Laboratorio Biología Molecular

Informe de laboratorio Biología Molecular N°3 1

Aislamiento y electroforesis del ADN de Fusarium sp. Integrantes 1. Programa de Ingeniería Biotecnológica, Biología Molecular, Universidad Francisco de Paula Santander.

Cúcuta, Norte de Santander, Colomia Fec!a

Resumen Como "aso "reliminar "ara el desarrollo de t#cnicas moleculares $ue "ermitan el conocimiento del genoma de !ongos %ito"atógenos, en la "resente "r&ctica de laoratorio se desarrollo el "rotocolo de e'tracción ( visuali)ación del *+N de %usarium s"., en%ati)ando en las reacciones $ue ocurren a lo largo de los "rocesos de e'tracción. e'tracción. Para lisar el micelio se utili)o ru"tura mec&nica mec&nica cominada cominada con el u%%er u%%er de e'tracci e'tracción ón -ris, -ris, +-*, +-*, S+S ( Na/S02, Na/S02, la "uri%ica "uri%icación ción del *+N se reali)o reali)o a3adien a3adiendo do %enol4cloro%ormó, iso"ro"anol ( etanol5 el an&lisis de la calidad ( cantidad de *+N se !i)o mediante electro%oresis electro%ores is en gel de agarosa a 6,78, -B 6,9: ( Brt. n este estudio se otuvo *+N de alto "eso molecular en la ma(oría de las muestras. ;a com"aración de los m#todos de e'tracción demostró las di%erencias entre las acterias, !ongos ( "lantas, estas di%erencias se ven re%le
!alabras cla"es *+N, Fusarium s"., e'tracción, electro%oresis. Abstract  *s a "reliminar( "reliminar( ste" %or t!e t!e develo"ment develo"ment o% o% molecular tec!ni$ues tec!ni$ues t!at t!at allo=s allo=s to !ave >no=ledge >no=ledge aout t!e geno genome me o% "at!o "at!oge genic nic %ungi? %ungi?s, s, in t!is t!is lao laorat rator( or( "ract "ractice ice a "rotoc "rotocol ol %or %or +N* e'trac e'tractio tion n and and visuali) visuali)atio ation n o% Fusarium Fusarium s". =as develo"ed develo"ed,, em"!asi) em"!asi)ing ing in t!e reactions reactions t!at occur along along t!e e'traction "rocesses. -o l(se t!e m(celium mec!anical disru"tion =as used =it! an e'traction u%%er  -ris, +-*, S+S and Na/S02, "uri%ication o% +N* =as "er%ormed ( adding "!enol4 c!loro%orm, iso"ro"anol iso"ro"anol and et!anol5 t!e anal(sis %or $ualit( and $uantit( o% t!e +N* =as made ( electro"!oresis on agarose gel at 6.78, 6.9 : -B and tBr. In t!is stud( t!e +N* t!at =as otained in most o% t!e sam"les !ad !ig! molecular =eig!t. -!e com"arison o% t!e e'traction met!ods demonstrated t!e di%%eren di%%erences ces among among acteria acteria,, %ungi %ungi and "lants, t!ese di%%ere di%%erence nces s can e seen in t!eir t!eir res"ecti res"ective ve "rotocols o% +N* e'traction and "uri%ication.

#ey $ords +N*, Fusarium s"., e'traction, electro"!oresis.

Informe de laboratorio Biología Molecular N°3 2

IN%R&D'((I)N

electro%oresis en gel de agarosa, deido a

@uella de *+N o +N* %inger"rinting es uno de

los

sistemas

m&s

grandes

de

identi%icación $ue e'isten, "ara reconocer  un organismo individual. -odo ser vivo es gen#ticamente di%erente, $uiere decir $ue cada individuo contiene una secuencia es"ecí%ica. * di%erencia de las !uellas digitales, la secuencia de *+N no se "uede camiar %&cilmente una ve) $ue el material se

de
en

la

escena

del

crimen,

aumentando así su uso e%ectivo en an&lisis %orenses, ( la "roailidad de encontrar  una coincidencia e'acta. ste m#todo de identi%icación

es

útil

a"licaciones,

tales

en

muc!as

la

medicina

como

%orense, "rueas de "aternidad, (

la

ar$ueología molecular, entre otros. n cual$uier caso, es evidente $ue las !uellas dactilares del *+N !an revolucionado la %orma

