PRACTICA DE LABORATORIO EXTRACCIÓN DE ADN BACTERIANO Joan David Ayala Agudelo*, MVZ Est, Daniel Castrillon Pulgarin, Pul garin, MVZ Est. Universidad de Córdoba, Departamento de Ciencias Pecuarias, Facultad Medicina Veterinaria y Zootecnia. Berastegui, Colombia, Curso Biologia Molecular.
*Correspondencia:
[email protected] OBJETIVO GENERAL: Obtener ADN genómico bacteriano de óptima calidad y cantidad para ser utilizado en técnicas de biología molecular.
OBJETIVOS ESPECIFICOS:
Adquirir habilidades y destrezas del manejo de los materiales utilizados para la implementación de la técnica IN HOUSE para la extracción de ADN bacteriano. Conocer las funciones específicas de cada uno de los reactivos utilizados para esta técnica de extracción de ADN. Conocer los pasos primordiales para la extracción de ADN como son: Lisis celular, desnaturalización de proteínas y precipitación de ADN.
INTRODUCCION Todo estudio de biología molecular implica la disponibilidad de muestras de ácidos nucleícos o proteínas. En la mayoría de los casos es el ADN. Las cantidades necesarias de ADN para realizar estos estudios son lo suficientemente pequeñas, tanto como cantidades en nanogramos. Las técnicas de biología molecular para la extracción de ADN bacteriano son relativamente sencillas. El ADN es estable y casi indestructible dentro de la célula bacteriana, mostrando fragilidad tan solo fuera de la célula a enzimas de restricción una vez que la célula es lisada. La purificación de ADN consta de los siguientes pasos: Lisis de la pared bacteriana Desnaturalización de proteínas Precipitación y rehidratación del ADN
La lisis de la pared bacteriana se realiza por adición de proteínas enzimáticas que hidrolizan los mucopolisacaridos y el peptidoglicano, también, la lisis se puede ejecutar por el empleo de detergentes como el dodecil sulfato de sodio (SDS), deoxicolato de sodio o por el uso de altas temperaturas (ebullición). El uso de sales permiten quelar proteínas y precipitarlas, o el uso de solventes orgánicos como el alcohol isoamilico para separar las proteínas del ADN. Las proteínas pierden su solubilidad y precipitan, permitiendo separar el sobrenadante que contiene el ADN del precipitado que contiene las proteínas desnaturalizadas. Finalmente el ADN es precipitado y purificado por el uso de etanol e isopropanol, lo que permite que esté sea rehidratado por la adición de agua ultrapura o bien por el uso de una solución buffer TE (Tris 10mM, EDTA 10 mM pH 8,0). El ADN purificado es conveniente para una variedad de aplicaciones, incluyendo PCR, digestión con enzimas de restricción e hibridación.
MATERIALES Y METODOS Aislamiento de ADN genómico de bacterias gram-negativas (Salmonella) Reactivo
Cantidad microlitros
Buffer TEG Buffer Lissis Acetato de potacio Isopropanol
en Cantidad en mililitros
200 ul 400 ul 300 ul 480 ul
0.20000 ml 0.40000 ml 0.30000 ml 0.48000 ml
1. Centrifugamos el cultivo por 10 minutos a una gravedad de 5.100 xG, a 4°C
Se llevo el eppendorf que contenia las bacterias suspendidas en el buffer TEG, a la centrifuga y se le aumenta 5.100 veces la Gravedad, Sabiendo que la gravedad de la tierra es de 9.8 m/s2 por un tiempo de 10 minutos y dejamos enfriar a temperatura ambiente. Logrando con esto que las bacterias se fijen a la pared basal del eppendorf y en el sobrenadante (parte liquida) quedan las sobras bacterianas que son desechadas al terminar de centrifugar.
2. Adición del buffer TEG (TRI EDTA GLUCOSA).
Utilizando la pipeta exclusiva de clonación le agregamos 200 ul del buffer TEG el cual tiene un pH de 7.5, se resuspende nuevamente teniendo en cuenta que se debe hacer con mayor fuerza debido a que las bacterias se encuentran fijadas por la anterior centrifugación, posteriormente dejamos reposar a temperatura ambiente por 5 minutos.
