Separacion de Pigmentos Vegetales Mediante Cromatografia en Papel

UNIVERSIDAD TÉCNICA DE AMBATO FACULTAD DE CIENCIA E INGENIERÍA EN ALIMENTOS  AL IMENTOS  CARRERA DE INGENIERÍA BIOQUÍMICA LABORATORIO DE BIOPROCESOS  Profesor:   Ayudante: Semestre:

Dr. Ramiro Velastegui Ph. D. Egdo. Lenin Sarabia Séptimo

Tema:

³SEPARACIÓN DE PIGMENTOS VEGETALES MEDIANTE CROMATOGRAFÍA EN  PAPEL´ 

Práctica:

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1. INTRODUCCIÓN  Cuando se observa una hoja, el pigmento clorofila es usualmente el único pigmento que parece estar   presente. De hecho, la clorofila es solamente uno de varios tipos de pigmentos presentes en las hojas y uno de tantos pigmentos que están involucrados en el proceso de fotosíntesis. Una vez removidos de la hoja, los pigmentos fotosintéticos pueden ser separados uno de otro e identificados mediante cromatografía. La cromatografía es un método usado principalmente para la separación de los componentes de una muestra en la cual los componentes son distribuidos entre dos fases una de las cuales es estacionario, mientras que la otra es móvil. La fase estacionaria puede ser sólido o líquido soportado en un sólido o en un gel (matriz). La fase estacionaria puede ser empaquetada en una columna extendida en una capa, distribuida como una película. La cromatografía en papel tiene como soporte un papel de celulosa y es un proceso muy utilizado en los laboratorios para realizar análisis cualitativos ya que pese a no ser una técnica muy potente no requiere de ningún tipo de equipamiento. La fase estacionaria está constituida por una tira de papel de filtro. La muestra se deposita en un extremo colocando pequeñas gotas de la solución y evaporando el solvente. Luego el disolvente utilizado como fase móvil se hace ascender por capilaridad. Esto es, se coloca la tira de papel  verticalmente y con la muestra del lado de abajo dentro de un recipiente que contiene fase móvil en el  fondo. Después de unos minutos cuando el solvente deja de ascender o ha llegado al extremo se retira el   papel y seca. Si el solvente elegido fue adecuado y las sustancias tienen color propio se verán las manchas de distinto color separadas. Cuando los componentes no tienen color propio el papel se somete a procesos de revelado. Hay varios factores de los cuales depende una cromatografía eficaz la elección del solvente y la del papel filtro. 2. OBJETIVOS  2.1. Separar pigmentos de muestras vegetales veget ales mediante cromatografía en papel. 2.2. Identificar pigmentos presentes en hojas de vegetales. 3. MATERIALES  Jarra cromatográfica Mortero y pistilo Espinaca y y y

y y y y y

Papel filtro Solvente para cromatografía (90% Isopropyl Alcohol) Regla Tubos capilares Calculadora

4. PROCEDIMIENTO Preparación de la solución: 1. Coloque hojas de espinaca en el mortero y añada aproximadamente 5 ml de alcohol isopropilico al  90%. 2. Macere fuertemente la mezcla de espinaca/alcohol para desarrollar un líquido concentrado. Preparación del cromatograma: 1. Cortar la base del papel filtro de manera que forme la punta de un triángulo. 2. Dibujar una línea a través del papel 1 cm arriba de la punta del triangulo. Esta es la línea de inicio. 3. Usando un tubo capilar transferir una gota de la solución de pigmento verde al centro de la línea de inicio. 4. Vierta aproximadamente 1 cm de solvente para cromatografía en la jarra cromatográfica. 5. Coloque los papeles en las jarras cromatográficas de manera que las puntas del triángulo toque el solvente. No sumerja la línea de pigmento abajo del nivel del solvente. 6. Permitir que el solvente ascienda por alrededor de 15 minutos o hasta que la línea de solvente se acerque al final del papel. 7. Cuando la línea de solvente está cerca de 1 cm del fin del papel. Remueva el papel del  solvente y marque el punto mas lejano de avance del solvente antes que éste se evapore. 8. Permita que el papel filtro se seque, y observe el cromatograma. Algunos de los posibles colores y pigmentos que estos representan son: o  Amarillo claro - carotenos o  Amarillo - xantofilas o Verde brillante ± clorofila a o  Amarillo-verde ± clorofila b o Rojo - antocianinas 9. Mida la distancia desde el punto de inicio hasta el final de desplazamiento del pigmento de cada uno de ellos. Apunte estás mediciones en la siguiente tabla y calcule los valores Rf para cada uno de los pigmentos, de acuerdo a la siguiente fórmula: Rf = distancia recorrida por el pigmento desde la línea de inicio Distancia recorrida por el solvente

Pigmentos de Hoja de Espinaca Línea

Color

Pigmento probable

Distancia recorrida desde el inicio

Valor Rf 

1 2  3 4 5 (solvente) 5. RESULTADOS  1. Presente los cromatogramas desarrollados en práctica. 2. ¿Cuántos pigmentos fueron encontrados en la hoja de espinaca? 3. ¿Cuál de estos pigmentos puede ser considerado el más polar? Explique 4. Explique: ¿Por qué hay diferencias en el desplazamiento de los pigmentos de la hoja de espinaca? 6. CUESTIONARIO 1. Suponga que hay dos compuestos, A y B, en una mezcla. La afinidad química de A por la fase estacionario es menor que la afinidad de B, y la afinidad química de A por la fase móvil es más grande que la afinidad de B. Si la mezcla es sujeta a papel cromatográfico, ¿Cuál  sustancia se habrá desplazado mucho más al finalizar el experimento? ¿Cuál sustancia tundra el valor Rf más largo? Explique cada respuesta. 2. Indique otras aplicaciones de cromatografía en papel además de separar y observar   pigmentos vegetales. 3.  Algunos árboles tienen hojas que son verdes en el verano y rojas, amarillas o naranjas en otoño. ¿Dónde están estos colores durante el verano? ¿Cómo pueden de repente aparecer en otoño? 7. BIBLIOGRAFÍA

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CSUN, ³Separation of Plant Pigments by Paper Chromatograph´, disponible en: http://www.csun.edu/chemistry/documents/Paperchrom.pdf  Paper Chromatography: Chloroplast & Pigment Analysis, disponible en: http://www.chemtopics.com/unit06/pchrom.pdf