UNIVERSIDAD UNIVERSIDAD NACIONAL DE MAR DEL PLATA FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS BIOQUIMICA I
TRABAJO PRACTICO: Actividad enzimática: invertasa de levadura. Introducción Las enzimas catalizan las reacciones disminuyendo la energía libre de activación necesaria para que las mismas ocurran. La molécula sobre la cual la enzima
actúa
se
denomina
sustrato,
esta
molécula
se
transforma
obteniéndose el producto. La molécula de enzima no se modifica al término de la reacción y puede continuar catalizando la misma repetidas veces. Las enzimas son proteínas globulares *1. Su conformación espacial presenta un área, denominada sitio activo, el cual es fundamental para su actividad catalítica. La naturaleza y el arreglo espacial de los aminoácidos en este sitio activo hacen que éste sea específico para un único tipo de sustrato. Aún cuando existan distintas moléculas que podrían ser sustrato, sólo aquella cuya forma sea complementaria con el sitio activo será capaz de unirse al mismo. Cuando el sustrato apropiado se une a la enzima, se producen cambios en el sitio activo. Esta modificación, denominada ajuste inducido, incrementa la catálisis. La liberación de los productos restablece la enzima a su forma original, pudiendo la misma repetir el proceso sucesivas veces, mientras haya sustrato presente. La conformación de una enzima es mantenida por las interacciones que se establecen entre las regiones específicas de los aminoácidos que componen la cadena polipeptídica. Debido a ello la misma es susceptible ante cambios en el ambiente en el cual se encuentra, siendo dos de los factores más
*1
Existen algunos tipos de ARN que pueden actuar como enzimas, catalizando el clivaje y formación de uniones fosfodiéster. Estos ARN con actividad catalítica se denominan ribozimas y son menos comunes que las enzimas proteicas
importantes la temperatura y el pH. Cuando estos varían de forma tal que la conformación de la proteína es alterada, la enzima pierde su actividad. Cada enzima funciona mejor en un determinado rango de pH. Por ejemplo la pepsina, presente en el estómago, presenta máxima actividad catalítica en un ambiente fuertemente ácido, mientras que la lipasa, presente en el intestino delgado, lo hace a pH básico. La concentración de H + afecta la velocidad de reacción debido a su efecto tanto a nivel de la ionización del sitio activo como de la estructura espacial de la enzima. La catálisis usualmente requiere que tanto la enzima como el sustrato presenten grupos químicos específicos en su forma ionizada o deionizada para reaccionar. Por ejemplo, la actividad catalítica puede requerir que un grupo amino de la enzima esté en su forma protonada (-NH3+), a pH alcalino este grupo estará deprotonado, por lo cual la tasa de la reacción decaerá. Por otra parte, en el rango óptimo de pH para la actividad de la enzima el sitio activo presenta la conformación apropiada para la unión del sustrato. En cambio, ante un exceso de H + o de OH- se altera la conformación espacial de la proteína globular, incluido su sitio activo, lo cual lleva a que la enzima no pueda catalizar la reacción. Las reacciones químicas incrementan su velocidad con la temperatura, por ello la catálisis también puede incrementarse con la temperatura. Sin embargo, cada enzima presenta un rango de temperatura óptima. Por encima de éste la velocidad de reacción disminuye, hasta que la proteína pierde su configuración funcional, lo cual se denomina desnaturalización.
Invertasa de levadura La sacarosa, comúnmente conocida como azúcar de mesa, es un disacárido compuesto por α-D-glucosa y β-D-fructosa unidos mediante enlace glicosídico α-1,2. Cuando este enlace es roto en la reacción de hidrólisis, se genera una mezcla equimolar de glucosa y fructosa. La sacarosa puede ser hidrolizada en presencia de una enzima comúnmente denominada invertasa o sacarasa: Sacarasa
Sacarosa + H2O --------------------------- Glucosa + Fructosa
La denominación sistemática de la invertasa es β-fructofuranosidasa, debido a que la reacción catalizada por esta enzima es la hidrólisis del residuo terminal β-fructofuranósico. Existe otra enzima, la α-D-glucosidasa, que también cataliza esta reacción, escindiendo la unidad terminal de la glucosa. La sacarosa también puede ser hidrolizada de manera no enzimática en medio ácido. La invertasa es una enzima muy utilizada en la industria alimenticia ya que debido a su sabor más dulce y a que no cristaliza tan fácilmente, se prefiere a la fructosa sobre la sacarosa. Un amplio rango de microorganismos sintetizan invertasa pudiendo, por lo tanto, emplear la sacarosa como nutriente. A escala comercial es biosintetizada por las cepas de levadura Saccharomyces cerevisiae y Saccharomyces carsbergensis . A diferencia de otras enzimas, la invertasa presenta actividad relativamente elevada en un rango amplio de pH (desde 3,5 a 5,5) con el óptimo en pH= 4,5. En cuanto a la temperatura, el máximo de actividad se registra alrededor de los 55°C. El valor de la cons tante de Michaelis-Menten varía según las diferentes isoformas entre 2 mM y 5 mM. El plomo, mercurio y otros metales pesados son extremadamente tóxicos dado que actúan como inhibidores de enzimas. Por ejemplo, el plomo puede reaccionar fácilmente con los grupos sulfhidrilos (-SH) de las proteínas: proteína-SH + Pb++ + HS-proteina
proteina-S-Pb-S-proteina + 2H+
Los puentes disulfuro son vitales en la estabilización de la estructura tridimensional de la proteína, la cual es determinante de la funcionalidad de la enzima. La actividad de la invertasa es inhibida en presencia de metales pesados, por ejemplo los iones Ag 1+ atacan a la histidina de la cadena peptídica inactivándola. El sulfato de cobre en concentraciones elevadas también presenta un efecto inhibidor.