3. Adición del buffer lisis.
Luego se le adicionó al eppendorf 400 ul de buffer lisis, el cual contiene hidrixido de sodio, SDS y pH 8, despues se incubo a 4°C en una caja que contiene hielo por un tiempo de 5 minutos. Es importante la observación de la reacción que se presenta, la cual describiremos posteriormente en el analisis de resultados.
4. Adición de acetato de potasio(KCH3CO2) 3molar.
Le agregamos al eppendorf 300 ul de acetato de potasio el cual tiene concentración 3 Molar
Luego se incubo por 5 minutos a 4°C, posteriormente, se sometio a la centrifuga por 10 minutos, infringiendole 15.355 xG a 25°C
5. Adición de isopropanol ((CH3)2CHOH) 96%
Le agregamos 480 ul de isopropanol Cubrimos el eppendorf y posteriormente lo re-suspendemos, lo cual nos permite observar una especie de un hilo transparente Luego se incuba por 10 minutos a 4°C Se lleva a la centrifuga por 10 minutos donde se le infringe 15.355 Gravedad a 4°C Descartamos el sobrenadante, donde se evapora el alcohol Le adicionamos 75 ul de buffer TE con un Ph de 8.8 Observamos el ADN.
ANALISIS DE RESULTADOS Utilizamos Bacterias Salmonella Clasificación Cientifica Dominio Filo Clase Orden Familia Genero
Bacteria Proteobaceria Proteobacteria gamma Enterobacteriales Enterobacteriaceae Salmonella
1) En el primer prosedimiento se adecuo la bacteria para poder trabajar con ella en el anteriormente.
laboratorio,
mediante
los
pasos
mensionados
2) En este procedimiento se observo que cuando se la agrega la Bacteria al eppendorf, y despues de sacarla de la centrifuga, aparese en el fondo un precipitado (bacterias). Esto sucede, ya que las Bacterias se encuentran dispersas en un medio acuoso (TEG), y al momento de infringirle una gravedad fuera de lo normal (5100G), hace que las Bacterias dispersas se aglomeren en un solo sitio, ayudandonos así a recoger las bacterias y tenerlas en un sitio especifico, para la utilizacion de la sustancia de interes (bacterias), y luego desechar el sobrenadante (resto del cultivo).
3) En este procedimiento se le agrega el buffer TEG debido a que cumple diversas funciones con cada uno de sus componentes nesasarias para continuar con el procedimiento de extracción del ADN bacteriano como son: funciones de glucosa para mantener la presión osmótica, mientras que el Tris amortigua las células a pH 8. O. El EDTA se une a los cationes divalentes en la bi-capa lipídica, debilitando así la envoltura celular, preparándola así posteriormente para la lisis y se deja en reposo para asegurarse que el TEG sea asimilado en su totalidad por las bacterias.
4) En este procedimiento se observo que cambia de color transparente, a un color lila, al igual que cambio su consistensia, tornandose un poco viscosa. Esto sucede, ya que adicionado el buffer TEG, el cual debilito la envoltura celular, y posteriormente agregarle el Buffer Lisis, éste
rompe la envoltura celular débil al igual que la nuclear, lo que ocaciona que todo el contenido intracelular salga al medio exterior donde está disuelto, en este caso acuoso. Por esta razón, cambio su consistencia liquida a viscosa, ademas como se trata de una bacteria gram -, por lo que tiene una capa lipidica delgada, no se tiñe de color azul oscuro o violeta, por lo que tiñe de rosado y como se habia sometido previamente a diversos pasos, fue perdiendo su coloracion inicial, por lo cual se torna un poco de color lila. Ademas se incuba a 5°C, porque a esta temperatura este tipo de bacteria tiene las condiciones optimas para un mayor crecimiento, ademas en el medio de cultivo, contaba con aire, ya que estas bacterias son extrictamente aeorabias, es decir se reproducen solamente en presencia de aire.
