POST-PRACTICA MÉTODOS Y TÉCNICAS DE AISLAMIENTO DE AGENTES FITOPATÓGENOS (CULTIVO TRAMPA (MANZANA) PARA Phytophthora, siembra de Phytophthora, )

UNIVERSIDAD DE SAN CARLOS DE GUATEMALA FACULTAD DE AGRONOMÍA

POST-PRACTICA MÉTODOS Y TÉCNICAS DE AISLAMIENTO DE AGENTES FITOPATÓGENOS (HONGOS Y CHROMISTAS) LABORATORIO INTRODUCCIÓN A LA FITOPATOLOGÍA FITOPATOLOGÍA Ing. Agro. GUSTAVO ADOLFO ÁLVAREZ VALENZUELA

Pec Hernández Marvin Mateo Carne: 200915859 Lunes Vespertina.

GUATEMALA 16 DE SEPTIEMBRE 2011

FACULTAD DE AGRONOMÍA

1.

ÍNDICE INTRODUCCIÓN ................................................................................................................................... 3

2.

OBJETIVOS ............................................................................................................................................. 3

3.

MARCO TEÓRICO ................................................................................................................................. 4 3.1. Métodos y técnicas para el aislamiento de agentes fitopatógenos a partir de tejido vegetal ............................................................................................................................................ 4

4.

3.1.1.

Preparativos para el aislamiento (Según Agrios) ................................................................. 4

3.1.2.

Aislamiento de hojas ..................... ........... ..................... ..................... .................... ..................... ..................... ..................... ..................... ..................... ..................... .............. .... 5

MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................................................................ 6 4.1. Materiales. ...................................................................................................................................... 6 4.2. Metodología. .................................................................................................................................. 6

5.

4.2.1.

Procedimiento para efectuar la siembra .................................................................................. 6

4.2.2.

Cultivo Cultivo trampa trampa ............................ .......................................... ............................ ............................ ............................ ............................. ............................. ............................ ................... ..... 3

4.2.3.

Técnica de solución de extracto de suelo ................................................................................. 6

RESULTADOS Y DISCUSIÓN .................................. ................. .................................. ................................... .................................... ................................... ...................... ..... 8 5.1. Aislamiento de agentes fitopatógenos ............................. ................................... .................. .................................. ................. 8 5.2. Cultivo Trampa. ......................................................................................................................... 10 5.3. Técnica de solución de extracto de suelo ......................................................................... 12 5.3.1.1.

Observaciones al Microscopio. ......................................................................................... 13

6.

CONCLUSIONES ................................................................................................................................. 15

7.

BIBLIOGRAFÍA ................................................................................................................................... 16

8.

anexos .................................................................................................................................................. 17 8.1. ¿Qué otras técnicas de aislamiento se conocen para microorganismos que afectan plantas, ..................................................................................................................................... 17 8.1.1.

Aislamiento de hojas ..................... ........... ..................... ..................... .................... ..................... ..................... ..................... ..................... ..................... ..................... ............ 17

8.1.1.1.

Inducción al desarrollo micelar ....................................................................................... 17

8.1.1.

Aislamiento de tallos, frutos y otros órganos órganos aéreos de la planta.................... .......... .................... .......... 17

8.1.1.

Cultivo líquido ................................................................................................................................. 17

8.1.1.

Placas de suelo de Warcup ......................................................................................................... 17

8.1.1.

Fraccionamiento de la comunidad de hongos del suelo ................................................. 17

8.1.1.

Filtración de partículas ................................................................................................................ 18

LABORATORIO INTRODUCCIÓN A LA FITOPATOLOGÍA FITOPATOLOGÍA

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FACULTAD DE AGRONOMÍA 8.2. Investigue que tipo de medios selectivos son utilizados para desarrollar algunos microorganismos (Hongos y bacterias),...................................................................... 18 8.3. Cómo puede saber que medio utilizar cuando desea aislar un organismo patógeno a plantas (hongos o bacteria)? ..................................................................................... 20 8.3.1.

Medios Medios Básicos Básicos ........................... ......................................... ............................ ............................ ............................ ............................. ............................. ............................ .................. 20

8.3.2.

Medios Enriquecidos..................................................................................................................... 20

8.3.3.

Medios Selectivos ........................................................................................................................... 20

8.3.4.

Medios Diferenciales ..................................................................................................................... 21

8.3.5.

Medios para hongos ...................................................................................................................... 21

8.3.6.

Medio para bacterias .................................................................................................................... 21

8.3.7.

