DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA Y CATALÍTICA DE LA ENZIMA α-AMILASA Y EVALUACIÓN DE LAS VARIABLES QUE LA AFECTAN. INHIBICIÓN DE LA ENZIMA POLIFENILOXIDASA. J. Carrillo-Moreno Carrillo-Morenoa, J.P. Jiménez-Moncada Jiménez-Moncadaa, L. Arias-Lopera a, M.E. Higuita-Ramíreza a Estudiantes Ingeniería Química, Universidad de Antioquia, Medellín, Colombia
Resumen En el presen presente te artículo artículo se muestra muestran n los result resultados ados exper experimen imentale tales s obtenido obtenidos s luego de la realización realización de diferentes diferentes prácticas prácticas de laboratorio laboratorio con el fin de analizar la acti activi vida dad d enzi enzimá máti tica ca y cata catalí líti tica ca de una una enzi enzima ma come comerc rcia iall ( α-ami -amila lasa sa), ), inte interp rpre reta tand ndo o a part partir ir de gráf gráfic icas as y dato datos s expe experi rime ment ntal ales es.. Se estu estudi dia a el comportamiento comportamiento de esta enzima con respecto a los cambios en el medio variando variando difer diferent entes es parám parámetr etros os como como pH, pH, tempe temperat ratur ura a y conce concentr ntraci ación ón de la enzima enzima,, obteniendo un pH óptimo en un rango de 6.0 a 6.5, y una temperatura óptima de aproximadamente 60°C. Se estudia también el comportamiento de un extracto enzimático de origen vegetal que contiene polifeniloxidasa con el fin de evaluar el efecto que tiene un inhibidor sobre la actividad enzimática.
Palabras clave: α-amilasa, actividad enzimática, polifeniloxidasa, inhibición enzimática, pH, temperatura.
Abstract In this paper, we present present the experime experimental ntal results obtained obtained after after perform performing ing different labs to analyze the catalytic and enzymatic activity of a commercial commercial enzyme enzyme (α-amyl -amylase ase), ), playi playing ng from plots and experimental data. It is studied the behavior of this enzyme with respect to changes in the medium by varying of diff differ eren entt para parame mete ters rs such such as pH, pH, temp temper erat atur ure e and and enzy enzyme me conc concen entr trat atio ion, n, obtaining an optimum pH in a range of 6.0 to 6.5, and an optimum temperature of about 60 ° C. Also is studied the behavior of an enzyme extract of plant origin contain containing ing polifen polifenilox iloxidas idase e in order order to evaluat evaluate e the effect effect of an inhibit inhibitor or on enzymatic activity.
Keywords: α-amylase, enzymatic activity, polifeniloxidase, enzymatic inhibition, pH, temperature.
1. INTRODUCCIÓN Actividad Enzimática: Una enzima enzima es una proteín teína a que cata ataliza iza las reac reacci cion ones es quím químic icas as en los los sere seres s
vivo vivos. s. Exist Existen en vari varios os factor factores es que que alter ltera an o mod modifi ifican la activi tivid dad enzimática enzimática como temperatura, temperatura, pH y conce concentr ntraci ación ón.. Las enzim enzimas as posee poseen n
un pH característico donde su actividad es máxima: por encima o debajo de ese pH la actividad disminuye. La relación pH - actividad enzimática, constituye un factor de regulación intracelular de la actividad enzimática. La velocidad de las reacciones enzimáticas aumenta por lo general con la temperatura, dentro del intervalo en que la enzima es estable y activa. La velocidad por lo general se duplica por cada 10 C° de aumento de temperatura. Sin embargo las enzimas se desnaturalizan cuando la elevación de la temperatura sobrepasa cierta temperatura límite. La cual a su vez es la temperatura óptima de trabajo. A bajas temperaturas, las reacciones disminuyen mucho o se detienen, pero la acción catalítica reaparece cuando la temperatura se eleva a valores normales [1]. Las enzimas amilasas son empleadas en la fabricación de pan para romper azúcares complejos como el almidón (presente en la harina) en azúcares simples. La levadura puede entonces alimentarse de esos azúcares simples y convertirlos en productos de fermentación alcohólica. Este proceso da sabor al pan y hace elevar la masa. Las células de la levadura contienen amilasas pero necesitan tiempo para fabricar la suficiente cantidad para romper el almidón. Este es el motivo de la necesidad de largos tiempos de fermentación (especialmente para determinadas masas). Las técnicas modernas de elaboración de masas incluyen la presencia de amilasas para facilitar y acelerar estos procesos, A nivel industrial, el sustrato principalmente utilizado en la producción de cerveza es el almidón, el cual es degradado por las amilasas [2].
