METODOS DE SIEMBRA Y CULTIVO
INTRODUCCION:
Para efectuar el estudio de los microorganismos, se han diseñado diversos métodos que permiten cultivarlos bajo condicione artificiales, en los que es posible cultivarlos bajo condiciones experimentales y manejar un solo tipo de micr microo oorg rgan anis ismo mo.. Una Una de las las técn técnic icas as más más usad usadas as en el labo labora rato tori rio o de microbiología consiste en transferir una muestra microbiológica de un ambiente determinado a un medio de cultivo, lo que permite obtener cultivos microbianos. A l efectuar este procedimiento, es necesario considerar que en el área de trabajo, existen muchos otros microorganismos; debido a esto, es necesario tomar precauciones para impedir que éstos penetren y contaminen los cultivos en estudio. Por otra parte, para considerar considerar no sólo el aspecto nutricional, nutricional, sino también las condiciones ambientales de su hábitat natural, por lo que en el medio de cultivo se debe ajustar el pH y concentración de sales y durante la incubación condiciones tales como la temperatura, aireación la luminosidad. La aplic licació ación n de estos stos proc proced edim imie ient ntos os ha permi ermiti tid do pro propag pagar a los los microorganismos en cultivos mixtos, así como su aislamiento y la obtención de cultivos puros, facilitando de este modo, el estudio, caracterización, aplicación y control de los mismos. La forma de sembrarlos y cultivarlos depende del tipo de microorganismo y propósito específico del estudio. OBJETIVOS: • • •
•
Aprender los principales métodos de siembra de microbiología mi crobiología Aprender los principales métodos de cultivo existentes Aplicar la técnica adecuada para preparar el área de trabajo y evitar contaminaciones. Seleccionar y aplicar las técnicas de siembra adecuadas para alcanzar propósitos específicos.
FUNDAMENTO TEORICO:
Cultivar un microorganismo significa promover intencionalmente el desarrollo de éste en medios de cultivo y condiciones de laboratorio controladas. La población de microorganismos desarrollada en un medio se denomina cultivo. Cuando Cuando éste éste contien contiene e una sola sola espec especie ie de microo microorga rganis nismo, mo, se denomi denomina na cult cultiv ivo o puro puro oax oaxénic énico, o, cuan uando contie ntiene ne más más de una esp especie ecie de microo microorga rganis nismos mos se denom denomina ina cultiv cultivo o mixto. mixto. Un cultiv cultivo o tipo tipo conti contiene ene una una especie conocida de microorganismos y es conservada en el laboratorio para realizar diversos ensayos y estudios. Un cultivo cultivo axénico axénico consiste en una sola especie especie microbiana, microbiana, provenient proveniente e de una sola célula. Los cultivos axénicos son muy raros en la naturaleza. En los medios naturales -por ejemplo, en el suelo, agua, o en el cuerpo humanoexisten cultivos mixtos. En un cultivo mixto, viven muchas y diferentes especies
de forma conjunta. Un cultivo axénico se obtiene artificialmente en el laboratorio. A la hora de obtener un cultivo axénico se han de tomar precauciones especiales, ya que los microorganismos están por todas partes, en la naturaleza, en el laboratorio y en los instrumentos y recipientes usados en los experimentos. Estos microorganismos no deseados o contaminantes deben ser eliminados de un cultivo para que éste pueda ser axénico. El segundo paso para obtener un cultivo axénico es inocular o introducir, una sola célula de un microorganismo en un medio sólido o liquido, esterilizado previamente. De esta manera, aislamos un solo microorganismo del resto y se podrá multiplicar en condiciones favorables. Unclon está constituido por una población de células descendientes de un solo microorganismo. Una colonia es un clon lo suficientemente grande como para ser visible sobre la superficie de un medio sólido. Un cultivo microbiano que ha estado creciendo por cierto tiempo en el mismo tubo o matraz, debe ser transferido a un medio de cultivo nuevo, de otra manera el crecimiento y sobrevivencia no pueden