %&ig. % &ig. 2' 2'
&ig. 2. +eacci!n general de precipitaci!n.
a reacci!n de iuret que dio como resultado la eistencia de un compleo de co(re, es ilustrada la reacci!n general de cualquier proteína en contacto con sulfato de co(re e hidr!ido de sodio %&ig. % &ig. 3'. 3'.
&Ig. 3. +eacci!n general de iuret.
a reacci!n de ninhidrina ninhidrina se ilustra ilustra de manera general en la siguiente imagen, la cual present! present! resultados resultados positi#os positi#os al tratarse de la in#olucraci!n de grenetina hidrolizada ) soluci!n de al(umina %&ig. % &ig. /'. /'.
&ig. /. *ecanismo de reacci!n de un aminoácido tratado con ninhidrina.
a reacci!n de identificaci!n de grupos aminos li(res como lo es la reacci!n de á cido nitroso sige el siguiente mecanismo de reaccion de manera general en cualquier aminoácido presente en una muestra pro(lema, siento característico el (ur(ueo de la disoluci!n ) tomando este como ilustraci!n de un resultado positi#o % &ig. ;'.
&ig. ;. *ecanismo de reacci!n de aminoácidos con ácido nitroso.
0ara compro(ar la acci!n reguladora de los aminoácidos al momento de agregar ácido o una (ase, se relaciona con el siguiente mecanismo de reacci!n %&ig.'.
&ig. . +eacci!n de aminoácido al agregar ácido e hidr!ido.
9l realizar las reacciones de identificaci!n de aminoácidos e hidrolisis de una proteína, se o(tu#ieron los siguientes resultados epresados en la ta(la de resultados % &ig. <'. 0+=E9 I>E?8I&IC9CI@? +eacci!n $antoproteíca
+eacci!n 0recipitaci!n +eacci!n de iuret
A=A8+984 >isoluci!n 9F
0+=E9 B?egati#o
>isoluci!n >F
0ositi#o
>isoluci!n 9F >isoluci!n >F 24 destilada >isoluci!n 9F
?egati#o 0ositi#o
>isoluci!n CF >isoluci!n >F 24 destilada >isoluci!n F >isoluci!n CF >isoluci!n >F
+eacci!n ?inhidrina
+eacci!n Gcido ?itroso
>isoluci!n aa. 0atr!n 24 destilada >isoluci!n 9F >isoluci!n CF >isoluci!n >F
?egati#o 0ositi#o 0ositi#o 0ositi#o BBB ?egati#o 0ositi#o B 0ositi#o BB 0ositi#a BBB 0ositi#a BB 0ositi#a B
I>E?8I&IC9CI@? 4AE+D9CI4?EA 9minoácidos en Coloraci!n transparente a amarillo anillos intenso Coloraci!n amarilla a #erdosa compuestos transparente. Enlaces ?o presenta precipitado caf" Ae present! un precipitado caf" azufrados Coloraci!n azul claro tur(io Ain reacci!n, se mantu#o incoloro Enlaces peptídicos &uerte coloraci!n azul re)
6rupos aminos li(res
6rupos li(res
Coloraci!n tenue azul marino Incoloro &uerte coloraci!n morada Ain cam(ios, incoloro Coloraci!n morada menos e#idente Coloraci!n morada
Incoloro aminos Constante (ur(ueo %?2' 0oco (ur(ueo %?2' *enor cantidad de (ur(ueo %?2'
&ig. <. 8a(la de resultados en la parte eperimental.
En la acci!n reguladora de los aminoácidos al momento de emplear la soluci!n de grenetina hidrolizada neutralizada como muestra pro(lema, se o(tu#ieron los siguientes resultados epresados en la si guiente ta(la %&ig. H'. >IA4=CI@? 24 destilada >isoluci!n F 24 destilada >isoluci!n F 4AE+D9CI4?EA
I?>IC9>4+ +oo Congo +oo Congo &enolftaleína &enolftaleína
C44+ I?ICI9 +oo +oo Incoloro Incoloro
* Cl 5.1?
C44+ &I?9
; gota 1 gotas 1 gota < gotas
*orado *orado +osa Dioleta +osa claro %p neutro'
&ig. H. 8a(la de resultados de acci!n reguladora de aminoácidos.