en

$ue

el

mundo

identi%ica

!acer

uso

de

esta

t#cnica

es

necesario reali)ar una digestión en)im&tica, utili)ando endonucleasas de restricción $ue cortan en %ragmentos el genoma en "ares de ases es"ecí%icas. ;os %ragmentos generados "or los cortes en el *+N se clasi%ican

según

su

!acia un electrodo cargado "ositivamente, los %ragmentos "e$ue3os se "ueden mover  con mas %acilidad $ue los mas grandes. ;as andas generadas en la electro%oresis se com"aran "ara determinar similitudes entre los individuos. l o
o

si

son

todas

di%erentes,

mediante el uso de en)imas de restricción ( electro%oresis.

MA%*RIA+*, - M*%&D&, ;a "r&ctica se llevó a cao en el laoratorio de Biología Molecular de la Universidad Francisco de Paula Santander sede ;os Patios, "ara determinar similitudes entre las muestras del Ait.

Digestin en/im0tica del ADN Se rotularon los microtuos de la siguiente

coincidencias iológicas. Para

su carga negativa el *+N se des"la)a

tama3o

mediante

%orma4 erde4 C  escena del crimen  *)ul4 S1  sos"ec!oso 1 Naran
Informe de laboratorio Biología Molecular N°3 3

Se agregaron 9 ; de muestra de *+N del

Para la "re"aración de la muestra, se

Ait a los microtuos corres"ondientes.

agregaron /l de u%%er de carga ( 16 l de

Posteriormente se cargaron 9 ; de me)cla

+N*. ;as muestras %ueron cargadas en su

en)im&tica

res"ectivo %oso al igual $ue el marcador de

NG2

$ue

contiene

dos

en)imas de restricción la coDI ( PstI en la

"eso molecular ;amda +N*J Hind

figura 1 se oservan las dianas de

Markers 2.

restricción4

a 1/6v durante 6 minutos. *l terminar la

III 

;a corrida electro%or#tica se llevó

corrida, se llevó el gel a un transiluminador  de ra(os U "ara visuali)ar los resultados.

R*,'+%AD&, - DI,(',I&N*, Fig. 1 Dianas de restricción EcoRI y PstI

Se gol"eo con el dedo los tuos ( se !i)o un $uic> en la microcentri%ugadora "ara $ue la me)cla $uedara en el %ondo del tuo.

*lectroforesis y "isuali/acin F&RMA%& (&N%R&+ D* *+*(%R&F&R*,I,

*lectroforesis No. /

Feca KulioJ6J/61/

corc!o ( se llevo a incuar E9 minutos a

4 de Agarosa 18

Buffer 6.9' -B

7HC en a3o.

5olta6e 1/6v

Br*t / l

Se colocaron los tuos en la gradilla de

%iempo corrida 6 min

*lectroforesis y "isuali/acin Para la "re"aración del gel, se agregó en un erlenme(er E6ml de -B 6.9: ( agarosa al 18 6,E g2, llev&ndolo a "lanc!a de calentamiento !asta la disolución com"leta de la agarosa5 cuando la tem"eratura disminu(o a a"ro'imadamente a 9 6C se agregó / l de Brt, la me)cla se vertió en la cueta ( "osteriormente se colocó el "eine "ara la %ormación de los %osos. Una ve) el gel geli%ico se lleva a la c&mara curi#ndolo totalmente con -B 6.9: Fig. 2

Muestra *+N digerido del Ait %orense en el laoratorio de Biología Molecular, sede ;os Patios.

(arril 1 2 3 7 8 9 :

Muestra Marcador  scena del crimen Sos"ec!oso 1 Sos"ec!oso / Sos"ec!oso  Sos"ec!oso E Sos"ec!oso 9

F&%&;RAF pag. 8?

Informe de laboratorio Biología Molecular N°3 4

C A B

D F E Fig. 3 Electroforesis: A Calenta!iento de agarosa"#$% & 'BE "#()# B adición de 2*l de BrEt# C +erti!iento del gel en la c,-eta# D etracción de to/es y /eine# E corrida electrofor0tica a 11$ d,rante 4" !in.