continuar. En esta transferencia se deben considerar dos aspectos básicos referentes a: no introducir microorganismos indeseables (contaminantes) y concentración o carga microbiana de la muestra (inóculo) a sembrar. Para impedir la contaminación de los cultivos, es necesario tener plena conciencia de la ubicuidad de los microorganismos, lo que determina que el aíre y todas las superficies estén densamente pobladas por microorganismos, de este modo en la transferencia de una muestra microbiológica a otro recipiente, se deben tener una serie de cuidados que eliminen los riesgos de contaminación. Estos incluyen el área de trabajo, el lavado de las manos, la esterilización de todos los utensilios y medios de cultivo a emplear y realizar la transferencia del microorganismo en una zona estéril, la que se obtiene trabajando cerca de la flama del mechero. Al conjunto de procedimientos realizados para prevenir o evitar la contaminación se le llama técnica aséptica; el seguimiento cuidadoso y detallado de la misma evita accidentes tales como: La contaminación y pérdida del cultivo en estudio La salida y dispersión de microorganismos del cultivo, lo que ocasionaría la contaminación de utensilios, productos y del personal. Este último aspecto es particularmente importante cuando se trabaja con cultivos de microorganismos patógenos. Con relación a la concentración del inóculo, un error frecuente del principiante consiste en tomar muestras grandes, lo que es innecesario. Una colonia de bacterias del tamaño de la cabeza de un alfiler contiene varios millones de microorganismos, es obvio que con una cantidad pequeñísima (casi invisible) que se adhiera al asa, será más que suficiente para efectuar una transferencia exitosa. Dispositivos empleados en la transferencia de muestras microbianas: hisopo, pipeta (para uso microbiológico son terminales y la parte superior o boquilla debe estar protegida con filtro de algodón), pipeta pasteur, cable de Kolle o portasa con alambre de platino dispuesto en forma de: aguja, asa, espátula y/o gancho. En la transferencia de microorganismos se emplean agujas, asas de inoculación, hisopos, pipetas o pipetas pasteur que deberán esterilizarse previamente. La utilización de estos dispositivos, así como de los diferentes medios de cultivo tienen aplicaciones específicas. Por ejemplo: los medios • •
líquidos se preparan en tubos o matraces que se cubren con tapones de algodón o tapones especiales. Un cultivo líquido puede ser transferido mediante un asa microbiológica, un hisopo, pipeta o pipeta pasteur; el inóculo se deposita dentro del caldo o medio líquido. En este tipo de cultivos los microorganismos presentan un desarrollo particular que se manifiesta en la superficie o a través de todo el líquido. Una de las ventajas que presenta este tipo de cultivo se refiere a la posibilidad de agitarlos acelerando la velocidad de microorganismos anaerobios, por otra parte, en este tipo de cultivos, las poblaciones se encuentran suspendidas y e fácil homogenizarlas, lo que permite estandarizar la concentración del inóculo. La desventaja que presentan, e que en ellos e difícil detectar contaminación a simple vista. Los medios semisólidos e preparan en tubos, se inoculan con aguja de siembra (asa recta) o pipeta pasteur; en este último caso es necesario calentar el medio y cuando se encuentra en estado líquido y a una temperatura de aproximadamente 42ºC se agrega el inóculo, se homogeniza y se deja solidificar. Estos medios se emplean para estudiar la movilidad de los microorganismos y para favorecer la separación de microorganismos con diferentes requerimientos de oxígeno. Los medios sólidos e preparan en tubos o matraces dependiendo de la cantidad o de las necesidades, después de esterilizarlos, estos se inclinan o vierten en cajas de petri. La siembra se realiza con el asa, inoculando la superficie del agar con mucha suavidad; en estos medios, los microorganismos al multiplicarse forman agregados que se hacen visibles a simple vista; a estos agregados se les denominan colonias, las que presentan características que varían