Agar V 8 ........................... ......................................... ............................ ............................ ............................ ............................ ............................ ............................ ............................. ................... 21

8.3.8.

Medio YDC (Levadura, Dextrosa, Calcio)............................................................................... 21

ÍNDICE DE FIGURAS Figura No 1 Preparativos para el aislamiento .................................................................................................. 4 Figura No 2 Metodologia de aislamiento de hongos en hojas. ................................................................... 5 Figura No 3 Lesiones provocadas por generos del phyllum Oomycota ................................................. 5 Figura No 4 Colonizacion por hongos Oomycota ............................................................................................ 5 Figura No 5 Mancha negra en Rosa ...................................................................................................................... 8 Figura No 6 Organismo Organismo aislado de hoja de rosa ..................... ........... ..................... ..................... ..................... ..................... .................... ..................... .................... ......... 8 Figura No 7 Espora asexual. bicelular esporas de hongos del anamorfo Marssonina rosae .......... 9 Figura No 8 Espora sexual Apotecio, Ascospora y ascas .............................................................................. 9 Figura No No 9 Manzana Inocualda Inocualda con suelo (Magnolia)...................... ........... ..................... ..................... ..................... ..................... .................... ............. ... 11 Figura No 10 Manzana Inoculada con raiz de Magnolia. ........................................................................... 11 Figura No No 11 Manzana inocualda inocualda con raiz de Magnolia .................... .......... ..................... ..................... ..................... ..................... .................... ............. ... 11 Figura No 12 Siembra en Medio selectivo PARPBH y siembra se semilla en solucion de suelo de las manzanas que dieron positivo la prueba del cultivo trampa. .......................................................... 12 Figura No 13 Semilla en solucion de suelo. .................................................................................................... 12 Figura No 14 Semilla en solucion de suelo. .................................................................................................... 13 Figura No 15 Montaje Montaje del micelio del Oomycota a las 24 horas de la siembra en solucion de suelo........................... ......................................... ............................ ............................ ............................ ............................. ............................. ............................ ............................ ............................ ............................ ..................... ....... 13 Figura No 16 Micelio de Phytophthora ............................................................................................................ 14 Figura No 17 Micelio Micelio de Phytophthora a las 48 horas despues de la simbra simbra ............................ ................. ................. ...... 14


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FACULTAD DE AGRONOMÍA 1. INTRODUCCIÓN En la estructura de los hongos patógenos, las diversas formas que desarrollan: Estructuras vegetativas. Estructuras propagativas. Estructuras reproductivas. Estructuras de conservación. Todo estos datos entran en juego cuando se quiere clasificar a los diferentes agentes fitopatógenos. Para que se logre observar las diferentes estructuras que se mencionaron anteriormente es necesario en algunas ocasiones y en algunos tipos tipos de hongos fitopatógenos en especial que que se necesita de poder aislarlos para determinar el agente causal. El aislamiento consiste en el proceso de separación de microorganismos a partir de su sustrato natural (plantas, hojas, tubérculos, tubérculos, tallo raíces o suelo) para hacerlas hacerlas crecer en un medio de cultivo artificial (Por ejemplo medio PDA). El aislamiento y cultivo persigue diversos diversos fines, el más común en un laboratorio de fitopatología es para diagnosticar la causa de una enfermedad desconocida. El cultivo de microorganismos tiene enormes ventajas que contribuyen al conocimiento de la biología de estos. Sin embargo, hay que considerar que al a l cultivar un organismo: Los hongos pueden o no formar cuerpos fructíferos en medios artificiales; estos cuerpos pueden presentar variación, Existen hongos que no se pueden cultivar (parásitos obligados) y otros que requieren medios complejos para su desarrollo. Las técnicas para aislar hongos son diversas y dependen del hongo a estudiar a continuación se presenta una recopilación recopilación de información sobre sobre los tipos de técnicas de aislamiento de los los diversos hongos fitopatógenos fitopatógenos que afectan a los cultivos de importancia agrícola. agrícola. 2. OBJETIVOS 

Conocer cuando se utiliza el método de aislamiento como como siembra directa.



Conocer la técnica de aislamiento de siembra en solución de suelo.



Conocer las dimensiones utilizadas en la perforación de la manzana en el la técnica de aislamiento conocida como cultivo trampa.



Determinar el tiempo que tarda en reaccionar la manzana verde inoculada inoculada con raíz de de planta para determinar la presencia de oomycotas.



Determinar el organismo oomycota


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FACULTAD DE AGRONOMÍA 3. MARCO TEÓRICO 3.1.