Fig. 2

LE1

(

re%erencia

 EC 1 2 3 4 (

/6/7 el

"

teniendo

marcador

como

molecular 

;amda +N*J@ind III Mar>ers.  *l com"arar las muestras en el gel se oserva $ue el *+N "rocedente de la escena del crimen C2 ( el del 

sos"ec!oso  son id#nticos. +e todos los carriles del gel se "udo concluir $ue las andas no estaan se"aradas com"letamente di%icultando el an&lisis.

(omentarios n

;a maceración con "istilos o "ulveri)ación

todos los

carriles del

gel

se

oservaron andas ien de%inidas. l tama3o de anda "romedio %ue oservado

a"ro'imadamente

entre

motori)ada de micelio "roduce lisados celulares ( muc!as veces %unciona m&s r&"ido $ue usando en)imas $ue degradan

Informe de laboratorio Biología Molecular N°3 (

la "ared celular o altas tem"eraturas

sustanciales de *+N  E666"2 a "artir 

;ugert et al., /662 en ese conte'to el

del micelio de Fusarium s". este resultado

lisado del micelio $ue se reali)ado %ue

se aseme
consistente ( "ermitió acceder al interior 

/6112 "ara el aislamiento de *+N a "artir 

celular.

de !ongos %ilamentosos donde otuvo una concentración de 6.9 a 1. mgJg micelio.

;as nucleasas %úngicas, "olisac&ridos, ( "igmentos

di%icultan

el

"roceso

de

Según

alde)

(

Aa!l

/6662

la

aislamiento de *+N %úngico "uro "or lo $ue

determinación de la calidad del *+N se

se otiene *+N de alto "eso molecular "or 

suele !acer con ase en el grado de

contaminación

degradación, (a $ue un *+N de alto "eso

con

estos

com"uestos

Blanc!ard ( No=otn(, 1LLE2. ;os "igmento

molecular

a"arece

como

una

anda

se asocian con las manc!as marrones en

de%inida en la "arte su"erior del gel a "oca

el "ellet $ue "uede atriuirse a im"ure)as (

distancia de los "osos mientras $ue el

residuos del "rotocolo de e'tracción, $ue

material "arcialmente degradado %orma un

se ven re%le
arrido de %ragmentos "e$ue3os a lo largo

otienen andas con a
del carril. +e acuerdo con esta in%ormación

"eso molecular.

( al anali)ar el gel se oserva $ue las andas con el *+N de me
;a eliminación de los "olisac&ridos ( otros

las de los carriles 1 ( / corres"ondientes a

!idratos de carono contaminantes se asa

las muestras de los gru"os 1*I ( 1*II. *

en la di%erencia de soluilidad del *+N en

e'ce"ción de las muestras del carril , L (

com"aración con la de los "olisac&ridos de

16

alto "eso molecular en medios acuosos

muestras "resentaron una anda en la

Do)man ( Aomel, 1LLE2. n el "rotocolo

"arte su"erior del gel cerca a los "o)os.

todos

los

carriles

$ue

contenían

de e'tracción se usaron sales Na /S02 $ue "ermitieron la soluili)ar los "olisac&ridos

n las muestras del carril ,L ( 16 no se

"resentes en el micelio.

distinguió ninguna anda de%inida, (a $ue no se consiguió una cantidad su%iciente de

n el "roceso de e'tracción de *+N se

 *+N $ue "udiera ser visile en el gel esto

logro

concuerda con lo re"ortado "or Carran)a

la

lieración

de

cantidades

Informe de laboratorio Biología Molecular N°3 

/662

en

la

e'tracción

de *+N

de

;actarius.

"ara eliminar los iones met&licos ( así evitar la acción de +Nasas Dogers ( Bendic!, 1LLO2, detergentes, como sodio

(omparacin

de

protocolos

de

dodecilo sul%ato S+S2, !e'adecil trimetil

e@traccin de ADN fngico> "egetal y

romuro de amonio C-*B2 ( Polivinil

genmico bacteriano

"irrolidona

n la tabla 1 se detallan las di%erencias

disolver

entre los "rotocolos de e'tracción en

se"arar "olisac&ridos ( "roteínas de la

!ongos, vegetales ( acterias5 los tres

memrana celular, rom"iendo las uniones

aislamientos tienen en común  eta"as

$ue mantienen la integridad de la misma

%undamentales "ara otención de *+N de

Aim et al.,1LL75 ;od!i et al., 1LLE (

alta "ure)a.