con el tipo de microorganismo cultivado y el medio de cultivo empleado. En cualquier medio de cultivo es de primordial importancia ajustar el pH, ya que aún cuando la mayoría de los microorganismos crecen mejor en pH neutro, algunos requieren de pH alcalino o ácido, por lo que al proporcionar un pH adecuado se favorecerá el crecimiento del microorganismo de interés y la obtención del cultivo. Con este mismo propósito durante la incubación se deben proporcionar las condiciones adecuadas para el microorganismo en estudio. El crecimiento óptimo de los microorganismos se presenta a temperaturas que la mayoría de las veces están relacionadas con la de su hábitat natural. Algunos microorganismos crecen por debajo de 15ºC, otros requieren temperaturas más elevadas (30 a 45ºC) y algunos hasta 80ºC. Para alcanzar y mantener estas temperaturas se puede usar una incubadora microbiológica o un baño de agua a temperatura constante, en tanto que para lo microorganismos que presentan su crecimiento óptimo a temperaturas entre 20 y 25ºC se pueden incubar en la gaveta o cajón del laboratorio, a temperatura ambiente. En general las incubadoras microbiológicas satisfacen las necesidades en cuanto a los rangos de temperatura requeridas por los microorganismos. La desventaja que tienen es que estos aparatos funcionan con aíre seco, lo que determina la deshidratación de los medios de cultivo. Por lo tanto, el crecimiento de cualquier cultivo experimental que se realice en incubadora no debe prolongare por más de nueve días. Con relación a las necesidades gaseosas, no todos los microorganismo crecen en presencia de oxígeno atmosférico; los que sólo crecen en presencia de aíre se llaman aerobios obligados; los que sólo crecen en ausencia de oxígeno se denominan anaerobios obligados o estrictos, un tercer grupo se adapta a las dos
condiciones y se le conoce como facultativos. Existe una cuarta categoría que comprende bacterias que requieren oxígeno, pero sólo lo utilizan cuando éste existe en concentraciones reducidas; a estos se les llama microaerofílicos. El desarrollo de estos diferentes grupos e favorece mediante la agitación de los cultivos o mediante la exclusión de oxígeno para lo que se emplean sustancias reductoras o equipos especiales. Las bacterias son organismos procarióticos, se encuentran ampliamente distribuidas en la naturaleza, habitan en el agua, el suelo, en la superficie o en el interior de plantas y animales incluyendo al hombre. Pueden vivir en forma libre o en simbiosis con otros organismos, ya sea como parásitos, comensales o mutualistas. Fisiológicamente este grupo presenta características muy variables, hay bacterias móviles e inmóviles fotosintéticas y quimiotróficas, autótrofas y heterótrofas; se desarrollan en un rango muy amplio de temperatura, pH y condiciones gaseosas. En el estudio de cultivos bacterianos algunos de los criterios que se emplean para caracterizarlas incluyen: tamaño, morfología celular, forma de agrupación, reacción a la tinción de Gram, formación de esporas, movilidad, presencia de inclusiones de reserva y características culturales en medios líquidos y sólidos en los que presentan patrones de desarrollo en cuanto a la forma, tamaño, elevación y color de las colonias. Técnicas de siembra: El método de siembra por estría en placa:
Es el método más fácil y el más usado para obtener cultivos axénicos. Para ello, con un asa de siembra se toma una muestra de la población mixta y a continuación se hacen estrías sobre la superficie de un medio sólido preparado en una placa Petri (a las placas Petri también se les denomina simplemente placas). Conforme se van haciendo estrías en zigzag con el asa, cada vez se van depositando en la superficie del medio menos microorganismos. A continuación, se flamea el asa, se toca en la región donde se han realizado las últimas estrías y se continúa la siembra con la misma técnica, en la superficie de medio sin sembrar aún. Repitiendo este proceso varias veces se logra separar células individuales. A continuación, las placas se incuban en un lugar adecuado, permitiendo que las células aisladas experimenten un número suficiente de divisiones para formar colonias visibles. Aunque cada colonia posiblemente representa un clon derivado de una sola célula, no podemos asegurarlo. Quizás, dos células quedaron depositadas tan juntas que han originado una única colonia mixta. Por tanto, para asegurarnos de que hemos obtenido un cultivo axénico, conviene repetir el procedimiento a partir de una colonia bien aislada en la primera placa. Las colonias que se desarrollen la segunda vez, serán, casi con toda seguridad, cultivos axénicos. Los métodos de vertido en placa y extensión en placa
