ESCUELA NORMAL MIXTA PCIA. DE SAN LUÍS FORMACIÓN PROFESIONAL PARA AYUDANTES DE LABORATORIO NOMBRE:
COMISIÓN:
TEÓRICO-PRÁCTICO Nº 5: MÉTODOS DE SIEMBRA Y AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS INTRODUCCIÓN
Una técnica esencial en Microbiología es la de obtención de cultivos puros, a partir de los cuales podemos realizar estudios sobre las propiedades de los microorganismos. Un cultivo puro es aquel aquel que contiene contiene una sola clase de microorgani microorganismo. smo. Para poder obtenerlo es necesario concurrir a las técnicas conocidas como aislamiento. SIEMBRA Sembrar una bacteria es colocarla en un medio de cultivo, elegido de acuerdo a
las exigencias vitales del microorganismo, lo que permite su desarrollo y multiplicación, multiplicación, si se incuba en condiciones adecuadas. Para ello una pequeña porción de cultivo o muestra, que se denomina inóculo se transfiere al medio con precauciones especiales de asepsia a fin de evitar la introducción de otros microorganismos ajenos al inóculo. El conjunto de pasos a efectuar para lograr una siembra correcta, se conoce como técnica aséptica. La toma del inóculo es simple, pero se requiere tener en cuenta lo siguiente:
La siembra siempre debe realizarse al abrigo de las corrientes de aire (cerrar bien
puertas y ventanas), con movimientos pausados, poco amplios, sin brusquedad y sin hablar.
Coloque frente a usted el mechero y la preparación o muestra que contiene los
microorganismos, así como el resto del material necesario (portaobjetos, tubos, placas). Todo ello ha de ser alcanzado con facilidad y sin tropiezos.
Se debe trabajar a una distancia no mayor de 15 cm. de la llama de un mechero.
El ansa de siembra se esteriliza por flameado directo (flaméelo hasta que alcance
un color rojo incandescente) y antes de retirar el inóculo debe facilitarse su enfriamiento, a fin de evitar la muerte de los microorganismos a sembrar (enfríelo en la proximidad de la llama unos 10 a 15 segundos).
Una vez realizada la siembra se esteriliza nuevamente el ansa a la llama del
mechero antes de depositarla sobre la mesada de trabajo.
Introducción a la Microbiología
Nunca debe depositarse un tapón sobre la mesada o gradilla, pues estos
elementos están cargados de microorganismos.
Cuando esté destapado, mantener el tubo en la forma más horizontal posible para
evitar que los microorganismos del ambiente, en su caída, tengan acceso al interior.
Las bocas de los tubos de donde se toman los cultivos y la de aquellos a donde
serán transferidos, deben pasarse ligeramente sobre la llama inmediatamente antes de que el ansa sea introducida. También se debe flamear la boca del tubo antes de taparlo. Este procedimiento fija al vidrio los microorganismos que pueden estar en dicha boca y tiende a crear corrientes hacia afuera (el aire tiende a salir), disminuyendo así el riesgo de contaminación.
Para retirar el inóculo o sembrar medios de cultivos en placas de Petri, coloque la
placa invertida sobre la mesada de trabajo y levante la parte que contiene el medio de cultivo con los microorganismos. Llévela a la proximidad de la llama del mechero y tome el inóculo con el ansa de siembra. Otro método permitido consiste en retirar el inóculo o sembrar, levantando la tapa solo lo suficiente para permitir la introducción del ansa, para evitar que los microorganismos ambientales se depositen en la superficie del medio.
Si la siembra se realiza con pipeta, ésta debe estar convenientemente preparada
y esterilizada hasta el momento de su empleo. Una vez utilizada se descarta introduciéndola en una solución antiséptica (hipoclorito de sodio al 5%).
Transfiera el inóculo a otro medio de cultivo estéril, tomando las mismas
precauciones en su manejo (flameando bocas de tubos, trabajando en la proximidad de la llama, etc.). La finalidad de una siembra puede ser la de realizar una transferencia o un aislamiento. La primera se efectúa con cultivos puros (una sola especie bacteriana), ya sea con el objeto de renovar el medio de cultivo para perpetuar la especie, o bien para conocer alguna de sus propiedades culturales o bioquímicas. El aislamiento, en cambio, se realiza a partir de un material que contiene una mezcla de especies bacterianas y su objeto es separarlas para obtener cultivos puros.