M(gind et al., /662. Según Doc!a /66/2,

PP2 lí"idos,

son

utili)ados

remover

"ara

"oli%enoles,

el Qmerca"toetanol reduce los gru"os

+isis de la pared celular y membrana

sul%uro en "roteínas de la "ared celular 

plasm0tica

inactiv&ndolas de esta manera.

Para la e'tracción de *+N a "artir de "lantas, !ongos ( acterias, se re$uiere

l

$ue el contenido celular sea lierado en

"rotocolos de !ongos ( "lantas, son sales

una solución. +ado $ue las acterias son

$ue %uncionan soluili)ando el *+N en la

c#lulas

solución5 una característica im"ortante de

individuales

(

no

contienen

Na2 SO3

( el

estas

%&cil de e'traer. n contraste, las muestras

contaminantes como "olisac&ridos ( otros

"rocedentes de !ongos ( "lantas a menudo

metaolitos secundarios elasco, /6692.

ser

%ragmentos

molidas antes

en

es

la

"resentes en los

estructuras rígidas el *+N es relativamente

deen

sales

NaCl

eliminación

de

"e$ue3os

de continuar

Aar",

Digestin yo precipitacin de proteínas =purificacin?

/6162.

;os tres ti"os de *+N utili)an incuación a l u%%er de e'tracción "ara los tres ti"os de

di%erentes tem"eraturas con el o
 *+N esta com"uesto de4

desnaturali)ar las "roteínas. Para se"arar 

Tris cu(a

%unción

es mantener el "@ alcalino, el

EDTA

etileno diamina tetra acetato2, se utili)an,

los com"uestos org&nicos de los &cidos nucleicos se utili)an solventes org&nicos

Informe de laboratorio Biología Molecular N°3 $

como el %enol4cloro%ormo 1412 logrando la

"ermita com"arar las andas otenidas en

cominación

amos

el gel. n la corrida electro%or#tica se

actúa

oservo $ue el marcador utili)ado no

desnaturali)ando las "roteínas mientras

"ermitía reali)ar un an&lisis mas detallado

$ue el cloro%ormo "or su "arte "uede

de la cantidad de *+N otenido, se

remover lí"idos, soluili)ar al %enol (

recomienda el uso de un marcador de

eliminarlo de la solución Madri) ( Pera)a,

ma(or "eso molecular.

de

com"uestos,

la acción el

%enol

de

/6692.

*@traccin y precipitacin de ADN

l uso del S+S como detergente en el

=concentracin?

u%%er

n esta eta"a se adiciona iso"ro"anol (

"roductos de *+N de alto "eso molecular,

etanol con el %in eliminar im"ure)as, como

esto tomando en cuenta $ue "ara este

restos de com"uestos %enólicos ( "reci"itar 

"rotocolo

el *+N M(gind et al., /662. Doc!a /66/2

"re"arados en)im&ticos. l determinar $ue

adiciona en la e'tracción de *+N vegetal

"ara las e'tracciones de *+N de Fusarium

acetato de sodio "ara a(udar en la

s". no es necesario !acer uso de estos dos

"reci"itación del *+N.

reactivos, se traduce en a!orro de tiem"o (

de

e'tracción

no

se

"ermite

utili)ó

otener 

*DNasas

ni

dinero.

(&N(+',I)N ;a "resente "ractica logró su o
Mediante este "rotocolo se "udo otener 

"rinci"al el cual era reali)ar la e'tracción de

 *+N de uena calidad com"ro&ndose así

 *+N ( visuali)ación en gel de agarosa de

su e%ectividad, "uesto $ue no "resenta

un cultivo de Fusarium s"., (a $ue se logró

degradación

demostrar la "resencia de *+N en la

encontradas, esto deido a su ca"acidad

ma(oría de las muestras, estos resultados

"ara in!iir la acción de las +N*sas.

"arcial

de

las

andas

"ueden ser em"leados "ara desarrollo de t#cnicas moleculares en investigaciones.

Para la elección del "rotocolo adecuado de e'tracción se deen tener en cuenta las

Para

"oder

conocer

el

tama3o

(

estructuras "resentes en el o
concentración del *+N se re$uiere el uso

estudio, "uesto $ue la com"osición de

de un marcador de "eso molecular $ue

dic!as estructuras "uede variar de un

Informe de laboratorio Biología Molecular N°3 5

organismo a otro, siendo esto un %actor 

#arp ;erald> 21. Cell and molecular iolog(,

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conce"ts and e'"eriments. t! d. Ko!n Vile( W Sons, Inc.