5). En este procedimiento despues de agregarles isopropanol observamos ADN un color purpura mas oscuro y al fondo las proteinas, esto se da porque La precipitación de los ácidos nucleicos permite su purificación y concentración. Se basa en la simultánea neutralización de las cargas negativas (mediante el añadido de sales), y deshidratación de la molécula (mediada por el agregado de alcoholes, típicamente etanol o isopropanol), lo cual lleva a su precipitación. Luego se lleva a la centrifuga, infringiéndole gravedad (15355G), con el fin de que el ADN, se adhiera al tubo, para que no se pierda al momento de desechar el medio acuoso y evaporar el alcohol.
6) Adición del buffer TE En este procedimiento, luego de que el alcohol se evaporara, el ADN quedo adherido al tubo que los contenía, el ADN queda adherido al tubo por la gravedad que se le infringe previamente, luego se le agrega buffer TE (tris-Edta), que su función es de conservar al ADN y evitar su degradación.
INFORME DE LABORATORIO (POR GRUPO DE TRABAJO) PREGUNTAS COMPLEMENTARIAS. 1. ¿Qué son las endonucleasas? Las endonucleasas o enzimas de restricción son enzimas de restricción tienen como función principal ser catalizadores de proteína, utilizadas por las bacterias para destruir los virus invasores. Las enzimas de restricción cortan el ADN en sitios muy específicos, en las secciones del ADN que consisten en cadenas de cortas bases de ADN, estas son conocidas como secuencias de reconocimiento.
2. ¿Cómo previene usted la contaminación con endonucleasas en la extracción de ADN? Las altas concentraciones de (5M) de NaCL se pueden usan para prevenir la contaminación de la muestra con polisacáridos que afectan la pureza del ADN pudiendo inhibir la acción de enzimas como polimerasas, ligasas, y endonucleasas. Tambien una forma fácil para evitar la contaminación de endonucleasas, es que al utilizar una micropipeta siempre utilizar una punta diferente para cada procedimiento es decir utilizara una específica para las enzimas de restricción
3. ¿Qué función cumple la lisozima, el fenol cloroformo, el SDS, el isopropanol, en la extracción de ADN? La lisozima cumple la función de suavizar las membranas de las células reduciendo notablemente su integridad, combinación de fenol y cloroformo a menudo se utilizan como disolventes para eliminar los contaminantes de los ácidos nucleicos con objeto de eliminar las proteínas. El SDS (sodio dedecil sulfato) , solubiliza proteínas, tejidos y membranas evitando que una cantidad significativa de ADN quede atrapada en los desechos o restos celulares. Para concentrar los ácidos nucleicos suele realizarse una precipitación con isopropanol.
4. ¿Un ADN de buena calidad cómo se observa en un gel de agarosa? Se observa la separación de fragmentos de ADN
DISCUSION Con la realización de este laboratorio de Biología Molecular obtuvimos importantes conocimientos, habilidades y destrezas para la extracción de ADN, En este caso de la Bacteria Salmonella, Mediante el procedimiento IN HOUSE utilizado pudimos seguir de manera secuencial todos los cambios que va teniendo la bacteria, logrando romper las membranas que protegen la informacion genetica, fijarlas y concervarlas para su posterior estudio. Aunque existen muchos procedimientos para la extracción del ADN, logramos tener una idea clara acerca de cómo se puede obtener la información genetica y asi entender, como es posible que aunque podamos llegar a paracernos mucho a un familiar siempre hay algo que nos diferencia y esa información que hace posible tal diferencia se encuentra precisamente en el ADN. Para nosotros como futuros Medicos Veterinarios Zootecnistas es muy importante profundizar en cualquir fenomeno biologico y explicar la naturaleza intima de los procesos que determinan una propiedad o una funcion de los seres vivos como es el caso de las caracteristicas fisicas, geneticas entre otras que posee cada animal y que los hace unicos.
