Preparacion de Medios de Cultivo y Siembra de Bacterias en Medios de Cultivo

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CALLAO

FACULTAD DE INGENIERIA QUIMICA Laboratorio de microbiología de los alimentos

PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO Y SIEMBRA DE BACTERIAS EN MEDIOS DE CULTIVO

I.

Objetivos





II.

relacionar la composición de los diversos medios de cultivo cultivo con sus características y aplicaciones. Familiarizarse con las técnicas empleadas en microbiología para el cultivo y la manipulación de microorganismo en condiciones de esterilidad

Marco teórico

2.1 MEDIOS DE CULTIVO Uno de los sistemas más importantes i mportantes para la identificación de microorganismos es observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio. El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio de Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo. Se han preparado más de 10.000 medios de cultivo diferentes. Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artif icial debe reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presión de oxígeno adecuado, así como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar exento de todo microorganismo contaminante. La mayoría de las bacterias patógenas requieren nutrientes complejos simi lares en composición a los líquidos orgánicos del cuerpo humano. Por eso, la base de muchos medios de cultivo es una infusión de extractos de carne y Peptona a la que se añadirán otros ingredientes. El agar es un elemento solidificante muy empleado para la preparación de medios de cultivo. Se licúa completamente a la temperatura del agua hirviendo y se



solidifica al enfriarse a 40 grados. Con mínimas excepciones no tiene efecto sobre el crecimiento de las bacterias y no es atacado por aquellas que crecen en él. La Gelatina es otro agente solidificante pero se emplea mucho menos ya que bastantes bacterias provocan su licuación. En los diferentes medios de cultivo se encuentran numerosos materiales de enriquecimiento como hidratos de carbono, suero, sangre completa, bilis, etc. Los hidratos de Carbono se adicionan por dos motivos fundamentales: para incrementar el valor nutritivo del medio y para detectar reacciones de fermentación de los microorganismos que ayuden a identificarlos. El suero y la sangre completa se añaden para promover el crecimiento de los microorganismos menos resistentes. También se añaden colorantes que actúan como indicadores para detectar, por ejemplo, la formación de ácido o como inhibidores del crecimiento de unas bacterias y no de otras (el Rojo Fenol se usa como indicador ya que es rojo en pH básico y amarillo en pH ácido. La Violeta de Genciana se usa como inhibidor ya que impide el crecimiento de la l a mayoría de las bacterias Gram-positivas).

2.2 Tipos básicos de medios de cultivo Atendiendo a su estado estado físico: 

Líquidos



Semisólidos

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Sólidos

Atendiendo a su utilidad práctica: práctica: 

Medios para aislamientos primarios: Para usos generales: no selectivos, para cultivo de una amplia variedad de organismos difíciles de hacer crecer. A menudo m enudo están enriquecidos con materiales como: sangre, suero, Hemoglobina, FX, FV, glutamina, u otros factores accesorios para el crecimiento de las bacterias (Agar Sangre, Schaeadler, etc.)





Selectivos: (pueden ser de moderada o de alta selectividad) se añaden sustancias que inhiban el crecimiento de ciertos grupos de bacterias, permitiendo a la vez el crecimiento de otras. Variando la sustancia añadida, se varía el tipo y grado de selectividad (Mac Conkey, Kanamicina-Vancomicina)



Enriquecidos: ralentizan/suprimen el crecimiento de la flora competitiva normal potenciando el cultivo y crecimiento deseado (Selenito, medio con Vitamina K).

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Para aislamientos especializados: formulaciones nutritivas especiales que satisfacen requerimientos de grupos específicos de bacterias, ayudando a su identificación (Lowenstein).

2.3 Condiciones generales para el cultivo de microorganismos micr oorganismos El desarrollo adecuado de los microorganismos en un medio de cultivo se ve afectado por una serie de factores de gran importancia y que, en algunos casos, son ajenos por completo al propio medio. 

disponibilidad de nutrientes adecuados

Un medio de cultivo adecuado para la investigación microbiológica ha de contener, como mínimo, carbono, nitrógeno, azufre, fósforo y sales i norgánicas. En muchos casos serán necesarias ciertas vitaminas y otra sustancia inductoras del crecimiento. Siempre han de estar presentes las sustancias adecuadas para ejercer de donantes o captadores de electrones para las reacciones químicas que tengan lugar. Todas estas sustancias se suministraban originalmente en forma de infusiones de carne, extractos de carne o extractos de levadura. Sin embargo, la preparación de estas sustancias para su aplicación a los medios de cultivo provocaba la pérdida de los factores nutritivos lábiles.