Métodos y técnicas para el aislamiento de agentes fitopatógenos a partir de tejido vegetal

La mayoría de las enfermedades de las plantas se diagnostican al observarlas a simple vista o mediante al microscopio, lo cual hace innecesario el aislamiento del patógeno. Sin embargo, hay muchas enfermedades bacterianas y fungosas en las que es imposible identificar al patógeno que ya se encuentra mezclado con uno o más contaminantes, porque aún no ha producido sus cuerpos fructíferos característicos y esporas, debido a que una misma enfermedad puede deberse ya sea a uno o a varios patógenos morfológicamente semejantes o tal vez a algún factor del ambiente, o bien a que la enfermedad es causada por un nuevo patógeno hasta ese momento desconocido, el cual debe aislarse y estudiarse. Como es habitual, los patógenos de enfermedades desconocidas deben aislarse de los tejidos enfermos de una planta a fin de que se pueda llevar a cabo un estudio de sus características, hábitos, etc 3.1.1. Preparativos para el aislamiento (Según Agrios) Siempre que se desee aislar una bacteria o un hongo patógeno de los tejidos de una planta enferma, deben llevarse a cabo los siguientes procedimientos preliminares. preliminares.

Figura No 1 Preparativos para el aislamiento


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FACULTAD DE AGRONOMÍA 3.1.2. Aislamiento de hojas En caso de que la infección de las hojas de una planta avance en forma de tizón o mancha foliar fungosa y en caso de que las esporas del hongo aparezcan sobre su superficie, algunas de esas esporas deben depositarse sobre una caja de Petri que contenga medio de cultivo. En ocasiones, el aislamiento del patógeno a partir de tizones y manchas foliares bacterianas o fungosas se logra mediante la esterilización superficial de la zona infectada con soluciones de Cloro o de Rada, separando una pequeña porción del tejido infectado con un escalpelo estéril u otro objeto y colocándola en una caja de Petri que contenga un medio nutritivo. Sin embargo, el método más común para aislar a los patógenos de las hojas infectadas y de otros órganos de la planta es aquel en el que se seleccionan varios cortes pequeños de 5 a 10 mm2 a partir del borde de la lesión infectada, a fin de que contenga tejidos enfermos y tejidos al parecer sanos (figura 2). Los cortes esterilizados en su superficie durante menos tiempo generalmente contienen al patógeno y a varios contaminantes, mientras que los que se han esterilizado durante más tiempo no permiten el desarrollo de cualquier tipo de microorganismos debido a que han sido destruidos por el esterilizante de superficie.

Figura No 2 Metodologia de aislamiento de hongos en hojas.


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FACULTAD DE AGRONOMÍA 4. MATERIALES Y MÉTODOS 4.1.

Materiales.

Material vegetal enfermo, Una manzana o tomate verde, Caja con instrumental de laboratorio, Cristalería estéril (vidrios de reloj y cajas Petri), Medios de cultivo, Mechero, Alcohol, Hipoclorito de sodio,

4.2.

Agua destilada y estéril, Papel absorbente estéril, Asa, Pinzas, Atomizador, Papel absorbente, Film, Marcador indeleble, Microondas, Campana de flujo laminar.

Metodología.

4.2.1. Procedimiento para efectuar la siembra Las porciones porciones de tejido vegetal vegetal se depositaron en el primer vidrio de reloj reloj (agua estéril).

Seguidamente se traslado al vidrio de reloj que contiene alcohol, permanecio durante 30 seg.

Posteriormente Posteriormente se traslado al siguiente vidrio de reloj que contiene agua estéril, para eliminar el exceso de alcohol.

Seguidamente se procedio a pasarlos al siguiente vidrio de reloj con hipoclorito de sodio, permanecio durante durante a 30 segundos.

Posteriormente Posteriormente se paso sucesivamente sucesivamente en los dos vidrios de reloj que contienen agua estéril.


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Se colocar las porciones de tejido sobre una hoja de papel filtro estéril, para quitarles el exceso de agua.

Pasar las porciones de tejido a papel estéril con el fin de eliminar e liminar el exceso de agua en los tejidos.

Depositar las porciones de tejido en la caja petri o tubo de ensayo donde se hará crecer el microorganismo.

Cuidar que el recipiente se encuentre cerca de la llama del mechero, evitar exhalar sobre el medio de cultivo.

Previo a introducir el tejido enfermo, debe flamear la boca del recipiente donde se cultivará cultivará el microorganismo. microorganismo.

Las cajas petri deberán identificarse con el nombre de la persona y día de laboratorio e incubarse a 28 ºC durante 8 días.