TOMA DEL INÓCULO
Si la muestra proviene de un medio líquido, el inóculo se toma agitando suavemente el ansa dentro del mismo, quedando la muestra adherida por tensión superficial en el extremo del filamento del ansa de siembra. Si el medio es sólido y se encuentra en superficie la muestra a sembrar (placa de Petri), tome una pequeña porción de cultivo mediante un ligero roce con el ansa de siembra. Si la muestra se encuentra en la profundidad del agar (tubo con agar en pico de
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flauta), hunda el filamento dentro del medio hasta tomar una pequeña porción de la misma. Flamee la boca del tubo antes de taparlo y colóquelo en el soporte necesario. TRANSFERENCIA
La técnica que se aplica depende de la consistencia de los medios de cultivo y del tipo de recipiente que los contiene. Para trasladar los microorganismos de un medio de cultivo a otro, utilizamos el ansa de siembra . Esta ansa consta de un filamento de platino, que puede ser recto o terminado en anillo. Para facilitar el manejo, este filamento está sujeto a un mango aislante.
a) b)
a) ansa en anillo b) ansa en punta Antes de poner en contacto el ansa de siembra con los microorganismos tenemos que esterilizarla a la llama del mechero hasta que todo el filamento quede incandescente. Dejamos enfriar cerca de la llama y luego podemos introducirla en el recipiente que contenga el cultivo o la muestra que queremos trasladar. Se pueden presentar los siguientes casos:
Siembra en tubos sobre medios sólidos
a) Siembra en picadura o punción Se introduce el ansa en punta con el inóculo en un tubo conteniendo agar en columna, sin tocar las paredes del tubo y en forma paralela asegurándose que el inóculo quede distribuido a lo largo de toda la punción. Esta técnica nos permite conocer el comportamiento de los microorganismos frente al oxígeno y su movilidad. b) Siembra en estrías Se toma el material con ansa recta o en anillo y se siembra en estrías en un tubo que contiene agar pico de flauta o agar inclinado.
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Siembra en superficie sobre medios sólidos
a) Siembra en agotamiento por estrías Con el ansa cargada de material hacemos una serie de estrías paralelas no superpuestas sobre una tercera parte de la superficie de la placa de medio de cultivo. Esterilizamos el ansa y hacemos una serie de estrías en dirección perpendicular a la anterior, comenzamos donde esta termina. Este procedimiento se repite varias veces. El flameado del ansa disminuye la cantidad de microorganismos que extendemos en la misma, de forma que una vez inoculadas las placas en estufa durante 24 – 48 hs a la temperatura adecuada, obtendremos colonias aisladas en las últimas estrías, separadas unas de otras, permitiendo a partir de las mismas la obtención de cultivos puros mediante resiembra.
b) Siembra con espátula de Drigalsky Se pipetea un volumen de inóculo y se deposita sobre la superficie de la placa de Petri que contiene el medio de cultivo solidificado. Con una espátula de Drigalsky estéril (previamente embebida en alcohol, flameada y enfriada) se disemina la muestra por toda la superficie, efectuando movimientos de rotación hasta su completa absorción.
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Esta técnica permite sembrar inóculos sobre superficies grandes, para obtener un crecimiento confluente que nos permite estudiar en efecto de antimicrobianos y el recuento de colonias.
c) Siembra con hisopo Se embebe un hisopo de algodón estéril en un tubo que contiene un cultivo líquido previamente homogeneizado. Se elimina el exceso de inóculo presionando el hisopo contra las paredes internas del tubo. Se disemina el inóculo por toda la superficie de la placa con el medio sólido; para ello se estría toda la placa en una dirección (teniendo la precaución de alcanzar bien los bordes de la placa) partiendo de los bordes hacia el centro, luego se gira 90º y se estría nuevamente toda la superficie, finalmente se gira 45º y se vuelve a estriar. Esta técnica permite sembrar inóculos abundantes sobre superficies grandes a los fines de obtener un crecimiento confluente que nos permita estudiar el efecto de los antimicrobianos.
