FORMAS DE OBTENCIÓN DE LA INVERTASA: Generalidades Producción de enzimas Orígenes y características de las enzimas Las enzimas comerciales utilizadas por la industria pueden surgir de fuentes animales, vegetales o microbianas. La amilasa de la malta, las proteasas, la ficina y la bromelína proceden de vegetales, mientras que las proteasas, la amilasa, am ilasa, las lipasas pancreáticas, la pepsina y la renina de la mucosa intestinal, etc. Hoy en día, los microorganismos se han convertido en la principal fuente de enzimas comerciales. Las enzimas son muy importantes en la industria de la transformación de alimentos en la producción de ingredientes y en la modificación de la textura. Las ventajas de emplear enzimas microbianas en procesos industriales son debidas a ventajas de usar enzimas microbianas en procesos industriales son debidas a (1) la existencia de diferentes tipos de actividad enzimática, (2) la rapidez y estabilidad de producción mediante un proceso barato de fermentación microbiana, reproducible reproducible y seguro, y (3) las mejoras en cuanto a rendimiento se obtienen mucho más fácilmente mediante ingeniería genética o de proteínas que por medio de la mejora de cultivo de vegetales o la cría de animales. La capacidad de los microorganismos para producir enzimas que sean estables y activas en condiciones extremas de pH y temperatura puede ser la responsable de las mejoras observadas o bservadas en rendimientos y parámetros económicos de ciertos procesos industriales. Antes de elegir el microorganismo a partir del cual va a obtenerse una determinada enzima han de considerarse varios aspectos:
La cepa debe ser capaz de producir altas cantidades de enzima en el tiempo t iempo de fermentación más corto posible. Si es posible, deberían utilizarse enzimas extracelulares porque son más fáciles de producir y de aislar, mientras que las enzimas intracelulares deben atravesar un proceso de purificación caro en la mayoría de ocasiones. Se prefiere utilizar microorganismos de calidad alimentaria (GRAS) pues no produce sustancias tóxicas y ello facilitará su aprobación por el organismo regulador pertinente. Una cepa de producción debería crecer en un medio barato que contenga sustratos económicos, ya que los costes de las materias primas constituyen los costes principales de la fermentación
Por estos aspectos la mayoría de las enzimas de uso alimentario son producidas por especies de Bacillus y Aspergillus, que son capaces de secretar enzimas y crecer en medios baratos. Las enzimas se venden en base a su actividad más que por su peso o volumen, de modo que es crucial importancia mantener la estabilidad de la preparación de la enzima durante el almacenamiento. Las enzimas de uso industrial, excepto las utilizadas en las industrias de producción de aminoácidos y antibióticos, rara vez son puras, pero es necesario que las impurezas presentes no interfieran con la actividad de la enzima. Aunque las enzimas entran en contacto con los alimentos, la mayor parte de estos catalizadores son inactivados después de realizar su función durante los procesos de cocinado, horneado o pasteurización.
Procesos de fermentación Para producir enzimas microbianas se usan cultivos tanto en superficie (sólidos) como sumergidos (líquidos). El cultivo de los microorganismos se realiza sobre la superficie de un medio sólido, como por ejemplo sobre salvado de trigo, con un elevado contenido en nutrientes que incluye minerales y sales. Esta técnica todavía se usa en la producción de amilasa, proteasa y lipasas de especies de Aspergillus y Mucor, así como la pectinasa y la celulasa de especies de Aspergillus y Penicillium. El cultivo de los hongos se realiza en un proceso de placas, en el que el sustrato se vuelca en forma de capa fina en salas de incubación, o en el proceso de tambor, en tambores horizontales rotatorios. Tras la siembra de los hongos de esporas, se extrae el micelio con una solución acuosa o salina en un circuito en contracorriente, y la solución concentrada en enzima se precipita. En este proceso la mayor dificultad radica en los elevados de manipulación y control de la contaminación, temperatura, humedad y aireación. Actualmente los métodos de cultivo sumergido que emplean fermentadores son los que dominan la producción de enzimas, ya que presentan menos riesgo de contaminación y ofrecen menores costes de manipulación y mayores rendimientos. El cultivo sumergido normalmente se realiza en un tanque con agitación mecánica con una capacidad entre 10.000 y 100.000 litros y suele operar de manera discontinua. Dependiendo de la enzima y del microorganismo empleado, la porción principal de fermentación, especialmente para enzimas extracelulares, viene a durar entre 30 y 150 horas. Aislamiento y purificación de enzimas En el caso de enzimas extracelulares, la mayor parte de la enzima se encuentra el sobrenadante del cultivo, de modo