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FACULTAD DE AGRONOMÍA 4.2.2. Cultivo trampa

Desinfección del área de trabajo

Desinfección de Manzana

Desinfección del material raíz de magnolia

Con un sacabocados a cada fruta se le hacen de 3 a 4 perforaciones, (1x1 cm.) y con una profundidad de 1.5 cm


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Llenar agujeros con material raíz de magnolia

Llenar agujeros con material raíz de magnolia magnolia Sellarlo y colocarle fecha

Incubarlo a temperatura ambiente

Posteriormente incuban en un recipiente cerrado a temperatura ambiente por espacio de 36 a 48 horas, luego de las cuales pueden verse las lesiones ocasionadas por Pythium o Phytophthora alrededor de los puntos de inoculación. En la figura 3 se muestra un proceso de incubación a medio ambiente. Cuando la inoculación resulta positiva y el agente coloniza dentro de la manzana, pueden observarse lesiones firmes color marrón rodeando los puntos de inoculación. En la figura 4 se muestran los síntomas desarrollados y considerados como positivos a la presencia de Oomycetos en frutas de manzana inoculadas con un sustrato considerado como sospechoso de contener a alguno de estos patógenos LABORATORIO INTRODUCCIÓN A LA FITOPATOLOGÍA FITOPATOLOGÍA

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Figura No 3 Lesiones provocadas por generos del phyllum Oomycota

Figura No 4 Colonizacion por hongos Oomycota

Se procedio al aislamiento “in vitro” en medio de cultivo selectivo (PARPBH ), para ello se

cortan las manzanas que presentan síntomas positivos y se procedio a extraer tejido infectado de pulpa en la región más externa de la lesión o zona de avance. Se muestra la forma en que es separada cada una de las lesiones y se procede a observar su consistencia y velocidad de avance. Simultáneamente se procede a cultivar las semillas de la fruta en solución de suelo para que genere estructuras reproductivas.


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FACULTAD DE AGRONOMÍA 4.2.3. Técnica de solución de extracto de suelo

• Se peso 50 g de suelo y se mezclo con 500 cc de agua.

1

• Se dejo por 24 horas reposando la solución.

2

• Se tomaron 100 cc de la solución y se aforo a 1000 cc con agua destilada

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• Se esterilizo en autoclave por 20 minutos a 15 psi

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utilizar. • La solución se dejo enfriar y está lista para utilizar. 5 • Para provocar provocar desarrollo desarrollo de esporangios, se colocaron en una caja de Petri, 10

6

cc de la solución y se depositaron en ella las semillas con micelio de Pythium y Phytophthora, Phytophthora, provenientes provenientes de las manzanas inoculadas con suelo o raíces y que habian dado positivo. positivo.

• Se identifican las cajas y se dejaron temperatura temperatura ambiente . El micelio crece en

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el término de 24-48 horas


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Desinfección área de trabajo

Positivo

Solución de suelo

Corte de la manzana

Preparación área de trabajo área de trabajo

Siembra de Semillas en solución de suelo

Siembra del Oomycota en medio de cultivo selectivo (PARPBH)


Sellado he identificacion

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FACULTAD DE AGRONOMÍA 5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 5.1.

Aislamiento de agentes fitopatógenos En las hojas se observaron diferentes manchas grandes de color color pardo a negro, tenía la forma de estrella. Las hojas se tornan de un color amarillo y posteriormente se caen. Esta enfermedad debilita a la planta debido debido a que su fuente de producción de nutrientes es afectado n este caso es la hoja Se tomaron pedazo tanto tanto de la parte sana como enferma de la hoja afectada como se menciona en la metodología.

Figura No 5 Mancha negra en Rosa

El hongo inverna en forma de micelio o como ascósporas y conidios en las hojas y tallos de los rosales infectados ambos tipos de esporas producen infecciones primarias de hojas en la primavera mediante penetración directa. El micelio se desarrolla en el mesófilo, pero al cabo de dos semanas forma acérvulos y conidios en el haz de la hoja (fase sexual).

Figura No 6 Organismo aislado de hoja de rosa

De los aislamientos realizados no se logró la siembra correcta solo uno de los cuatro reacciono al medio empezando a crecer los micelios del hongo, pueden haber varios motivos por los cuales no se logró que los demás pedazos de tejido no hayan crecido en el medio puede que el tejido tomado simplemente no contenía al hongo, otra otra de las causas puede ser que los tejidos se hallan colocado demasiado tiempo en los compuestos tanto de alcohol o hipoclorito, esto debido a que como se observa en la figura 6 las porciones de tejidos parecer estar muertas o secas dentro del

medio de cultivo. Según varias investigaciones en literatura literatura el agente causal de la enfermedad el cual se aisló probablemente es Diplocarpon rosae que es conocida comúnmente como la mancha negra negra de la rosa.


