ENZIMA INVERTASA DE LEVADURAS Saccharomyces cerevisiae
INTRODUCCIÓN
En esta práctica vamos a ver la acción de la invertasa y demostraremos entre otras cosas la velocidad de la reacción que cataliza. La invertasa se conseguirá de células de levadura del Saccharomyces cerevisiae que que se rompe rompen n por por autó autólis lisis is cuand cuando o se le agre agrega ga el cloro clorofo formo rmo,, traba trabajan jando do posteriormente con el sobrenadante. Luego de “romper” las células de levadura desecadas desecadas por autolisis se determinará la actividad específica y total del autolisado bruto una vez eliminado el debris celu celula lar. r. La enzim nzima a brut bruta a se puri purifi fica ca lueg luego o por por elim elimin inac ació ión n del del mate materi rial al conta contamin minan ante te (prot (proteín eínas as y otras otras moléc molécul ulas) as).. Finalm Finalmen ente te se determ determina inara ra la presencia de la enzima con la ayuda del reactivo de Benedict. La actividad enzimática se pone de manifiesto incubando el sustrato de sacarosa juntamente juntamente con la enzima y posteriormente posteriormente paramos la reacción y medimos colorimétricamente la reducción del ión cúprico (sulfato cúprico presente en el reactivo de Benedict) a ión cuproso. Se basa en que la sacarosa no contiene átomo de carbono anomérico libre y por lo tanto no es un azúcar reductor.
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MARCO TEÓRICO
La invertasa es también conocida como sacarasa; la cual desdobla la sacarosa en fructosa y glucosa, como todas las enzimas, también es susceptible de efectuar la reacción en sentido inverso:
invertasa Sacarosa Fructosa
+
Glucosa
En base a la reacción anterior, la sacarasa o invertasa es utilizada para hidrolizar la sacarosa y polisacáridos que presenten el mismo tipo de enlace ( β -dfructofuranosil ). Las enzimas del tipo de la invertasa se encuentran presenten en el organismo de las abejas y en algunas levaduras. En 1860, Bertheelot, que se hallaba trabajando en la purificación de un enzima procedente de la levadura que hidrolizaba la sacarosa, le llamó "ferment inversif", en razón de la inversión (de + a -) de la rotación óptica durante la hidrólisis de la sacarosa. Más recientemente se han usado los nombres de invertasa, sucrasa,
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sacarosa y β -fructofuranidasa para denominar la enzima hidrolizante de la sacarosa. Muchos fructofuranósidos son susceptibles de hidrólisis por esta enzima, pero la sacarosa es el mejor sustrato. La reacción hidrolítica se mide observando el cambio de la rotación óptica o de poder reductor al incubar sacarosa con la enzima. A la mezcla resultante de Fructosa y Glucosa se le denomina “Azúcar invertido” debido a la inversión de sus propiedades ópticas de una rotación positiva [ + 66.5] a una rotación negativa que es promedio de la rotación de la glucosa [+52.7] y de la fructosa [-92.4]. El primero en describir esta propiedad, poniendo asimismo su nombre de invertasa a la enzima fue Berthelot en 1860. La forma más común de este azúcar invertido la miel de abeja, la cual, es una mezcla sobresaturada de glucosa y fructosa. Aparte de cambiar sus propiedades ópticas, también cambian las propiedades químicas de las soluciones que son tratadas mediante invertasa. En el caso de la sacarosa, el tipo de enlace que subsiste entre sus moléculas enlazadas de fructosa y glucosa (que es α para la glucosa y β para la fructosa) impide que dicha molécula contenga terminales reductores (aldehídos o cetónicos). Al hidrolizarse, estas moléculas quedan libres recuperando así su poder reductor. Normalmente se obtiene a partir de la levadura Saccharomyces cerevisiae y se utiliza en la confección de fórmulas que prevengan la cristalización de determinados preparados dulces, incluyendo la industria del chocolate. En algunos jarabes se utiliza también para aumentar sus propiedades edulcorantes. Otra aplicación es su utilización para la fabricación de rellenos blandos de caramelos. Fisiológicamente, cuando el ser humano consume azúcar común o sacarosa, la invertasa presente en la saliva y en tracto digestivo, cataliza la reacción de rompimiento del enlace glucosídico haciendo que el procesamiento y asimilación de esta por su organismo sea bastante rápido.