Como resultado de cromatografía en capa finase realizo la siguiente ta(la % &ig. J'. Epresando los +f de la grenetina hidrolizada %Aoluci!n ' ) los +f de los aminoácidos patr!n, el cual solo fue la glicina la cual se encuentra en la grenetina. 0roductos 6licina >isoluci!n F
&enilalanina
*ancha a' 1cm (' 2.H cm a' 5.3 cm (' 5.; cm c' 5. cm d' 1.5 cm e' 1.; cm f' 1.< cm g' 2.1 cm a' 2.2 cm
+f 5.2H 5.H5 5.5H 5.1/ 5.1< 5.2H 5./2 5./H 5.5 5.2
>entro de la cromatografía se encontr! que dentro de la disoluci!n F %K' se encontra(an di#ersos aminoácidos, de ahí la gran cantidad de manchas que se #isualizaron en la placaL sin em(argo, comparando con dos aminoácidos patrones, se conclu)e que la disoluci!n F contiene glicina pero que no contiene fenilalanina.
&ig. J. 8a(la de resultados de cromatografía en capa fina.
Análisis de resultados
En esta práctica se lle#! aca(o la hidrolisis de una proteína, así como la identificaci!n de aminoácidos presentes en un hidrolizado ) no hidrolizado de proteína haciendo uso de la preparaci!n de distintas soluciones de grenetina ) al(umina, para posteriormente lle#ar a ca(o las prue(as de i dentificaci!n correspondientes segMn el caso, las cuales fueron Reacción xantoproteica: reacci!n positi#a para aminoácidos aromáticos, siendo una prue(a en la que los compuestos
que presentan (encenos sustituidos %con grupos unidos al anillo (enc"nico', al reaccionar con el ácido nítrico concentrado forman compuestos nitrados de color amarillo, el cual se intensifica en un medio alcalino. >e acuerdo a nuestros resultados o(tenidos lo dicho anteriormente fue compro(ado gracias al empleo de la soluci!n de al(umina, #isualizando en esta claramente la coloraci!n amarillenta %prue(a positi#a' formada al emplear el medio alcalino correspondiente %?a4', esto de(ido a que en la soluci!n esta(an presentes aminoácidos con anillos aromáticos, como tript!fano, fenilalanina, tirosina, histidina ) prolina. Caso contrario se o(ser#! en la soluci!n 9, contenida de glicina, lisina, arginina entre otras, en donde no estu#o presente la coloraci!n amarilla puesto que era simplemente una mezcla de aminoácidos los cuales presenta(an rupturas entre sus enlaces. N3O Reacción de precipitación: El enlace disulfuro es un enlace co#alente que se produce cuando dos grupos sulfhidrílo
%A' reaccionan para formar un puente disulfuro %AA'. os residuos de cisteína pueden formar puentes disulfuro. 0ueden unir 2 cadenas peptídicas o una sola para formar un anillo. >icha prue(a identifica los enlaces disulfuro de las proteínas, ma)or parte las proteínas que contengan un nMmero ma)or de puentes disulfuro, en esta reacci!n los aminoácidos azufrados se reconocen por la formaci!n de precipitados de sulfuro de plomo de color oscuro que se forma cuando reacciona con acetato de plomo en medio alcalino. asándose esta reacci!n en la separaci!n mediante un álcali, del azufre de los aminoácidos, el cual al reaccionar con una soluci!n de acetato de plomo forma el sulfuro de plomo. Compro(ándose lo anteriormente mencionado con los resultados o(tenidos en donde la prue(a que resulto positi#a fue la empleada con soluci!n > %al(umina' la cual, por presentar aminoácidos azufrados, como metionina ) cisteína se form! un precipitado color caf" indicándonos la eistencia de puentes disulfuro. N3O Prueba Biuret: esta reacci!n se (asa en la reacci!n del sulfato de co(re con compuestos que presenten dos o más