En estos métodos, las suspensiones de células microbianas se diluyenantes de su siembra en placa. Se siguen estas técnicas cuando la muestra contiene tantos microorganismos, que la dilución no se puede realizar en una sola etapa. Por ejemplo, una suspensión con mil millones de células por mililitro debe ser diluida 107 veces para obtener una suspensión con un centenar de células por mililitro, Por tanto, se realizan diluciones seriadas (en varias etapas), normalmente de diez en diez, pero a veces de cien en cien. Para realizar diluciones de diez en diez, se añade 1 ml de la suspensión bacteriana a 9 ml (le
medio estéril o solución salina, igualmente estéril. Se agita vigorosamente para diluir las células y el proceso se repite cuantas veces sea necesario. A continuación, se puede proceder de dos maneras diferentes. En el método de vertido en placa, las muestras diluidas se mezclan con agar fundido y se vierten en placa. Algunas colonias quedarán embebidas en el agar y otras crecerán en la superficie. Las colonias superficiales se extenderán y serán más grandes. En el segundo método (extensión en placa), las muestras diluidas se siembran directamente en la superficie de la placa de agar, extendiéndolas con avuda de un asa de Diralsky de cristal estéril. La suspensión se absorbe en el agar, dejando las células microbianas sobre la superficie. En ambas técnicas las placas se incuban hasta la aparición de las colonias. Como en el método de siembra por estría, no existe la seguridad de que las colonias que aparecen en las placas sembradas por extensión o en el agar solidificado sembrado por el método del vertido en placas sean cultivos axénicos hasta que se repita el proceso. Las dos técnicas de siembra por dilución presentan la ventaja de que permiten obtener un mayor número de colonias aisladas que el método de siembra por estría, por tanto se eligen cuando se ha de seleccionar una cepa a partir de una mezcla con varios tipos de microorganismos.
MATERIALES:
materiales
reactivos
•
• • • •
placas petri tubo de ensayo pipetas asa aguja de kolle
PROCEDIMEINTO: A) SIEMBRA EN TUBOS: 1. Siembra en tubos a. Siembra de un tubo de ensayo a otro
El tubo con el material para la siembra y el tubo con el medio de cultivo se toman ambos con la mano izquierda en forma inclinada, detal manera que los extremos de ambos tubos estén a un mismo nivel.
Con la mano derecha se toman con el asa de kolle y se esterilizan en posición vertical en el mechero, con la misma mano se extrae los dos tapones con el dedo meñique y el siguiente apoyándolos a la palma al mismo tiempo, se flamea el extremo de los dos tubos; con el asa se toma un poco de material de siembra, luego de enfriarla y con cuidado se le traslada al tubo con el medio de cultivo.
Forma de retirar el algodón del tubo
Esterilización del asa
•
Cuando la siembra es de un caldo de cultivo, el asa con el material, se introduce en un líquido por la pared inferior del tubo y se extrae por la pared superior. Ojo: El caldo del cultivo no debe mojar el tapón de algodón
•
Para sembrar un agar inclinado al asa con el material se le da movimientos de zig-zag en la superficie del agar de abajo hacia arriba.
Siembra en superficie
•
Para sembrar en una columna de a agar vertical (por picadura), se utiliza una aguja, la cual se esteriliza bajo mechero, y con el material de siembra se introduce hasta el fondo y se lo retira (debe de ser en el medio de tubo sin rozar las paredes)
Siembra por picadura
•
•
a.