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FACULTAD DE AGRONOMÍA rosa Punto Negro enfermedad. enfermedad. Debido a que fue Diplocarpon rosae es un hongo que causa la rosa observado por personas de varios países al mismo tiempo (alrededor de 1830), la nomenclatura de los hongos variados con cerca de 25 nombres diferentes. La etapa asexual se sabe ahora que Marssonina rosae , mientras que el estado sexual y más común se conoce como Diplocarpon rosae . Diplocarpon rosae en temporadas como micelio, ascosporas y conidias en las hojas y tallos. En

la primavera durante condiciones húmedas y húmedas, ascosporas y conidios son llevados por el viento y la lluvia salpica al tejido de la hoja de reciente aparición. Tras la infección, la enfermedad progresa a partir de las hojas más bajas hacia arriba provocando la defoliación y manchas de negro en las hojas. hojas. Pertenece al phyllum ascomycota Este hongo ascomycota ascom ycota en su fase asexual se le conoce como Marssonina rosae y como se observa en la figura 7, lo que se esperaría es observar las esporas bicelular. Es muy característico en este hongo.

Figura No 7 Espora asexual. bicelular esporas de hongos del anamorfo Marssonina rosae

Fuente: http://www.ipmimages.org/browse/detail.cfm?imgnum=5368965

En la fase sexual lo que se observaría sería una estructura de resistencia del tipo apotecio que dentro tendría ascosporas y dentro de estas se encontrarían encontrarían ascas, debido a esto es que a este hongo se le clasifica en el phyllum ascomycota.

Figura No 8 Espora sexual Apotecio, Ascospora y ascas

Fuente: http://www.ipmimages.org/browse/detail.cfm?imgnum=5390063 LABORATORIO INTRODUCCIÓN A LA FITOPATOLOGÍA FITOPATOLOGÍA

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FACULTAD DE AGRONOMÍA 5.2.

Cultivo Trampa.

FOTOGRAFÍA (SIEMBRA DE RAÍZ DE MAGNOLIA)

FECHA

CARACTERÍSTICAS

30/08/2011

En esta fotografía lo que se observa es el hongo recién inoculado por lo que todavía no muestra indicios de presencia del Oomycota.

01/09/2011

A las 48 horas todavía la manzana no mostraba características de presencia del hongo, sin embargo cabe destacar que la consistencia consistencia de la manzana manzana ya no no era la misma como se mostraba inicialmente.

02/09/2011

La manzana que contenía las raíces de magnolia que se sospechaba que estaba infectada con phytoptora phytoptora era la que más indicios mostraba de la presencia del Oomycota

05/09/2011

Tanto la manzana que contenía suelo como las que contenían raíces, era un diagnostico positivo de la presencia del Oomycota.


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La manzana que contenía suelo fue la que tardo más en reaccionar a la presencia del Oomycota Oomycota esto puede ser porque las condiciones ambientales del suelo no eran las óptimas en el momento de la tomas de la muestra por lo que la cantidad de Oomycotas presentes no era tan alta.

Figura No 9 Manzana Inocualda con suelo (Magnolia).

Unas de las manzanas que fue inoculada con raíces de Magnolia (Magnolia guatemalensis ) esta fue reacciono en menor tiempo en comparación con la que fue inoculada con suelo, esto no da la pauta de que la planta planta estaba infestada con el Oomycota.

Figura No 10 Manzana Inoculada con raiz de Magnolia.

La tercera manzana al igual que la segunda que también fue inoculada con raíces de la planta infestada con el Oomycota, presentaba una diagnostico positivo de la presencia del hongo. hongo. Esto corrobora corrobora lo que se intuía de debido a que la planta donde fueron tomadas las muestras presentaba síntomas característicos de la presencia del Oomycota.