enlaces peptídicos, en un medio alcalino. El producto es un compleo color azul cu)a intensidad de color depende de la cantidad de enlaces peptídicos presentes. >e acuerdo a los resultados o(tenidos, estos indicaron que las soluciones que contenían 9l(umina, grenetina no hidrolizada ) una peque:a porci!n de agua destilada presentaron enlaces peptídicos, o(ser#ando en ellas una colocaci!n azul cielo en el caso del agua destilada ) azul re) para las dos prue(as restantes, confirmando con esto que, a ma)or intensidad de color, ma)or son los enlaces p"ptidos presentes, esto esta(lecido anteriormente en la teoría. +especto a la otra soluci!n realizada, se pudo o(ser#ar que esta resulto incolora, de(ido a que la soluci!n contenía grenetina hidrolizada ) por ende en ella eistía la ruptura de enlaces entre los aminoácidos presentes que al no presentar enlaces peptídicos los resultados fueron la no coloraci!n azul. N3O Reacción de Ninhidrina: Esta reacci!n es (astante importante, pues es uni#ersalmente empleada para detectar
cualitati#amente ) cuantitati#amente a los aminoácidos. 0ara los aminoácidos esta es una de las reacciones de color, #erdaderamente importante. a ?inhidirna es una agente oidante, uno de los grupos alfa-amino, li(erando amoniaco, C42 ) el correspondiente aldehído %&ig. /'. =na coloraci!n #ioleta determina positi#a la prue(a ) para este caso tam(i"n un color Dino tinto la determinara como positi#a. En esta prue(a se o(tienen los resultados en grenetina hidrolizada ) soluci!n de aminoácido patr!n presentaron una coloraci!n #ioleta intensa, lo cual indica que presentan aminoácidos o grupos amino li(res, la grenetina con presencia de lisina ) arginina, en cam(io el agua ) la soluci!n de grenetina sin hidrolizar era o(#io el resultado, el agua sin presencia de ningMn tipo de aminoácidos ) la grenetina al no hidrolizarse los aminoácidos seguían unidos por enlaces peptídicos. N3O Reacción con ácido nitroso: Esta es la reacci!n que se utiliza para determinar el nitr!geno del grupo amino, se conoce
como procedimiento de Don Al)Pe ) sir#e para estimar los grupos aminos li(res de los p"ptidos ) las proteínas midiendo la cantidad de nitr!geno li(erado. El ácido nitroso reacciona con el grupo amino de los aminoácidos. &ormando los ácidos hidroilos correspondientes, li(erando nitr!geno gaseoso. 0resento resultados positi#os en el tu(o que contenía grenetina hidrolizada de(ido que con los aminoácidos li(res %grupo amino' producto de la hidrolizarían de la proteína se logr! hacer la reacci!n, desprendiendo nitr!geno gaseoso %? 2' en forma de (ur(ueo, lo mismo que pas! con los tu(os que contenían soluci!n de grenetina sin hidrolizar ) soluci!n de al(umina de hue#o, pero en menor porci!n dicho (ur(ueo, eplicaci!n que reside en su naturaleza, de(ido a que no presenta en cantidades considera(les aminoácidos li(res. N3O Acción reguladora de aminoácidos: En esta reacci!n se pone en manifiesto como un aminoácido actMa como un ácido
o una (ase, )a que los aminoácidos son anf!teros, utilizamos hidr!ido de sodio ) ácido clorhídrico para las diferentes reacciones. 9gregamos a dos tu(os de ensa)o, en el primero colocamos 2m de %Aol. ' ) en otro 2m de agua
destilada, gotas de roo congo, primero o(ser#amos que am(os mostraron un color roo intenso, esto quiere decir que nuestras soluciones esta(an (ásicas, puesto que roo congo al contacto si sigue roo significa que nuestras soluciones están en un p (ásico, al agregarle ácido clorhídrico, el tu(o 1 ) tu(o 2 cam(iaron la coloraci!n a morado en diferentes #elocidades, el tu(o que contenía agua cam(io rápido al agregar cinco gotas, el cam(io fue en cuesti!n de segundos, mientras que en el tu(o que contenía la soluci!n cam(io lento, se le tu#ieron que agregar 1 gotas para ello, la diferencia entre las #elocidades del cam(io de cloraci!n se de(e a que los aminoácidos presentes