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+N* e'traction %rom gra"evine

cultivars and itis s"ecies. Plant Molecular 

Día/>

urisadai>

identi%icación

de

29. es"ecies

Selección de

e

Biolog(De"orter 1/4 Q1

!ongos

ectomicorri)ógenos del estado de @idalgo mas

+ugert R> ,cettler ( and ;ross ' =29?.

com"etentes en medio de cultivo sólido. -esis,

Com"arison o% di%%erent "rotocols %or +N*

Universidad *utonoma del estado de @idalgo,

"re"aration and PCD %or t!e detection o% %ungal

Instituto de Ciencias *gro"ecuarias.

"at!ogens in vitro. M(coses EL4 /LOQ6E.

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Madri/> #G !era/a> C. 28. Manual de

marc!ite) causada "or Fusarium o'is"orum

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Informe de laboratorio Biología Molecular N°3 6

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41L

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+is"onile en4

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Informe de laboratorio Biología Molecular N°1 1"

('*,%I&NARI& %ipos de electroforesis ue e@isten y sus aplicaciones 1? Inmunoelectrofresis s una cominación de una electro%oresis en geles de agarosa seguida de una inmunodi%usión. n la "rimera "arte, se reali)a una a"licación "untual de la muestra, "or lo $ue al %inal las distintas "roteínas estar&n distriuidas a lo largo del gel según el e
Figura 1 "rocedimiento general de la inmunoelectro%oresis ;a gran es"eci%icidad ( sensiilidad de las reacciones de "reci"itación, "ermite di%erenciar  sustancias con movilidades electro%or#ticas id#nticas ( detectar com"onentes $ue se encuentren en concentraciones mínimas [g2, identi%icar sustancias en me)clas mu( com"le
Informe de laboratorio Biología Molecular N°1 11

2? *lectrofresis en gel de poliacrilamida =!A;*? ;a "oliacrilamida es un so"orte em"leado %recuentemente en electro%oresis en gel, es $uímicamente inerte, de "ro"iedades uni%ormes, ca"a) de ser "re"arado de %orma r&"ida ( re"roducile. Forma, adem&s, geles trans"arentes con estailidad mec&nica, insolules en agua, relativamente no iónicos ( $ue "ermiten uena visuali)ación de las andas durante tiem"o "rolongado. *dem&s tiene la venta
Figura 2 s$uema de "re"aración del gel "ara una electro%oresis en "laca

Formatos de la !A;* 'isten  %ormas di%erentes de reali)ar electro%oresis en geles de "oliacrilamida4 l&mina vertical, varilla cilíndrica ( l&mina !ori)ontal.

!A;* no desnaturali/ante. Se desarrolla en condiciones en las $ue no se altera la con%ormación nativa de las "roteínas se"aradas, "or lo $ue %inali)ada la electro%oresis, "ueden reali)arse estudios de %uncionalidad de dic!as "roteínas se"aradas actividad en)im&tica, ca"acidad de unión de anticuer"os,

Informe de laboratorio Biología Molecular N°1 12

unión a rece"tores, etc.2. l tam"ón "resente en los reservorios es di%erente al $ue im"regna el gel, el cual tam"oco es !omog#neo, (a $ue, en realidad, !a( dos geles di%erentes en uno solo4 una )ona de resolución donde tiene lugar la se"aración de las "roteínas2 $ue se "olimeri)a sin colocar el "eine ( otra "e$ue3a )ona de concentración de 1Q cm, $ue se "olimeri)a sore la anterior, $ue contiene los "ocillos de a"licación de la muestra ( cu(a %inalidad es concentrar la muestra en la )ona de contacto con la )ona de resolución

Figura 3 P* en condiciones no desnaturali)antes en sistemas de tam"ón discontinuo .