que los métodos de recuperación suelen ser operaciones unitarias de centrifugación, o filtración, o evaporación a vacío y precipitación de las proteínas. Para recuperar enzimas intracelulares, que están concentradas en el interior de la biomasa, deben utilizarse métodos físicos y mecánicos para desintegrar las paredes celulares intactas. Se puede utilizar la autólisis, pero a escala industrial se prefieren métodos físicos como el homogeneizador a alta presión o el molino de agitación de bolas. Una vez rotas las células, la enzima puede purificarse como en el caso de las enzimas extracelulares; pero normalmente el proceso es más difícil por la presencia de restos celulares y ácidos nucleicos procedentes de células rotas. Las proteínas pueden precipitarse con sulfato amónico o sulfato sódico. Cuando se trata de enzimas termorresistentes, pueden desnaturalizarse las proteínas a elevadas temperaturas, centrifugarse y tomar el sobrenadante pues la proteína termorresistente se habrá m antenido soluble. A escala industrial los principales agentes precipitantes son solventes orgánicos como los alcoholes (etanol, metanol, isoprenol). También se han utilizado varios polímeros como agentes precipitantes (por ej., el polietilenglicol, polietilenimina). Los ácidos nucleicos confieren una alta viscosidad a la solución de enzimas e interfieren en el fraccionamiento de proteínas y en las separaciones cromatográficas; por ello es deseable eliminar estos componentes antes de intentar la purificación de enzimas intracelulares. Las sales de magnesio, el sulfato de estreptomicina, el sulfato de protamina y el polietilenimina son algunos de los compuestos utilizados como precipitantes de ácidos nucleicos. Se pueden emplear la ultrafiltración para concentrar la solución enzimática antes de la evaporación al vacío, pero las membranas se ocluyen fácilmente con precipitados. Existen muchos procedimientos
cromatográficos y de partición para una posterior purificación, pero pocas enzimas industriales se someten a purificación cromatográfica. Dependiendo de la termoestabilidad de la enzima, el precipitado puede deshidratarse por liofilización, por desecación al vacío, o por atomización. Durante la deshidratación, se añaden estabilizantes como azúcares, sustratos de la enzima, cofactores o agentes reductores para estabilizar la enzima. Cultivo microbiano
Propagación
Fermentación
Separación
Productos extracelulares
Productos intracelulares (biomasa celular)
Evaporación a vacío o ultrafiltración Concentración de la enzima
Solubilización o desinte ración Separación (líquido/ sólido)
-NaSO4 (NH4)2SO4 Precipitación
Filtro prensa
Concentración de la enzima
Restos celulares
Precipitación
Estabilizantes en líquido Secado a vacío o por atomización
Purificación y estabilización
Envasado
Secado
Envasado
Pasos en la purificación de una enzima Purificación inicial
Centrifugación o técnicas de filtración
Concentración
Remoción de restos celulares y ácidos nucleicos Separación de sólidos y líquidos
Precipitación:
Sulfato de amonio Solventes orgánicos Polímeros orgánicos
Remoción de contaminantes orgánicos e inorgánicos
Técnicas de membrana
Final purificación
Métodos cromatográficos
Prueba de pureza
Diálisis Ultrafiltración
Intercambio iónico Interacción hidrofóbica
Alta purificación y separación
Espectrofotometría, electroforesis, espectrometría de masas, etc.
Obtención de la invertasa por Aspergillus Los hongos filamentosos sintetizan y secretan en grandes cantidades sólo las enzimas hidrolasas necesarias para degradar algunos componentes del medio en el cual se desarrollan. De acuerdo con Pel et al. (2007) citado por Veana et al. (2011), A. niger secreta el 77% de enzimas al medio de cultivo, seguido de A.oryzae, A.nidulans y A. fumigatus. El m ecanismo de inducción de invertasa de A.niger es diferente al de las levaduras, e las cuales la síntesis de la enzima es constitutiva y los niveles de secreción de la enzima al medio de cultivo son muy bajos en comparación con los nivles que secreta A.niger. Por lo cual a continuación se presenta el mecanismo de regulación de síntesis de invertasa de ese microorganismo. Rubio & Navarro (2006) citados por Veana et al. (2011) describen un mecanismo de regulación de la síntesis de la enzima A.niger, en el cual existe interacción de moléculas de sacarosa con el receptor de la membrana celular generando señales químicas que podrían ser tr asladadas y
amplificadas por monofosfato de adenina cíclico (cAMP) en el núcleo celular comenzando la inducción de la síntesis de invertasa a nivel de ADN. El ARNm podría trasladar la información de la síntesis de invertasa a los ribosomas, para después ser sintetizada y secretada al espacio periplásmico, o bien en la pared celular. La secreción de proteínas por A.niger involucra transporte vía retículo endoplásmico, aparato de Golgi y vesículas de la membrana celular (Pel et al., 2007).