Figura No 11 Manzana inocualda con raiz de Magnolia


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Técnica de solución de extracto de suelo Las tres manzanas a las cuales se les practicó la prueba del cultivo trampa y dieron positivo también pasaron a la siguiente prueba el cual era la determinación del genero de Oomycota el cual era la que estaba afectando a las plantas. El Oomycota trata de moverse moverse hacia hacia el centro de la manzana porque tiende a llegar a las semillas semillas esto debido a que las semillas son ricas en energía, porque están llenas de reservas para la nueva planta planta que germinara por eso el Oomycota busca siempre llegar a ella. Por lo que la para la siembra en el medio selectivo PARPBH se toma porciones de la manzana en la zona conocida como zona de avance del hongo que

Figura No 12 Siembra en Medio selectivo PARPBH y siembra se semilla en solucion de suelo de las manzanas que dieron positivo la prueba del cultivo trampa.

está cercano donde están las semillas.

A las 24 horas de la siembra de las semillas en solución de suelo la primea primea en reaccionar reaccionar fueron las semillas semillas extraídas de la manzana inoculada con raíces de la planta infectada, confirmando confirmando con ello que, que, esta es la que mayor infestación del Oomycota tenía. El micelio del hongo tiene una coloración blanca blanca y crece rápidamente porque las semillas tienen muchos nutrientes que el Oomycota necesita. La solución del suelo su función es la de simularle al Oomycota que está en el suelo y por lo tanto ataca a la semilla. Figura No 13 Semilla en solucion de suelo.


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A las 24 después de la siembra de semillas de manzana en solución de suelo la que menos reacciono fueron las semillas prevenientes de la manzana la cual fue inoculada con suelo. Esto porque como se mencionó anteriormente, como posible causa que en el suelo no haya un alta cantidad del Oomycota.

Figura No 14 Semilla en solucion de suelo.

5.3.1.1.

Observaciones al Microscopio.

Figura No 15 Montaje del micelio del Oomycota a las 24 horas de la siembra siembra en solucion de suelo

A las 24 horas después de la siembra el Oomycota solo había producido hifas y esto hacia que que no se pudiera determinar si era phytopthora o no porque no tenía características específicas por lo que había que esperar mas tiempo.


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A las 48 horas después de la siembra en solución de suelo se realizó nuevamente un montaje sobre el oomycota, pero lo que se encontró es una contaminación del micelio de este hongo con otros hongos. Pero después de una cuidadosa selección de la parte que se necesitaba se encontró con el micelio de Phytophthora Figura No 16 Micelio de Phytophthora

Figura No 17 Micelio de Phytophthora a las 48 horas despues de la simbra

En el montaje que que se ve en el lado izquierdo de la figura 17 17 se muestra el micelio de Phytophthora, pero al lado derecho se hace una aceración de ello y se observa observa el oogonio característico de este oomycota, además de ello se muestra de una oósporo que se esperaría que a lo largo del tiempo mostrase mostrase este microorganismo. microorganismo. Por lo que después de una largo largo proceso se llegó a determinar determinar que la planta planta de magnolia si estaba infestada infestada con Phytophthora. Phytophthora.


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6. CONCLUSIONES En caso de que la infección de las hojas de una planta avance en forma de tizón o mancha foliar fungosa y en caso de que las esporas del hongo aparezcan sobre su superficie, algunas de esas esporas deben depositarse sobre una caja de Petri que contenga medio de cultivo (raspado). Técnica de siembra directa de suelo, este método se lleva a cabo introduciendo fragmentos del suelo fresco en la superficie de placas con diferentes medios de cultivo, para posteriormente observar el crecimiento micelial de los hongos presentes en las muestras. El cultivo trampa no es más que los trozos de tejido se introdujeron en orificios de 5 mm de diámetro y 30 mm de profundidad, hechos en frutos maduros de manzana verde luego se cubrieron con cinta de enmascarar y se dejaron a temperatura ambiente. El tiempo que tardó en reaccionar la manzana a la cual se le inoculo raíces de planta infectada con Phytophthora Phytophthora fue de 3 dias. dias. En el cultivo trampa el organismo que se llegó a determinar es Phytophthora Phytophthora sp.


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FACULTAD DE AGRONOMÍA 7. BIBLIOGRAFÍA 1. AGRIOS, G. 1998. Fitopatología.5ª.Edición.EditorialM Fitopatología.5ª.Edición.EditorialMcGraw-Hill.México.928p. cGraw-Hill.México.928p. 2. Loredo Vega Vega J. Universidad Autónoma De Sinaloa Unidad Regional Norte Norte Escuela