Actualmente, la forma más extendida extendida de aportar estas sustancias sustancias a los medios es utilizar peptona que, además, representa una fuente fácilmente asequible de nitrógeno y carbón ya que la mayoría de los microorganismos, que no suelen utilizar directamente las proteínas naturales, tienen capacidad de atacar los aminoácidos y otros compuestos más simples de nitrógeno presentes en la peptona. Ciertas bacterias tienen necesidades nutritivas específicas por lo que se añade a muchos medios sustancias como suero, sangre, líquido ascítico, etc. Igualmente pueden ser necesarios ciertos carbohidratos y sales minerales como las de calcio, magnesio, manganeso, sodio o potasio y sustancias promotoras del crecimiento, generalmente de naturaleza vitamínica. Muy a menudo se añaden al medio de cultivo ciertos colorantes, bien como indicadores de ciertas actividades metabólicas o bien por sus capacidades de ejercer de inhibidores selectivos de ciertos microorganismos. 

consistencia adecuada del medio

Partiendo de un medio líquido podemos modificar su consistencia añadiendo productos como albúmina, gelatina o agar, con lo que obtendríamos medios en estado semisólido o sólido. Los medios solidificados con gelatina tienen el gran inconveniente de que muchos microorganismos no se desarrollan adecuadamente a temperaturas inferiores al punto de fusión de este solidificante y de que otros tienen la capacidad de licuarla. Actualmente los medios sólidos sólidos son de uso universal, universal, por su versatilidad y comodidad, pero hay también gran cantidad de medios líquidos cuyo uso está ampliamente extendido en el laboratorio. 

presencia (o ausencia) de oxígeno y otros gases

Gran cantidad de bacterias pueden crecer en una atmósfera con tensión de oxígeno normal. Algunas pueden obtener el oxígeno directamente de variados



sustratos. Pero los microorganismos anaerobios estrictos sólo se desarrollarán adecuadamente en una atmósfera sin oxígeno ambiental. En un punto intermedio, los microorganismos microaerófilos crecen mejor en condiciones atmosféricas parcialmente anaerobias (tensión de oxígeno muy reducida), mientras los anaerobios facultativos tienen un metabolismo capaz de adaptarse a cualquiera de las citadas condiciones.

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condiciones adecuadas de humedad

Un nivel mínimo de humedad, tanto en el medio como en la atmósfera, es imprescindible para un buen desarrollo de las células vegetativas microbianas en los cultivos. Hay que prever el mantenimiento de estas condiciones mínimas en las estufas de cultivo a 35-37ºC proporcionando una fuente adecuada de agua que mantenga la humedad necesaria para el crecimiento de los cultivos y evitar así que se deseque el medio. 

Luz ambiental

La mayoría de los microorganismos crecen mucho mejor en la oscuridad que en presencia de luz solar. Hay excepciones evidentes como sería el caso de los microorganismos fotosintéticos. 

pH

La concentración de iones hidrógeno es muy importante para el crecimiento de los microorganismos. La mayoría de ellos se desarrollan mejor en medios con un pH neutro, aunque los hay que requieren medios más o menos ácidos. No se debe olvidar que la presencia de ácidos o bases en cantidades que no impiden el crecimiento bacteriano pueden sin embargo inhibirlo o incluso alterar sus procesos metabólicos normales. 

Temperatura



Los microorganismos mesófilos crecen de forma óptima a temperaturas entre 15 y 43ºC. Otros como los psicrófilos crecen a 0ºC y los termófilas a 80ºC o incluso a temperaturas superiores (hipertemófilos). En líneas generales, los patógenos humanos crecen en rangos de temperatura mucho más cortos, alrededor de 37ºC, y los saprofitos tienen rangos más amplios. 