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PARTE EXPERIMENTAL
OBJETIVO •
Determinar la actividad de la enzima invertasa de las levaduras Saccharomyces cerevisiae.
REACTIVOS • • •
Reactivo de Benedict Cloroformo Solución de sacarosa 2% estéril
MATERIALES Y EQUIPOS • • • • • •
Pipetas Tubos de ensayo Mortero y pilón Papel de filtro Cepa: Saccharomyces cerevisiae Estufa
Técnica operatoria
a) Colocar en un mortero 10g de levadura Saccharomyces cerevisiae y 5ml de cloroformo (lisa la levadura para dejar libre a la enzima invertasa), mezclar hasta formar una pasta fina. Agregar 10ml de agua destilada y mezclar. Dejar en reposo durante 20 minutos, transcurrido el tiempo proceder a filtrar utilizando un papel de filtro.
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b) Colocar en tubo A 4ml de solución de sacarosa 2% estéril y adicionar 1ml del filtrado.
c) Colocar en tubo B 4ml de solución de sacarosa 2% estéril y adicionar 1ml de agua destilada.
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d) Colocar en tubo C 4ml de agua destilada estéril y adicionar 1ml del filtrado.
e) Incubar en una estufa los tres tubos a 37C durante 2 horas.
f) Tomar 1ml de cada tubo y agregar el reactivo de Benedict. calentar ligeramente los tubos en la llama del mechero y observar el cambio de coloración.
TUBO A
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TUBO B
TUBO C
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RESULTADOS
Tubo Nº1
Observó una coloración marrón. (+ + + +)
El fundamento de esta reacción radica en que en un medio alcalino, el ion cúprico (otorgado por el sulfato cúprico) es capaz de reducirse por efecto del grupo aldehído del azúcar (CHO) a su forma de Cu+. Este nuevo ion se observa como un precipitado rojo ladrillo correspondiente al óxido cuproso (Cu2O). El medio alcalino otorgado por el NaOH presente en el reactivo de Benedict facilita que el azúcar esté de forma lineal, puesto que el azúcar en solución forma un anillo de piranósico o furanósico. Una vez que el azúcar está lineal, su grupo aldehído puede reaccionar con el ion cúprico en solución. En estos ensayos es posible observar que la fructosa (una cetopentosa) es capaz de dar positivo. Esto ocurre por las condiciones en que se realiza la prueba: en un medio alcalino caliente esta cetohexosa se tautomeriza (pasando por un intermediario enólico) a glucosa (que es capaz de reducir al ion cúprico).
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Tubo
Nº2
Observó una coloración Verde (+)
Los disacáridos como la sacarosa (enlace α(1 → 2)O) y la trehalosa (enlace α(1→1)O), no dan positivo puesto que sus OH anoméricos están siendo utilizados en el enlace glucosídico
Tubo Nº3 Observó una coloración azul.
(-)
DISCUSIÓN DE RESULTADOS
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La práctica tiene como finalidad la estimación de la actividad invertasa y específica del extracto de levadura de Saccharomyces cerevisiae, observándose el cambio color desde azul hasta marrón.
Como aspectos importantes a recordar de la práctica son:
El cloroformo permite la extracción de las enzimas de la levadura Saccharomyces cerevisiae que van actuar sobre el azúcar sacarosa.
La glucosa es un agente reductor y el sulfato de cobre (SO 4Cu) es una agente oxidante.
El azúcar sacarosa es hidrolizado en glucosa y fructosa.
La reacción química se potencia con el calentamiento y con el carbonato de sodio (CO3Na).
CONCLUSIONES
El primer tubo dió una coloración marrón, porque la enzima hidroliza la sacarosa que van a dar la glucosa y fructosa; estos reccionan con el reactivo de Benedict.
En el segundo reactivo da una coloración azul, porque el reactivo Benedict no reacciona con ningún sustrato.
En el tercer tubo da una coloración verde, porque no se da una reacción.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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http://apuntesdebioquimica.tripod.com/id6.html
http://webdelprofesor.ula.ve/farmacia/gmendez/manuales %20PDF/EXPERIMENTO%207%20INVERTASA%2006-04.pdf
http://www.medvet.una.ac.cr/carrera/mva505_Practica2.pdf
http://es.wikipedia.org/wiki/Reacci%C3%B3n_de_Benedict
http://pr27.quiminet.com/enzima%2Binvertasa.htm
http://www.espatentes.com/pdf/2251738_t3.pdf
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