Superior De Agricultura Del Valle Del Fuerte Manual De Prácticas Del Laboratorio De Fitopatología. Consultado el 17 de Septiembre 2011. Disponible en: http://www.slideshare.net/jloveuas/manual-de-prcticas-fitopatologa-3025383.. http://www.slideshare.net/jloveuas/manual-de-prcticas-fitopatologa-3025383 3. Arias E. Aislamiento e identificación de hongos filamentosos del suelo. Trabajo de grado. Universidad Universidad Javeriana, Bogotá Colombia. Consultado el 16 de Septiembre 2011. Disponible en: http://ciagrope.tripod.com/fitote20.html http://ciagrope.tripod.com/fitote20.html.. 4. Principios de fitopatología, Universidad Central de Venezuela, Facultad de Agronomía. Consultado el 10 de Septiembre 2011 Disponible en: en:http://www.ucv.v http://www.ucv.ve/fileadmin/user_upload/facultad_agron e/fileadmin/user_upload/facultad_agronomia/Clase_1_PRINCIPIO omia/Clase_1_PRINCIPIO S_DE_FITOPATOLOG%C3%8DA.pdf 5. Universidad de la República, Facultad de Agronomía, Departamento de Protección Vegetal, Monte Monte Video Video Uruguay. Uruguay. Practica Practica de hongos. hongos. Consultado el 18 de Septiembre Septiembre 2011. Disponible en: http://www.pv.fagro.edu.uy/fitopato/cursos/fi http://www.pv .fagro.edu.uy/fitopato/cursos/fitopato/practicas/hongos.html topato/practicas/hongos.html y http://www.pv.fagro.edu.uy/fitopato/cursos/fi http://www.pv .fagro.edu.uy/fitopato/cursos/fitopato/practicas/clave_bacterias.html topato/practicas/clave_bacterias.html 6. Fitopatología General, Universidad Agraria de Molina, Departamento de fitopatología. Lima, Perú. Consultado el 18 de Septiembre 2011. Disponible http://tarwi.lamolina.edu.pe/~fon molina.edu.pe/~fonz/fitogen/PDF/APUN z/fitogen/PDF/APUNTES%20DE%20CLA TES%20DE%20CLASES1.pdf SES1.pdf en:http://tarwi.la


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8.1.

8. ANEXOS ¿Qué otras técnicas de aislamiento se conocen para microorganismos que afectan plantas,

8.1.1. Aislamiento de hojas En caso de que la infección de las hojas de una planta avance en forma de tizón o mancha foliar fungosa y en caso de que las esporas del hongo aparezcan sobre su superficie, algunas de esas esporas deben depositarse sobre una caja de Petri que contenga medio de cultivo. 8.1.1.1.

Inducción al desarrollo micelar

Se recomienda que el hongo crezca y esporule sobre medios de cultivo, recomendable para hongos que crecen en el interior del hospedante y/o que esporulen poco en el tejido, tales como hongos de la raíz. Este método es el más usado cuando se requiere tener a un hongo en cultivo puro. 8.1.1. Aislamiento de tallos, frutos y otros órganos órganos aéreos de la planta La mayoría de los métodos que se han descrito para aislar bacterias y hongos patógenos de las hojas, pueden también utilizarse para aislar esos mismos patógenos de las infecciones superficiales de los tejidos mencionados. 8.1.1. Cultivo líquido En esta técnica se toman 10 g (equivalente peso seco) de suelo fresco y se adiciona a erlenmeyers de 1000 mL con una solución de agua destilada estéril, peptona al 0,1%, Tween 80 al 0,5% y Cloramfenícol (400ppm) 0,005mg/mL. Se coloca la mezcla en shaker giratorio durante 48 horas para luego dejarlo en incubación estática hasta observar el desarrollo de micelios en el líquido (aproximadamente 1 semana). 8.1.1. Placas de suelo de Warcup Fue desarrollado por Warcup en 1950, las placas se preparan dispersando pequeñas cantidades (0.2-5 mg) de suelo pulverizado en una caja de petri estéril, se adiciona agar a las placas y se agita lentamente para dispersar las partículas. 8.1.1. Fraccionamiento de la comunidad de hongos del suelo Esta técnica involucra la preseparación de propágulos del suelo utilizando centrifugación por gradiente de densidad antes de la aplicación en los medios de aislamiento. Se aíslan específicamente, las esporas de diferentes tamaños.


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FACULTAD DE AGRONOMÍA 8.1.1. Filtración de partículas Se denomina también "lavado de suelo" y permite el aislamiento de hongos de fragmentos de micelio sumergidos en el sustrato, reduciendo la recuperación de colonias de hongos originarios de esporas; de igual forma el aislamiento de especies con clamidosporas también es favorecido ya que sus propágulos no son removidos del todo to do por el lavado. 8.2.