Esterilidad del medio

Todos los medios de cultivo han de estar perfectamente estériles para evitar la aparición de formas de vida que puedan alterar, enmascarar o incluso impedir el crecimiento microbiano normal del o de los especímenes inoculados en dichos medios. El sistema clásico para esterilizar los medios de cultivo es el autoclave (que utiliza vapor de agua a presión como agente esterilizante)

2.4 Métodos de preparación de medios 

1.

Preparación de un medio solido en placa: Pesar la cantidad de medio (si el preparado contiene agar debemos

añadirlo a una concentración de 15g/l) y rehidratarlo agua destilado en una botella 2.

Autoclavar la botella sin cerrar totalmente el tapón de rosca

3.

Sacar del autoclave, enroscar del todo el tapón e introducir la botella en

un baño a 40ºc al menos durante 30 minutos. 4.

Distribuir el medio en las placas de petri que están estériles dentro de una

campana de flujo laminar o en las proximidades del mechero, flameando bien la boca de la botella para evitar las contaminaciones. 5.

Dejar que el medio solifique.





1.

Preparación de medio solido en tubo (slant)

Pesar el medio que contenga agar y rehidratar con agua destilada en un

matraz 2.

Fundir el medio en un horno microondas o en una placa caliente. el medio

debe hervir hasta que se vuelve transparente. 3.

Distribuir rápidamente el medio en los tubos antes de que comience a

solidificar para ello se empleara una pipeta y los tubos no se llenaran más de un tercio de su volumen. 4.

Autoclavar

5.

Sacar de la autoclave e inclinar los tubos sobre la poyata para obtener

tubos con medio de slant. 

1. 2.

Preparación de medio liquido en tubo (caldo)

Pesar y rehidratar el medio Distribuirlo con una pipeta en los tubos (sin llenarlos más de 1/3 de su volumen)

3.

Autoclavar

4.

Sacar del autoclave y dejar enfriar

5.

Todos los medios se guardan en nevera a 4ºc

2.5 Realización de la siembra a) Siembra en medio liquido Se introduce el asa de siembra en el tubo con cultivo crecido y se toma un inoculo que se lleva al tubo estéril con medio liquido (agitándolo en el seno del medio)

b) Siembra en placa Dividida la placa en tres partes, sembrar en cada tercio el inoculo tomado de los cultivos crecidos .se introduce el asa de siembra e n el tubo con cultivo crecido y se toma una gota de inoculo que se extiende sobre el agar de la placa deslizando el asa suavemente por su superficie en zig-zag.



c) Siembra en agar inclinado Se introduce el asa de siembra en el tubo con cultivo crecido y se toma un inoculo que se extiende sobre el agar inclinado deslizando el asa suavemente por su superficie en zig-zag. En el caso del medio TSI, la siembra se deberá realizar tanto en superficie (aerobiosis) como en la población del agar (anaerobiosis).

2.6 Incubación De los medios sembrados a 37ºc hasta que haya haya habido crecimiento bacteriano. bacteriano.



2.7 Investigación:

1. AGAR SALMONELLA SHIGELLAM Usos: El Agar Salmonella Shigella, también conocido como Agar SS, es utilizado para el aislamiento de especies de Salmonella y Shigella a partir de muestras clínicas y de alimentos.

Formulación por litro de agua purificada Extracto de carne

5.0

Mezcla de peptonas

5.0

Lactosa

10.0

Mezcla de sales biliares

8.5

Verde brillante

0.33

Citrato de sodio

8.5

Tiosulfato de sodio

8.5

Citrato férrico

1.0

Rojo neutro

0.025

Agar bacteriológico

PH: 6.8-7.2

13.5



2. ORANGE SERUM AGAR Usos Medio utilizado para el cultivo y recuento de microorganismos acidúricos, particularmente los asociados con el deterioro de jugos de f ruta, especialmente de cítricos. También es útil para el cultivo de hongos saprófitos y patógenos.

Fundamento En el medio de cultivo, la tripteína y el extracto de levadura aportan los nutrientes necesarios para el adecuado desarrollo bacteriano. La glucosa es el hidrato de carbono fermentable, y el suero de naranja le otorga un ambiente ácido, favorable para el desarrollo de microorganismos tolerantes a l as condiciones de acidez.

formula Agar

15g

Suero de naranja

200nl

Extracto de levadura

3.0g

Tripteina

10.0g

Glucosa

4.0g

Fosfato dipotasico

2.5g

Agua desmineralizada desmineralizada

800ml PH : 5.3-5.7



3. AGAR TCBS Usos Medio selectivo para el aislamiento y cultivo de Vibrio cholerae, Vibrio parahemolyticus y otras especies de Vibrio a partir de heces, agua y alimentos contaminados. También es conocido como Agar Tiosulfato Citrato Bilis Sacarosa, o como Agar Selectivo para Vibrios.