Objetivo: En el presente trabajo práctico se realizará la extracción de la invertasa de levadura y, posteriormente, se verificará su acción sobre una solución de
sacarosa. La misma se comprobará mediante el test de Fehling, el cual permite detectar la presencia de los productos de la hidrólisis de este disacárido (glucosa y fructosa).
Protocolo de trabajo: A- Obtención de la enzima Colocar 7,5 g de levadura de cerveza (Saccharomyces cerevisiae) en un mortero y agregar 15 ml de solución de bicarbonato de sodio 0,1M (buffer de extracción). Mezclar y dejar en contacto durante 20' agitando periódicamente. Trasvasar a un tubo de centrífuga y centrifugar durante 10' a 3000 rpm. Recuperar el sobrenadante, el cual contiene la enzima, y será el
extracto
enzimático (EE*) a utilizar. Tomar una alícuota de 2 ml del EE y hervirla a BM durante 10 minutos, este será el extracto enzimático hervido (EEH**).
B- Proceso enzimático Realizar una batería de tubos de ensayo siguiendo las indicaciones de la siguiente tabla: Sacarosa Inulina (1) Tubo
0,02M
(0,5%)
Na OH
SO4Cu
(0,5%)
(0,25 %)
EE*
EEH**
mL 1
2
-
-
-
-
-
2
2
-
-
-
0,5
-
3
2
-
-
-
1
-
4
2
-
-
-
-
1
5
2
-
0,25
-
1
-
6
2
-
1
-
1
-
7
2
-
-
0,25
1
-
8
2
-
-
1
1
-
9
-
2
-
-
1
-
(1) La inulina es un polímero de fructosa que se utiliza como posible sustrato alternativo. Dejar reaccionar durante 15' a temperatura ambiente.
C- Detección de los productos de la catálisis Agregar a cada tubo 2 ml del reactivo A de Fehling y 2 ml del reactivo B de Fehling. Colocar los tubos en baño de agua a 100°C durante 10', retirarlos y dejarlos enfriar en la gradilla.
D- Resultados Los productos de la hidrólisis de la sacarosa -fructosa y glucosa- dan resultado positivo para el test de Fehling, lo cual es indicado por la aparición de un precipitado rojo ladrillo. Compare los resultados obtenidos en los distintos tubos -aparición o no del precipitado y cantidad del mismo- y trate de explicarlos en base a los reactivos agregados en cada uno.
Bibliografía - Brock, T.D.; M.T. Madigan; J.M. Martinko and J. Parker. 1994. Biology of microorganisms. Seventh edition, Prentice-Hall International (UK) Limited, London. - Devlin, M.D. 1992. Textbook of Biochemistry. Third edition. Wiley-liss, INc. EUA. -
Univ.
of
Missouri,
Columbia.1973-1974.
Laboratory
Manual
for
210
Biochemistry-Dept of Agricultural Chemistry. Lucas Brothers Publishers.
Actividades complementarias 1- En el potocolo experimental realizado, cuál es el rol del Na OH agregado a algunos de los tubos? a- Es el sustrato sobre el que actúa la enzima. b- Acelera la reacción entre la enzima y el sustrato. c- Desnaturaliza la enzima por alterar su sitio activo. d- Bloquea el sitio activo de la enzima.
2- ¿Cuál es el objeto de realizar el primer tubo de la serie -el cual contiene sólo sacarosa-?
3- La tasa de reacción puede medirse, a través del tiempo, por desaparición de sustrato o por aparición de producto. Este último es el método empleado en el Gráfico 1. En base al mismo, ¿cuál es la tasa de reacción, en moles.segundo-1, en el intervalo entre 0 y 10 segundos?
o t c u d o r p e d s e l o m e d ° N
Tiempo (segundos)
Gráfico 1: 4- Las actividades planteadas a continuación están basadas en el siguiente gráfico de catálisis enzimática:
Gráfico 2:
o t c u d o r p e d s e l o m e d ° N
Tiempo (segundos)
A)- ¿En cuál de los siguientes intervalos de tiempo se alcanza la máxima velocidad de reacción? a. 0-30 segundos b- 60-120 segundos
c- 120-180 segundos d- durante todo el periodo considerado.
B) Con el objeto de mantener una tasa constante durante todo el período considerado, cuál de los siguientes pasos debería realizarse? a- agregar más enzima b- incrementar la temperatura gradualmente después de los 60 segundos. c- agregar más sustrato. d- Remover el producto acumulado.
C) ¿Cuál de los siguientes gráficos representa la tasa de reacción mostrada en el gráfico 2? Nota: en el eje y se representa la evolución del número de moléculas de sustrato.
s a l u c é l o 1 m e e d s . o r e m ú N
s a l u c é l o 1 m e e d s . o r e m ú N
Tiempo (segundos) s a l u c é l o 1 m e e d s . o r e m ú N
Tiempo (segundos)
s a l u c é l o 1 m e e d s . o r e m ú N
Tiempo (segundos)
Tiempo (segundos)