d) Siembra en placa vertida Se lleva un volumen de inóculo a un tubo que contiene agar fundido y templado (45ºC), se homogeiniza y se vierte el contenido en una placa de Petri estéril, se agita la placa efectuando movimientos rotatorios en ambas direcciones para distribuir sus contenidos y se deja solidificar. 5
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Una vez incubada a temperatura adecuada, observamos colonias en profundidad (inmersas en el medio) y en la superficie.
Descripción de las colonias
Si se toma un ansa cargada con una muestra que contenga bacterias y se van haciendo estrías de ésta sobre una placa de agar nutritivo de tal manera que el material se vaya “diluyendo” sobre la superficie llegará un momento en que las bacterias depositadas en la estría estén bien separadas unas de otras, reproduciéndose cada una en progresión geométrica (1, 2, 4, 8, 16, 32, 64, etc.). Dependiendo del tiempo de generación, que varía según la especie bacteriana, después de cierto tiempo, cada una se habrá multiplicado muchas veces, formando sobre la superficie del medio un pequeño promontorio constituido por células bacterianas llamado Colonia, que se obtiene generalmente en unas 24-48 horas. Las colonias de cada especie bacteriana son diferentes ya sea en tamaño, color, consistencia, etc., y pueden ser diferenciadas sobre estas bases. Cada colonia aislada está constituida de un solo tipo de bacterias, ya que se supone que es la descendencia de una sola célula y por tanto, un cultivo puro. Para estudiar las características físicas, químicas, fisiológicas, etc., de una bacteria, se necesita que ésta sea aislada en cultivo puro y el aislamiento en placa de Petri es el primer paso para ello, siendo el segundo paso la siembra de una porción de una colonia en un medio de cultivo en tubo, verificando su pureza después de la incubación apropiada, mediante observación al microscopio. La morfología de las colonias es importante por lo anteriormente expuesto y debe familiarizarse el alumno con ella. La terminología mencionada a continuación sobre algunas de las características más constantes de una colonia bacteriana es muy útil:
FORMA: Puntiforme, circular, irregular, alargada, fusiforme, filamentosa, rizoide, etc.
TAMAÑO: Estimar el diámetro en mm.
SUPERFICIE: Lisa, rugosa, cerebriforme, en anillos concéntricos, etc.
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ELEVACIÓN: Aplanada, elevada, pulvinada, convexa, umbonada, umbilicada, etc.
BORDE: Continuo, ondulado, lobulado, erosionado, festoneado, filamentoso, etc.
COLOR: Según sea observado por la luz reflejada o por la luz transmitida, puede ser
de color blanco, amarillo, rojo ladrillo, anaranjado, etc.
OPACIDAD: Transparente, opaca, etc.
CONSISTENCIA: Dura, viscosa, membranosa, gelatinosa, mucosa, etc. Usar el ansa
bacteriológica para determinar la consistencia.
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NOMBRE:
COMISIÓN:
PARTE PRÁCTICA: MÉTODOS DE SIEMBRA Y CULTIVO SE MICROORGANISMOS Objetivos
Ejecutar las técnicas básicas para la manipulación de cultivos microbianos en forma
aséptica. Adquirir
conocimientos básicos, teóricos y prácticos, de la siembra y aislamiento de
bacterias. Adquisición
de criterio en la elección de los distintos medios de cultivo.
Actividades a desarrollar (I) Ejercitación de las diversas técnicas de siembra de los microorganismos.
Se utilizarán los siguientes medios de cultivo
Agar Nutritivo
Agar Chapman
Agar Levine EMB
1) Siembra de placas de Petri por agotamiento por estrías en diferentes medios de cultivo: se toma el material con el ansa estéril y se siembra por diseminación en estrías
por agotamiento con la finalidad de aislar microorganismos. Técnica a. Con el marcador dividir la placa de Petri en 3 sectores, de tal manera que al destaparla para proceder a la inoculación, se tenga como se indica en la figura:
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b. Destapar el tubo que contiene el cultivo y flamear su punta. No dejar que la tapa se contamine colocándola sobre el mesón. Con el ansa en anillo previamente esterilizada tomar una ansada de cultivo bacteriano. c. Flamear nuevamente la boca del tubo que contiene el cultivo, tapar y colocar en la gradilla.