La siembra de en una caldo se puede realizar con una pipeta de Pasteur o una pipeta graduada. Luego de la siembra las pipetas se las coloca en un líquido desinfectante. Las siembras también pueden realizarse con tampones Siembra a un tubo con medio de cultivo desde una placa petri
La placa petri con el material de siembra se coloca frente a uno con la tapa hacia arriba. Se esteriliza el asa, se abre la placa bajo el mechero, se toma con el asa un poco de material, se retira el asa, se cierra la placa y con la mano izquierda se toma el tubo con el medio de cultivo. La siembra se realiza como en los casos anteriores.
2.
Siembra en placa petri a.
Técnica de la placa estriada en sectores (en superficie)
La placa petri con agar se divide en sectores (4 cuadrantes). La siembra se realiza con un asa (con material se siembra), sobre el agar realizando movimientos de zig-zag desde un extremo de la placa hacia en centro de ella. Es necesario que las estrías no toquen los sectores vecinos. Esterilizar el asa al terminar la siembra luego de cerrar la placa y colocar la placa con la tapa hacia abajo.
b.
Técnica de siembra con un extensor (en superficie)
Con la mano izquierda levantar la tapa de la placa petri bajo mechero, sosteniéndolo con el dedo índice y el pulgar. Con una asa o pipeta se vierte el material de siembra a la superficie del agar, y con el extensor se cubre toda la superficie con el material haciendo movimientos giratorios. Al final se extrae el extensor, se cierra la placa y se coloca el extensor en una solución desinfectante. Colocar la placa con la tapa hacia abajo.
c.
Técnica de vaciado en placa por incorporación
Rotular las placas. Colocar el material de siembra con una pipeta en cada placa (1 ml.). Agregar el agar; realizar movimientos de vaivén para distribuir bien el material. Colocar las placas con la tapa hacia arriba hasta que enfríe el agar. Invertirlas en el momento de llevarlas a incubar.
5.
RECOMENDACIONES:
•
•
•
6.
Antes de utilizar los materiales (pipetas, tubos, asas, etc.) éstos deben de ser esterilizados correctamente en el laboratorio tomando siempre las precauciones. Cada vez que se termina una siembra siempre hay que esterilizar el asa de kolle (flameándola con el mechero) para obtener los resultados esperados en el experiemnto. En el caso de los tubos de ensayo, flamear la boca de éstos antes de colocar el tapón. Marcar los tubos con la identificación del cultivo, la fecha y el nombre para no confundir las placas.
CONCLUSION:
•
8.
Se pudo conocer los métodos de siembra y cultivo más utilizados en el laboratorio de microbiología y dándonos ha conocer correctamente el método que hemos utilizado en la practica.
BIBLIOGRAFIA
Libro: •
R. DÍAS, C. GAMAZO, I. LOPEZ GOÑI microbiología
Referencias en WEB: •
www.goolge.com
•
http://es.wikipedia.org/wiki/mediosdecultivo
•
www.monografias.com
RECOEMNDACIONES:
Manual práctico de
CONCLUSION:
Por medio de esta práctica se logró utilizar las técnicas aprendidas durante el transcurso del curso. Se logró aprender a realizar algunos de los métodos que existen para cultivar bacterias y de esta manera observar sus características tanto macroscópicas como microscópicas e interpretación de las mismas, con lo que se observó que para cada bacteria existen características diferentes que son las que las identifican y diferencian de otras bacterias, por lo que de esta manera se le puede llegar a identificar con su correcta siembra y observación para análisis posteriores o simplemente para la identificación de una bacteria en algún medio u organismo.
BIBLIOGRAFIA: •
• •
• •
Romero Cabello, R. Microbiología y Parasitologìa Humana: Bases etiológicas de las enfermedades infecciosas. Editorial Panamericana, México 2001. 2ºed. Pp.257-429 http://www.uam.es/personal_pdi/ciencias/jolope/GUIONPRACTICAS050 6.doc http://es.wikipedia.org/wiki/ http://www.ucm.es/info/mfar/pdfs/GuiaMicro2.pdf