Inhibición
Enzimática:
Los inhibidores enzimáticos son moléculas que se unen a enzimas y disminuyen su actividad. Puesto que el bloqueo de una enzima puede matar a un organismo patógeno o corregir un desequilibrio metabólico, muchos medicamentos actúan como inhibidores enzimáticos. También son usados como herbicidas y pesticidas. Sin embargo, no todas las moléculas que se unen a las enzimas son inhibidores. La unión de un inhibidor puede impedir la entrada del sustrato al sitio activo de la enzima y/u obstaculizar que la enzima catalice su reacción correspondiente. La unión del inhibidor puede ser reversible o irreversible. Normalmente, los inhibidores irreversibles reaccionan con la enzima de forma covalente y modifican su estructura química a nivel de residuos esenciales de los aminoácidos necesarios para la actividad enzimática. En cambio, los inhibidores reversibles se unen a la enzima de forma no covalente, dando lugar a diferentes tipos de inhibiciones, dependiendo de si el inhibidor se une a la enzima, al complejo enzima-sustrato o a ambos [3]. Hay inhibición cuando disminuye la actividad y la eficacia de una enzima. Las sustancias distintas del sustrato que tienen este efecto se denominan inhibidores [4]. Según el modo de actuación de los inhibidores, se pueden diferenciar Varios tipos de inhibición: competitiva, no competitiva, acompetitiva o mixta [3], [4]. Las polifenoloxidasas (PFO) que se encuentran en las plantas son las responsables de las reacciones de pardeamiento enzimático que ocurren durante el almacenamiento, manipulación y procesamiento de frutas y vegetales. Las polifenoloxidasas catalizan la
hidroxilación de monofenoles a ortodifenoles, posteriormente oxidados a ortoquinonas, las cuales se polimerizan dando lugar a pigmentos que presentan color marrón, rojo o negro, dependiendo de los componentes naturales presentes en los tejidos vegetales. Estas reacciones modifican las características organolépticas y nutricionales del alimento, depreciando su calidad. En el presente informe nos proponemos caracterizar el αcomportamiento de la enzima amilasa frente a cambios de temperatura, concentración y pH es decir cómo cambia su actividad
enzimática al modificarle estas condiciones utilizando como sustrato el almidón. Entre los propósitos de este artículo se encuentran experimentar, evaluar, comprender y analizar los múltiples aspectos de la labor enzimática modificando ciertas condiciones y cómo estas influyen sobre su actividad catalítica, recopilando los resultados de cada procedimiento y analizando el porqué de ellos. También determinamos experimentalmente la actividad de las enzimas polifenoloxidasas las cuales se extraen de los vegetales y en las que se aplica un inhibidor que modifica la actividad enzimática.
2. Materiales y métodos
Se recurrió a una solución acuosa de α-amilasa 1 en 150, NaCl 0.9 %, almidón 1% y lugol. En los procedimientos mencionados anteriormente fueron indispensables materiales como micropipetas para medir los volúmenes que se emplearon en cada uno de los métodos, tubos de ensayo, agitador magnético, recipientes con baño de hielo y baño termostático; el espectrofotómetro, el cual se utilizó para medir absorbancia en cada uno de los procesos que se realizaron para evaluar cómo cambiaba la actividad de la enzima al modificar condiciones de pH, concentración y temperatura. El almidón fue la población utilizada en todos los procedimientos ya que sirvió como sustrato para evaluar la α-amilasa, actividad de la enzima que se puede encontrar en frutas, granos de cereales y semillas de leguminosas.
2.1. Actividad catalítica de la αamilasa y variables que la afectan 2.1.1. Evaluación del cambio de pH sobre la actividad de la enzima amilasa: Se utilizaron soluciones buffer 0.1 Molar; citrato con pH: 3; fosfato con pH: 5 y 7; borato con pH: 9. Además de estos reactivos también fueron necesarios NaCl, 0.4 ml de solución amilasa salival 1 en 150, lugol y almidón.
2.1.2. Evaluación del cambio de concentración de la enzima sobre la reacción de hidrólisis de la amilasa: Se emplearon soluciones acuosas de amilasas en proporciones 1 en 75; 1 en 100; 1 en 200 y 1 en 150; además de NaCl 0.9 %, almidón 1% y finalmente lugol.
2.1.3. Evaluación del cambio de temperatura sobre la actividad de la enzima amilasa:
2.2. Determinación de la actividad enzimática
Para medir la actividad enzimática se utilizó solución buffer de fosfato con pH 6.2, agua, alfametildopa, extracto enzimático e inhibidor. Para este procedimiento se usó primordialmente el espectrofotómetro en el cual se midió la absorbancia de cada solución inmediatamente después de agregar el extracto enzimático. Para determinar la actividad enzimática se aplica la relación: velocidad de la reacción/cantidad de enzima. El objeto de estudio fue el banano del cual se extrajo la enzima. El procedimiento consistió en pesar, adicionar solución buffer de 6.2, triturar con la ayuda de un mortero, filtrar, centrifugar y decantar; se conservó el sobrenadante que cumplió el papel de extracto enzimático. Todos los implementos (reactivos e instrumentos) utilizados y anteriormente mencionados fueron facilitados por los laboratorios de la Universidad de Antioquia, lugar en el cual se realizó el procedimiento.