!A;* desnaturali/ante n "resencia de algunos com"uestos $uímicos, las "roteínas "ierden su estructura nativa5 tales com"uestos, llamados agentes desnaturali)antes, "roducen el des"legamiento de la "roteína $ue $ueda, así, sin la organi)ación tridimensional característica de su %uncionalidad iológica . n la electro%oresis desnaturali)ante S+SQP*2, como su "ro"io nomre indica, se utili)an agentes desnaturali)antes de "roteínas, como "ueden ser4 detergentes ".e. S+S2, caótro"os ".e. urea2 ( agentes reductores /Q merca"toetanol, +--2. Para la visuali)ación de las "roteínas se utili)an di%erentes m#todos de tinción, siendo el m&s !aitual el a)ul de coomassie, la se"aración es %unción del tama3o masa molecular2, lo $ue "ermite determinar  el "eso molecular de las "roteínas. Para ello se com"ara la movilidad electro%or#tica de la "roteína de "eso molecular desconocido con el de "roteínas de re%erencia de "eso molecular  conocido.

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Figura 7 Com"aración entre los m#todos no desnaturali)ante ( desnaturali)ante. ;as "roteinas se"aradas mediante el rom"imiento de los "uentes disul%uro, migran "or la di%erencia de masas moleculares.

3? *lectrofresis en geles de gradientes n un gel en gradiente la "roteína migra !asta alcan)ar una )ona donde el tama3o de "oro im"ida cual$uier avance. Una ve) se alcan)a el límite del "oro no se "roduce una migración a"reciale aun$ue no se detiene com"letamente.

Figura 8 Com"aración entre el m#todo sin gradiente de concentración ( con gradiente de concentración.

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Una de las venta
*lectrofresis capilar  ;a electro%oresis ca"ilar se asa en los mismos "rinci"ios de las t#cnicas electro%oreticas convencionales, "ero utili)a condiciones ( tecnología distinta $ue "ermiten otener una serie de venta
a

b

Figura 9 Com"onentes de la electro%oresis ca"ilar. a Instrumentación general. b Ca"ilares

*nfoue isoelOctrico s un ti"o "articular de electro%oresis en la $ue los com"uestos an%óteros se se"aran según su "unto isoel#ctrico "I5 "@ al cual la carga neta de la "roteína es nula2 en un gradiente continuo de "@.

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;a carga neta de una "roteína est& en %unción del "@4 "@"I Carga nula negativa "@"I Carga neta nula "@]"I Carga nula "ositiva

n este m#todo el e%ecto de la di%usión es mínimo ( "or ello "osee una enorme resolución, "udiendo llegar a se"arar "roteínas $ue di%ieran en 6.661 unidades de "I. Se em"lean com"uestos an%óteros de a+a2 con aundantes gru"os &cidos ( &sicos, con un "I $ue aarca desde /.9 !asta 11.6, con gran ca"acidad de tam"onación cerca de su "I ( con una gran soluilidad ( conductividad. Puede llevarse a cao en condiciones $ue mantengan la estructura nativa de las "roteínas o en condiciones desnaturali)antes, incor"orando, adem&s de los an%olitos, urea OM2 o detergentes ni iónicos o an%óteros "ero nunca detergentes iónicos como el S+S2.

*lectrofresis bidimensional s una sucesión de dos electro%oresis distintas o en distintas condiciones2 reali)adas sore una misma muestra. n la "rimera de ellas "rimera dimensión2 se se"aran los com"onentes de la muestra según un criterio carga, tama3o o "I2, ( en la segunda segunda dimensión2 según un "ar&metro distinto del anterior.

+e esta manera, se cominan dos modos de

se"aración di%erentes ( se consigue el m&'imo de resolución "osile mediante t#cnicas electro%or#ticas.

Figura : lectro%oresis idimensional. Primera dimensión S+SQP*2. n el "ocillo I se a"lica el marcador de "esos moleculares ( en los "ocillos II ( III la muestra. l carril del "ocillo III somreado2 se corta ( el resto del gel se ti3e. l carril III se coloca sore un nuevo gel $ue se !a "olimeri)ado sin "ocillos, donde se desarrolla la segunda dimensión F2 "er"endicularmente a la "rimera.

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;a

"rimera dimensión

"uede

llevarse

a

cao,

"or

e
en

condiciones

no

desnaturali)antes ( la segunda en condiciones desnaturali)antes5 las "roteínas riosomales se se"aran en un gel discontinuo en la "rimera dimensión, seguido "or otro continuo en la segunda, ( amos en "resencia de urea. ;a electro%oresis idimensional "uede considerarse como un criterio de "ure)a "ositivo deido a su gran "oder de resolución, ace"t&ndose $ue la a"arición de una sola manc!a indica una muestra !omog#nea.