Investigue que tipo de medios selectivos son utilizados para desarrollar algunos microorganismos (Hongos y bacterias),


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Cómo puede saber que medio utilizar cuando desea aislar un organismo patógeno a plantas (hongos o bacteria)?

Inicialmente con los síntomas y signos que presente presente el microorganismo microorganismo o alguno de los cortes realizados nos dan indicios indicios si es un hongo hongo o una una bacteria partiendo partiendo de eso después se puede seleccionar varios medios para su utilización se puede empezar con medios básicos, y dependiendo la reacción del microorganismo microorganismo podemos llegar hasta un medo diferencial para para estar seguros de que el organismo aislado es el requerido requerido Para estudiar los microorganismos (p. ej.: hongos, bacterias) se necesita como requisito previo cultivarlos en condiciones de laboratorio, para lograr esto, es preciso conocer cuáles son los nutrientes y las condiciones físicas que requieren. Por medio de estudios se ha logrado determinar las necesidades nutricionales de hongos y bacterias en forma general. Aunque algunas especies de estos microorganismos necesitan condiciones más específicas para poder desarrollarse. La preparación de medios de cultivo es importante para desarrollar microorganismos fuera de su ambiente natural y demostrar sus propiedades en el diagnóstico. En fitopatología se utilizan muchos medios. Estos medios varían ampliamente, de acuerdo a las necesidades particulares de los microorganismos bajo estudio. 8.3.1. Medios Básicos Estos son los medios más simples, que sólo contienen lo necesario para proporcionar a los microorganismos los aminoácidos, vitaminas, sales, y pequeñas cantidades de carbono, nitrógeno, hidrógeno y otros elementos. Existen medios de cultivos líquidos y medios de cultivo sólidos. Los medios de cultivo que no contienen agar o cualquier otro agente solidificante son medios líquidos. Para el estudio de las características de las colonias es indispensable el uso de medios sólidos. La solidificación se consigue agregando agar, gelatina, albúmina de suero o de huevo. 8.3.2. Medios Enriquecidos La adición de componentes como sangre, suero o extractos de tejidos de animales y plantas al los medios básicos, les proporcionan sustancias nutritivas complementarias para que el medio pueda soportar el crecimiento de los organismos exigentes 8.3.3. Medios Selectivos Son usualmente medios de agar básico o enriquecidos, a los cuales se les han agregado ciertos reactivos que impiden el crecimiento de la mayoría de las bacterias, permitiendo por lo tanto, el crecimiento de unas cuantas seleccionadas, en los especímenes que contengan grandes número de microorganismos indeseables.


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FACULTAD DE AGRONOMÍA 8.3.4. Medios Diferenciales Son medios básicos o enriquecidos, a los cuales se les han agregado ciertos reactivos que reaccionarán con algunos tipos específicos de bacterias en cierta forma observables. Por ejemplo: cuando se agrega lactosa y rojo neutro al agar nutritivo (medio básico de cultivo), las bacterias fermentadoras de lactosa de diferenciarán de las no fermentadoras de lactosa por la formación de productos finales ácidos, demostrables por un cambio de color (rojo en un pH ácido) del rojo neutro. Como es natural, al añadir algunas substancias inhibidoras a los medios diferenciales, puede hacérseles selectivos así como diferenciales. La mayoría de los llamados medios diferenciales son de este último tipo. La bacteria del género Xanthomonas y Erwinia presenta una coloración amarillenta en el medio diferencial llamado YDC (levadura, dextrosa, calcio). 8.3.5. Medios para hongos A excepción de algunas especies de hongos, la mayoría de los mismos se desarrollan bien sobre un medio que contenga Papa, Dextrosa y Agar (PDA). 8.3.6. Medio para bacterias El medio para bacterias a utilizar es el conocido como Agar Nutritivo (AN). Se utiliza para el aislamiento de la mayoría de las bacterias, como medio en la identificación. 8.3.7. Agar V 8 Este medio es muy útil para promover la esporulación de ciertos hongos y para el desarrollo de otros muy exigentes en nutrientes. El jugo V 8 es un producto que contiene extractos de tomate, zanahoria, apio de vitaminas y minerales. 8.3.8. Medio YDC (Levadura, Dextrosa, Calcio) Se utiliza para la identificación de las bacterias del género Xanthomonas y Erwinia, las cuales dan una coloración amarillenta en este medio.


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POST-PRACTICA MÉTODOS Y TÉCNICAS DE AISLAMIENTO DE AGENTES FITOPATÓGENOS (CULTIVO TRAMPA (MANZANA) PARA Phytophthora, siembra de Phytophthora, )

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