Aprovechamiento de residuos agroindustriales parala producción de invertasa Actualmente se han empleado residuos agroindustriales como sustratos en fermentación en estado sólido y en cultivo sumergido, para la obtención de enzimas de interés biotecnológico. Ashokkumar et al. (2001) citado por Veana et al. (2011) emplea el uso de bagazo de caña de azúcar como soporte para la fermentación en estado sólido para la optimización de la producción de invertasa por Aspergilllus niger, se obtuvo una actividad enzimática de 10735 U/l. Así mismo,Vargas et al. (2004) citado por Veana et al. (2011) evaluaron el efecto del ultrasonido sobe la producción de invertasa de A.niger, con el aprovechamiento de melaza de caña de azúcar como sustrato. El objetivo de usar el ultrasonido fue la extracción y liberación de la enzima intracelular.
Más tarde Rajoka & Yasmeen (2005) citados por Veana et al. (2011) emplearon una cepa mutante de A. niger NIA 280 para la obtención de la enzima, empelando mazorcas de maíz, arroz pulido, cáscara del mismo y salvado de trigo. Se obtuvo que el mejor residuo lignocelulósico es el salvado de trigo, alcanzando una productividad de 516 U/l.l, cifra que supera 2 veces la productividad que se obtiene con la cepa nativa. Recientemente Reddy et al. (2010) citados por Veana et al. (2011) emplearon residuos agroindusriales para la expresión de invertasa de A. niger, dentro de estos reisuos se encuentran el salvado de trigo y arroz, hojas y cáscaras de plátano, achicoria, aserrín y melaza de caña de azúcar. Por otra parte, Uma etl al. (2010) utilizaron cáscaras de naranja, piña y granda como sustratos, para la producción de invertasa de A. flavus. Se encontró que la mejor actividad enzimática obtenida por la cepa es de 25,8 U/ml empleando un 3% de inóculo en las 96 horas de cultivo. Purificación de la enzima La purificación de proteínas es en sí la separación de las proteínas de interés de una mezcla compleja para su posterior caracterización. Existen diferentes métodos para separar y purificar las enzimas de la mezcla de restos celulares en lo que se encuentra. La precipitación selectiva es un procedimiento que induce un cambio en la solución para que la proteína de interés o los contaminantes alcancen su punto isoeléctrico ( el valor de pH en el que la sustancia tiene una carga neta de cero) y precipiten. Esta técnica implica el uso de sales, solventes orgánicos y polímeros, considerándose más empleada la precipitación salina con sulfato de amonio. La alta solubilidad de la sal causa una competencia por el agua de la solución, causando que las proteínas menos hidrófilas pierdan agua en su entorno y precipiten en orden de solubilidad. (Prado-Barragán et al., 1999) Así mismo el empleo de técnicas cromatográficas ha beneficiado la purificación de enzimas. Dentro de las técnicas empleadas se encuentra la filtración en gel, también conocida como cromatografía en gel y cromatografía de exclusión molecular (Molecular Exclusion Chromatography, MEC). Este tipo de cromatografía realiza separaciones más discriminatorias basadas en el tamaño. Las columnas empleadas están rellenas de esferas porosas compuestas de un polímero insoluble pero altamente hidratado (dextrano, agarosa o poliacrilamida). Las moléculas pequeñas se encapsulan y se distribuyen entre las esferas, permitiendo la fluidez de las moléculas grandes a través de la columna, las cuales son de interés. Por otro lado, se encuentra la cromaografía de intercambio iónico (Exchange Ion Chromatography, EIC), técnica más usada en la separación de proteínas en base a su carga neta positiva a pH 7, ésta se unirá normalmente a una columna de esferas que contengan grupos carboxilos, mientras que una proteína con carga neta negativa no lo hará. Las proteínas cargadas positivamente se pueden separar en columnas de carboximetil-celulosa cargadas negativamente. Mientras que las proteínas cargadas negativamente se pueden separar en columnas de dietilaminoetil-celulosa cargadas positivamente (Berg et al., 2008). Un tipo de cromatografía líquida es FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography). La fase móvil consiste en un líquido que arrastra a la muestra a través de una fase estacionaria que suele ser
una resina compuesta de perlas de agarosa reticulada con diferentes ligandos de superficie en función de la meta de purificación (Prado-Barragán et al., 1999). Las columnas que se utilizan en FPLC pueden separar macromoléculas en función del tamaño, distribución de la carga, hidrofobicidad o en fase inversa (Verbeke & Verbruggen, 1996). Se ha realizado diversos estudios sobre la producción y purificación de invertasa por hongos filamentosos específicamente del género Aspergillus. A continuación, se muestran los pasos de purificación de invertasa según diversos autores.