en la soluci!n producen un efecto (Mfer que de manera amortigua o dicho en otras pala(ras hace que la reacci!n se lle#e a ca(o de manera lenta, con hidr!ido de sodio fue lo mismo solo que #iraron con fenolftaleína a color roo. El aminoácido para realizar dicho efecto de (Mfer, presenta dos centros acti#os, por una parte del lado del ion car(oilato el cual es receptor de los protones al agregar soluciones acidas, en compensaci!n del lado del ion amonio quien es receptor de los iones hidroilo ) para el tu(o 1 se necito una gota ) para el tu(o que contenía la grenetina hidrolizada < gotas, como se muestra en la siguiente imagen %&ig. '. N2O Cromatografía en placa fina: Con esta prue(a se pudo confirmar que aminoácido que está presente en la grenetina
%Aol. ' el aminoácido glicina, de acuerdo al +f, se utilizaron alcohol ter(utilico ) agua, un disol#ente apolar ) otro polar, para lograr que los aminoácidos se desplacen por lo largo de la palca de una manera gradual ) lenta para que se lograra separar cada componente de la muestra de grenetina hidrolizada, pues el agua tiene un poder elu)ente mu) potente, a comparaci!n con otro disol#ente como heano ) acetona. N1O Cuestionario
.- Indicar por medio de reacciones, el efecto regulador de aminoácidos.
<.-Eplicar los resultados o(tenidos en la prue(a del efecto regulador de los aminoácidos. El tu(o que contenía agua cam(io rápido al agregar cinco gotas, el cam(io fue en cuesti!n de segundos, mientras que en el tu(o que contenía la soluci!n cam(io lento, se le tu#ieron que agregar 1 gotas para ello, la diferencia entre las #elocidades del cam(io de cloraci!n se de(e a que los aminoácidos presentes en la soluci!n producen un efecto (Mfer que de manera amortigua o dicho en otras pala(ras hace que la reacci!n se lle#e a ca(o de manera lenta, con hidr!ido de sodio fue lo mismo solo que #iraron con fenolftaleína a color roo. El aminoácido para realizar dicho efecto de (Mfer, presenta dos centros acti#os, por una parte del lado del ion car(oilato el cual es receptor de los protones al agregar soluciones acidas, en compensaci!n del lado del ion amonio quien es receptor de los iones hidroilo ) para el tu(o 1 se necito una gota ) para el tu(o que contenía la grenetina hidrolizada < gotas. 1.- QC!mo sa(ría si la hidrolisis fue parcial o totalR >e acuerdo a las prue(as de identificaci!n pre#iamente realizadas, como en la reacci!n de (iuret )a que en esta se puedo #isualizar que eistía hidrolisis total cuando dicha prue(a resulto translucida %prue(a negati#a' de(ido a la carencia de enlaces entre los aminoácidos presentes %mezcla de aminoácidos' ) cuando la prue(a resulto con una coloraci!n intensa %prue(a positi#a ' indico la no generaci!n de dicha hidrolisis, por lo contrario, se tenía hidrolisis parcial cuando la prue(a resulta(a con una ligera coloraci!n %prue(a positi#a' )a que aMn se encontra(an presentes enlaces entre los aminoácidos. 2.- >escri(a tres tipos de hidrolisis de proteínas. •
Hidrolisis ácida: Se basa en la ebullición prolongada de la proteína con soluciones ácido fuertes (HCl y H 2 SO 4). ste !"todo destruye co!pleta!ente el triptófano y parte de la serina y la treonina.
•
•
Hidrolisis básica: #espeta los a!inoácidos $ue se destruyen por la %idrolisis anterior& pero con gran facilidad& for!a race!atos. 'or!al!ente se utilia ('aOH e aOH). Hidrolisis eni!ática: es la %idrolisis $ue se produce !ediante un grupo de eni!as lla!adas %idrolasas. stas eni!as e*ercen un efecto catalítico %idroliante& producen la ruptura de enlaces por agua seg+n: H,OH - #,#
+- B +S-4
3.- >escri(a el mecanismo que se lle#a a ca(o en la reacci!n antoproteica.