Formulación(en gramos por litro) Extracto de levadura

5.0

Peptona de carne

5.0

Tripteína

5.0

Suspender 89 g del

Citrato de sodio

10.0

polvo en un litro de agua

Tiosulfato de sodio

10.0

destilada. Calentar hasta

Bilis de buey

8.0

ebullición y hervir de 1 a

Sacarosa

20.0

2 minutos. NO

Cloruro de sodio

10.0

AUTOCLAVAR. Distribuir

Citrato férrico

1.0

en placas de Petri

Azul de bromotimol

0.04

estériles

Azul de timol

0.04

Agar

15.0 PH: 8.4-8.8



4. AGAR XLD Usos BD XLD Agar (Xylose Lysine Desoxycholate Agar) (agar BD XLD [agar xilosalisina-desoxicolato]) es un medio moderadamente selectivo y de diferenciación para el aislamiento y la diferenciación de patógenos entéricos gram negativos (Salmonella y Shigella) de muestras m uestras clínicas y no clínicas. Es adecuado en especial para el aislamiento de la especie Shigella. REACTIVOS Fórmula por litro de agua purificada xilosa L-lisina lactosa sacarosa Cloruro sódico Extracto de levadura Rojo fenol Desoxicolato de sodio Tiosulfato sódico Citrato ferrico0 de amonio Agar PH 7,4 ± 0,2

3.5g 5.0 7.5 7.5 5.0 3.0 0.08 2.5 6.8 0.8 13.5



5. CALDO AZIDA GLUCOSA Usos Medio utilizado para el enriquecimiento selectivo de enterococos en aguas, alimentos y otros materiales de importancia sanitaria. Fundamento El medio permite un enriquecimiento selectivo de Enterococcus spp. La tripteína, el extracto de carne y la glucosa constituyen la fuente nutritiva, mientras que la azida sódica es inhibidora de la flora Gram negativa. El cloruro de sodio se usa para mantener el equilibrio osmótico del medio Fórmula (en gramos por litro) tripteina Extracto de carne glucosa Cloruro de sodio Azida sódica

15.0 4.8 7.5 7.5 0.2

PH final: 7.2 ± 0.2 6. CALDO EC

USO Medio utilizado para el recuento de coliformes totales, coliformes fecales y Escherichia coli en agua, alimentos y otros materiales. Fundamento El contenido de lactosa en este medio, f avorece el crecimiento de bacterias lactosa positivas, mientras que las sales biliares inhiben el crecimiento de gran parte de la flora f lora acompañante. Fórmula (en gramos por litro) TRIPTEINA Lactosa Sales biliares Nº3 Fosfato dipotasico Fosfato monopotasico Cloruro de sodio

PH final: 6.9 ± 0.2 20.0 5.0 1.9 4.0 1.5 5.0



7. LAURIL SULFATO CALDO

Uso Medio recomendado por A.P.H.A. para detección y recuento de coliformes en aguas, aguas residuales y alimentos. Fundamento Medio rico en nutrientes, que permite un rápido desarrollo de los microorganismos fermentadores de la lactosa, aún de los fermentadores lentos. La triptosa es la fuente de nitrógeno, vitaminas, minerales y aminoácidos, la lactosa es el hidrato de carbono fermentable, las sales de fosfato proveen un sistema buffer, y el cloruro de sodio mantiene el balance osmótico Es un medio selectivo, ya que el lauril sulfato de sodio inhibe el desarrollo de la flora acompañante. Por la fermentación de la lactosa, se produce ácido y gas, éste último se evidencia al utilizar las campanas Durham. Fórmula (en gramos por litro) triptosa lactosa Cloruro de sodio Fosfato dipotasico Fosfato monopotasico lauril sulfato de sodio