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Gráfica 1.1. Evaluación del cambio de pH sobre la actividad de la enzima amilasa. La influencia del pH sobre la actividad enzimática se ilustra en la gráfica 1.1. El perfil de actividad muestra que la amilasa presenta actividad máxima en el rango de pH de 6.0 a 6.5. El efecto del pH sobre la catálisis enzimática refleja el estado de ionización de algunos aminoácidos importantes para que se lleve a cabo la reacción catalítica, a partir de los datos obtenidos podemos afirmar que el rango de pH está acorde con los datos encontrados en la literatura [5]. A pH muy ácidos o muy básicos la enzima no funciona, o al menos disminuye notablemente su actividad.
Tabla 1.1. Datos de absorbancia relacionada con el pH obtenidos en el laboratorio Intensidad pH Absorbanci color a Transparen 5 0,009 te Transparen 6,2 0,03 te Transparen 7 0,025 te transparent 9 0,013 e Azul Blanco Esto podemos concluir a partir de los experimentos encontrados en la
literatura, que manteniendo el resto de las condiciones iniciales, midieron la actividad de la amilasa.
Tabla 1.2. Datos de absorbancia relacionada con la temperatura obtenidos en el laboratorio Intensidad Temperatu color ra (°C) Azul medio 4 Transparen 23 te Transparen 50 te Azul 96 Azul 23
Absorbanci a 0,01 0,022 0,01 0,009 1,286
fracción de almidón que con el yodo forma un complejo de coloración azul [6].
Tabla 1.3. Datos de absorbancia relacionada con la concentración de sustrato obtenidos en el laboratorio Intensidad color
Concentrac ión de almidón Transparen 0,013 te Transparen 0,01 te Transparen 0,005 te Azul Blanco
Absorbanci a 0,013 0,016 0,022 0,886
Gráfica 1.2. Evaluación del cambio de la temperatura sobre la actividad de la enzima amilasa. Podemos ver a partir de la gráfica 1.2 que existe una mayor actividad enzimática a una temperatura cercana a 50 °C, punto en el cual la temperatura es óptima, al sobrepasar esta temperatura ocurre la desnaturalización de la enzima amilasa. En este momento la enzima ya no está haciendo efecto sobre el sitio activo del sustrato, lo que permite que el lugol entre a él, y se observa un cambio de color (de transparente a azul) que da cuenta de la presencia de amilosa: esta es la
Gráfica 1.3. Evaluación del cambio de la concentración sobre la actividad de la enzima amilasa. En esta gráfica se puede observar que existe una relación directamente proporcional entre el inverso de la absorbancia y la concentración de sustrato (almidón), por lo que también se puede concluir que a mayor concentración de la enzima amilasa es mayor la concentración de producto debido a que estas dos
concentraciones son directamente proporcionales. Para hacer el análisis, lo correcto era calcular la concentración de sustrato y graficarla con respecto a la absorbancia. No se hizo de este modo debido a que los valores de absorbancia obtenidos en el laboratorio no se adaptan a la curva de calibración de almidón que fue suministrada.
Tabla 2.1. Actividad enzimática sin inhibición Tiempo (min) 0,2683 0,783 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5
Absorbancia 0,018 0,022 0,021 0,023 0,024 0,025 0,025 0,026 0,027 0,027 0,028
Gráfica 2. Efecto de la inhibición en la actividad enzimática respecto al tiempo. La tendencia superior corresponde al comportamiento de la enzima sin inhibidor y la gráfica inferior corresponde al comportamiento de la enzima con inhibidor. La pendiente de las dos gráficas da cuenta de la actividad enzimática, se puede concluir que el valor de la ecuación de la recta para cada una que el valor de la pendiente es el mismo (m=0.0018), a partir de los resultados encontrados en la literatura podemos decir que en un rango de concentraciones de polifeniloxidasa el comportamiento en la actividad enzimática es muy similar.
4. CAUSAS DE ERROR Las principales desviaciones presentes en los resultados se deben a errores humanos ya que muchas
Tabla 2.2. Actividad enzimática sin inhibición Tiempo (min) 0,783 1,256 2,09 2,59 3,09 3,59 4,09 4,59 5,09 5 59
Absorbancia 0,004 0,005 0,006 0,006 0,007 0,008 0,009 0,011 0,012 0 012
personas manipularon las muestras con diferentes técnicas y precauciones. Puede pensarse también que debido al tiempo estipulado para la práctica no se obtuvieron los mejores resultados con respecto a la actividad enzimática. Una de las posibles causas de error al momento de estudiar la actividad del extracto enzimático vegetal es la temperatura a la que se encontraba y también su estado de maduración, es decir, que tan (maduro o verde) estaba. Debido a que se estaba trabajando con instrumentos (equipos electrónicos) la descalibración o mal manejo de estos puede desviar en gran medida los resultados y al momento de tomar uno de los volúmenes al realizar la preparación de soluciones con diferente concentración una de las micropipetas estaba descalibrada.
5. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS. [3]. http://es.wikipedia.org/wiki/Enzima#In hibici.C3.B3n [5]. http://www.revista.unal.edu.co/index. php/dyna/article/view/15673/18741 [6]. La página 23 de la guía del laboratorio. Busquen en lo que mandó el profe cómo se referencia.