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d. Con la mano izquierda levantar parcialmente la tapa de la placa de Petri y descargar el material en el sector 1, trazando una serie de zig-zags muy cerrados a todo lo ancho del sector. Cerrar la placa. e. Esterilizar el ansa flameándola y mientras que se enfría, girar la placa 90° hasta que el sector 1 quede a la izquierda y el 2 hacia arriba a la derecha. f. Trazar unos 5 zig-zags en el sector 2 invadiendo el sector 1 para llevar un poco de material al sector 2 y las siguientes estrías no deben tocar el sector 1. De esta forma se diluye el material quedando unas bacterias separadas de las otras. g. Esterilizar de nuevo el ansa, girar la caja 90° y ahora el sector 2 estará a la izquierda y el 3 a la derecha. h. Trazar unos 5 zig-zags en el sector 3 invadiendo el sector 2 y el resto sin tocar el sector 2, como se muestra en el dibujo:
i. Incubar a 37°C por 24-48 horas. j.
Observar si hubo o no, aislamiento de colonias. ( nota: En el sector 1 generalmente no se obtienen colonias aisladas, pero en 2 y 3 sí).
k. Anotar las características de las colonias aisladas. l.
Preparar un frotis, teñir con la técnica de Gram y observar al microscopio con objetivo de inmersión para confirmar su pureza.
2) Siembra en placa de Petri con espátula de Drigalsky : con pipeta estéril colocar 0,1 ml de cultivo en medio líquido sobre el medio sólido, diseminar inmediatamente con espátula. 3) Siembra en placa de Petri con hisopo estéril : se embebe el hisopo sumergiéndolo en un medio líquido y se disemina en estrías. 4) Siembra en placa por método de placa vertida : se coloca 1 ml de cultivo en medio líquido sobre una placa de Petri vacía estéril e inmediatamente se vierte agar fundido y templado a 45ºC, se agita la placa efectuando movimientos rotatorios en ambas direcciones para distribuir sus contenidos y se deja solidificar. 9
Introducción a la Microbiología
5) Siembra en agar inclinado : se toma el material con ansa recta o en anillo y se siembra en estrías. a. Agitar el cultivo líquido para resuspender los microorganismos en el medio. Evitar mojar la tapa del tubo con el cultivo. b. Esterilizar el ansa a la llama. c. Destapar el tubo que contiene el cultivo y flamear su punta. No dejar que la tapa se contamine colocándola sobre el mesón. d. Insertar el ansa estéril en el cultivo y tomar una ansada llena para transferirla al otro tubo que contiene el medio de cultivo sólido estéril. e. Flamear nuevamente la boca del tubo que contiene el cultivo líquido, tapar y colocar en la gradilla. f. Destapar el tubo que contiene agar nutritivo estéril y flamear su punta. No dejar que la tapa se contamine colocándola sobre el mesón. g. Para inocular el medio sólido estéril introducir el ansa que contiene el cultivo en el tubo de agar nutritivo estéril hasta el fondo del tubo donde comienza el bisel y diseminar el inóculo sobre la superficie del mismo moviendo de lado a lado y hacia arriba hasta llegar a la punta del bisel. h. Flamear nuevamente la punta del tubo y tapar. i.
Esterilizar nuevamente el ansa.
j.
Colocar los tubos en su gradilla e incubarlos a 37°C por 24 horas.
6) Siembra en agar en columna : por picadura con ansa en punta. 7) Siembra en agar pico de flauta : se toma el material con ansa recta o en anillo y se siembra por picadura y en estrías. (II) Observar y registrar las características de desarrollo en cada uno de los medios. (III) Observar y registrar las características morfológicas de las colonias de los distintos microorganismos.
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