20.0 5.0 5.0 0.1 2.75 2.75

PH final: 6.8 ± 0.2

8. CALDO PURPURA DE BROMOCRESOL Uso Adicionado de carbohidratos carbohidratos se emplea para pruebas pruebas de fermentación en la diferenciación bioquímica de microorganismos, especialmente del grupo entérico. Formulación Cloruro de sodio Extracto de carne Peptona especial Purpura de bromocresol PH: 6.8-7.2

5.0 1.0 10.0 0.015



9. CALDO RAPPAPORT Uso Es utilizado para el enriquecimiento de los microorganismos pertenecientes del género salmonella, provenientes de diferentes tipos de muestras. Formulación Cloruro de magnesio hexahidratado Cloruro de sodio Fosfato monopotasico Peptona de caseína Peptona de soya verde de malaquita verde de malaquita

29.0 8.0 0.4 4.0 1.0 0.036

PH: 5-5.2

10. CALDO SELENITA CISTINA Uso Medio selectivo de enriquecimiento para recuperación de microorganismos del género salmonella a partir de muestras fecales, alimentos farmacéuticos, agua, etc. Formulación Fosfato de potasio lactosa L-cistina Peptona especial Selenito de sodio acido PH: 6.8-7.2

10.0 4.0 0.01 5.0 4.0



11. PARKER AGAR

Uso Es un medio moderadamente selectivo y de diferenciación para el aislamiento y recuento de staphylococcus aureus de alimentos, muestras m uestras ambientales y clínicas Formula por litro de agua purificada Bacto trytone Bacto beef extract Bacto yeast extract Cloruro de litio glicina Piruvato sódico Telúrito potásico agar Emulsión de yema de huevo PH: 6.5-7.1

10g 5.0 1.0 5.0 12 10 0.1 20 50.ml



12. AGAR TWEEN Uso Medio recomendado para la detección y recuento de una amplia gama de microorganismos. La presencia de lecitina y tween permite neutralizar la actividad bacteriana, facilitando la investigación de los gérmenes en productos o superficies que contengan: contengan: aldehídos, derivados fenolicos o amonio amonio cuaternario. Formulario (por litro) Tween 80 lecitina Peptona de caseína Peptona de soja Sodio cloruro agar PH: 7.1-7.5

5.0g 0.7g 15.0g 5.0g 5.0g 20.5g

13. CALDO BRILA Usos Este medio está recomendado para el recuento de coliformes totales y fecales, por la técnica del número más probable. Fundamento En el medio de cultivo, la peptona aporta los nutrientes necesarios para el adecuado desarrollo bacteriano, la bilis y el verde brillante son los agentes selectivos que inhiben el desarrollo de bacterias Gram positivas y Gram negativas a excepción de coliformes, y la lactosa es el hidrato de carbono fermentable. Es una propiedad del grupo coliforme, la fermentación de la lactosa con producción de ácido y gas. FORMULACION

PH: 7-7.4

Bilis de buey deshidratada

20.0

lactosa

10.0

peptona

10.0

Verde brillante

0.0133



14. CALDO CALDO TIOGLICOLATO USOS Utilizado en procedimientos cualitativos para la prueba de esterilidad y para el aislamiento y cultivo de aerobios como anaeróbicos y microaerofilos que no son exigentes en exceso. En microbiología clínica se puede utilizar como medio de enriquecimiento para muestras clínicas. Formulación (g/L) tripteina Peptona de soya Glucosa Cloruro de sodio agar L-cistina Sulfito de sodio

PH: 6.8-7.2

17 3 6 2.5 0.5 0.7 0.25 0.1



15. AGAR BPLS Uso Medio de cultivo selectivo para el aislamiento de salmonella excepto S a partir de materiales patológicos. Heces, orina, alimentos, etc. Formulación (g/L) Peptona de carne Peptona de caseína Extracto de carne Cloruro sódico Hidrogenofosfato disodico lactosa sacarosa Rojo de fenol Verde brillante agar PH: 6.7-7.1

5 5 5 3 2 10 10 0.08 0.0125 12



2.8 Conclusiones 

Los medios de cultivo están conformados por nutrientes favorables para la proliferación de microorganismos.



Tenemos que esterilizar los materiales a utilizar para el cultivo de microorganismos para evitar la contaminación.

Preparacion de Medios de Cultivo y Siembra de Bacterias en Medios de Cultivo

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