/.- Indicar cuál es la raz!n de agregar hidr!ido de sodio en la reacci!n antoproteica. 0ara neutralizar algunas trazas de ácido nítrico que pro(a(lemente no h a)an reaccionada en la AE9 e impedir que actMen con los grupos (ásicos %amino' del aminoácido. ;.-Indicar que tipo de aminoácidos de(e contener una proteína para dar positi#a la reacci!n de precipitaci!n con acetato de plomo. #"!I$NINA
CI!"INA
.- Indicar por medio de reacciones el efecto regulador de aminoácidos.
<.-Eplicar los resultados o(tenidos en la prue(a del efecto regulador de los aminoácidos. El tu(o que contenía agua cam(io rápido al agregar cinco gotas, el cam(io fue en cuesti!n de segundos, mientras que en el tu(o que contenía la soluci!n cam(io lento, se le tu#ieron que agregar 1 gotas para ello, la diferencia entre las #elocidades del cam(io de cloraci!n se de(e a que los aminoácidos presentes en la soluci!n producen un efecto (Mfer que de manera amortigua o dicho en otras pala(ras hace que la reacci!n se lle#e a ca(o de manera lenta, con hidr!ido de sodio fue lo mismo solo que #iraron con fenolftaleína a color roo. El aminoácido para realizar dicho efecto de (Mfer, presenta dos centros acti#os, por una parte del lado del ion car(oilato el cual es receptor de los protones al agregar soluciones acidas, en compensaci!n del lado del ion amonio quien es receptor de los iones hidroilo ) para el tu(o 1 se necito una gota ) para el tu(o que contenía la grenetina hidrolizada < gotas. H.-Indicar la f!rmula de los aminoácidos que identifico por cromatografía.
6licina. J.- In#estigar algunos de los aminoácidos que se encuentran presentes en grenetina ) al(umina.
%R"N"!INA
6licina
0rolina
Gcido glutámico
isina
9rginina
A&B'#INA
9lanina
9rginina
6lutamin
6licina
*etionina
&enilalanina
8ript!fano
8irosina
Gcido aspártico
istidin
0rolina
Cisteína
Isoleucina
Aerina
9cido glutámico
eucina
8reonina
Dalina
15.- In#estigar de que proteína se o(tiene la grenetina. >el colágeno Obtención de grenetina a partir de la hidrólisis parcial del colágeno de pieles, tendones y huesos Conclusión
Eisten di#ersas maneras de poder identificar compuestos orgánicos de alguna proteína, en "sta práctica realizamos di#ersas eperimentaciones que nos a)udaron a #isualizar aminoácidos, grupos aminos li(res, enlaces peptídicos, aminoácidos en anillos aromáticos ) enlaces azufrados. >e entre todas las (iomol"culas, las proteínas desempe:an un papel fundamental en el organismo. Aon esenciales para el crecimiento, gracias a su contenido de nitr!geno, que no está presente en otras mol"culas como grasas o hidratos de car(ono. 8am(i"n lo son para las síntesis ) mantenimiento de di#ersos teidos o componentes del cuerpo, asimismo, a)udan a transportar determinados gases a tra#"s de la sangre, como el oígeno ) el di!ido de car(ono, ) funcionan a modo de amortiguadores para mantener el equili(rio ácido-(ase ) la presi!n onc!tica del plasma, por lo que para un 70 es importante tra(aar ) conocer a las proteínas para su (uen desempe:o la(oral. &a hidrolisis de proteínas es un proceso en el cual se produce la ruptura de la estructura primaria, es decir la ruptura de la secuencia normal de una proteínaL lo cual termina por fragmentar las proteínas para con#ertirlas en a!inoácidos. as
proteínas están formadas por mMltiples aminoácidos que se unen entre sí por enlaces peptídicos. En cada enlace se eliminan un ion hidroilo de un aminoácido ) un ion de hidr!geno del aminoácido siguienteL así los aminoácidos sucesi#os de la cadena prot"ica están unidos por condensaci!n, ) su digesti!n se de(e al efecto opuesto la hidrolizaci!n. Bibliografía
1. - . >. >urst, 6. T 6oPel. /uí!ica Orgánica 0peri!ental& Espa:a +e#ert", 1ra Ed. 2553. 0p. J1-J. 2.- *c *urr).U. /uí!ica Orgánica. Cengage earning,