25 de Mayo de 2018
Interpretación del espectro de absorción de clorofila. Alejandra Villa Calderón Laboratorio de Física Contemporá Contemporánea nea II, Facultad Facultad de Ciencias Ciencias , Universidad Nacional Autónoma de México.
Resumen- Mediante el uso de un espectrofotómetro UV-Visible se midió la transmitancia de pigmentos fotosintéticos en una disolución haciendo un barrido desde 410 nm a 692 nm. Dichos pigmentos fueron extr extra aído ídos en base base a un proc proced edim imie ient nto o quími uímico co usand sando o eta etanol al 80% y hoja hojass de espi espin naca aca. Y se calc calcu uló la abso absorb rban anci cia a para para obte obtene nerr el espe espect ctro ro de abso absorc rció ión. n. Logr Logran ando do dist distin ingu guir ir los los tres tres prin princi cipa pale less pigm pigmen ento toss implicados en el proceso de fotosíntesis y una zona de emisión en longitudes de onda entre el verde y amarillo ( 520-562 nm). Palabras clave: pigmento, clorofila, fotosíntesis, cromóforos, teoría orbital molecular.
I.
INTRODUCCIÓN
La luz vis isiible rep eprres eseenta una pequeña part rtee del ampli lio o ra ran ngo de rad adiiac aciión co con ntinua ll llaamado es esp pec ecttro electromagnético. En este espectro toda la radiación viaja como ondas. La franja del espectro elec el ectr trom omag agné néti tico co co con n lo long ngit itud ud de on onda da en entr tree 38 380 0 y 76 760 0 nm (n (nan anóm ómet etro ros) s) se ll llam amaa es espe pect ctro ro vi visi sibl ble, e, ya qu quee loss human lo ano os pueden verlo lo.. El espect ctrro visi sib ble incluye todos los colores del ar arcco iri riss; el vio iollet etaa tiene la longitud de onda más corta, y el rojo la más larga. La luz está compuesta de pequeñas partículas, o paquetes de energía, llamados fotones. La energía de un fotón es inversamente proporcional a su longitud de onda. Cuando Cuan do una mo molé lécu cula la ab abso sorb rbee un fo fotó tón n de en ener erg gía lu lumi min nos osa, a, uno de su suss el elec ectr tro one ness que ued da en ener erg giz izad ado, o, lo que significa que el electrón se transfiere de un orbital atómico de baja energía a otro orbital de alta ener en erg gía más al aleeja jad do del núcle leo o at ató ómico co.. Entonces es,, la molécu culla puede se seg guir una de las dos vías que se muestran en la figura 1. En la fo fottosíntesi siss, los el eleect ctrrones exci cittad ado os son captura rad dos por moléculas aceptoras. En la fotosíntesis, la energía solar se convierte en energía química mediante organismos fotosintéticos. En la foto fo tosí sínt ntes esis is lo loss pi pigm gmen ento toss ab abso sorb rben en só sólo lo lo long ngit itud udes es de on onda da esp speecí cíffic icaas de la luz visib iblle, y re refflej ejaan otras, est sto o se conoce como espectro de absorción . Los pig Los igme men nto toss fo foto tosi sin nté téti tico coss so son n mo molé lécu cula lass qu quee co con nti tien enen en crom cr omóf ófor oros os co como mo cl clor orof ofil ilas as,, xa xant ntof ofil ilas as,, ca caro rote teno noid ides es,, en entr tree otro ot ros. s. Lo Loss pi pigm gmen ento toss má máss im impo port rtan ante tess en la fo foto tosí sínt ntes esis is so son: n: clorofila a, clorofila b y -carotenos. -carotenos.
Figura 1. Vias de desexitación. 1
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La clorofila (figura 2) es el pigmento verde común a todas las células fotosintéticas, está formada por cuatro anillos pirrólicos cuya función es absorber luz, debido al sistema de dobles enlaces conjugados que lo conforman, estos pigmentos pueden absorber luz visible, la cola de fitol; mantiene la clorofila integrada a la membrana fotosintética. Existen tipos diferentes de clorofila. Por otro lado, otra de las propiedades menos conocidas de la Clorofila es su comportamiento frente a la Luz Ultravioleta. Frente a ella, la Clorofila sufre un proceso de fluorescencia que hace que aparezca ante nuestros ojos de color rojo.
Cuando un haz de radiación monocromática de una determinada longitud de onda atraviesa una capa de disolución conteniendo una especie absorbente, la potencia (energía por unidad de tiempo y unidad de área) del haz incidente I0 se atenúa, disminuyendo hasta I (Figura 3). Se define la transmitancia T, como la fracción de radiación incidente que consigue atravesar la muestra. Varía de 0 a 1 y puede expresarse también como porcentaje: T = I I ; T = I I × 100
Figura 2. Estructura de la molécula de clorofila.
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Un parámetro de mayor utilidad práctica, es la absorbancia, A, definida como: A =− log (T ) ; A =− log (T /100) La absorbancia está relacionada con la concentración de la sustancia, c, por la ley de Lambert-Beer, que se resume con la ecuación: A = α l c donde c se expresa en mol/L, l es la longitud del camino óptico (anchura de la celda que contiene la disolución de la sustancia) y se expresa en cm, y α es la absortividad molar, propiedad característica de cada sustancia correspondiente a la cantidad de radiación que absorbe a una longitud de onda determinada por unidad de concentración, siendo sus unidades L mol-1cm-1
Figura 3. Atenuación de la intensidad de una luz incidente al atravesar un medio absorbente.
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II. DESARROLLO EXPERIMENTAL Se inició con el proceso de extracción de los pigmentos fotosintéticos de las diferentes especies de plantas seleccionadas (ver tabla 1), primero se cortaron las hojas muy finamente con un cuchillo y se pesaron dentro del tubo de ensayo donde se preparó la solución, se agregaron 10 ml de etanol al 80% y se cubrió el tubo para poner a baño maría la solución, se tuvo 20 min a una temperatura de 80°C usando un soporte universal para sostener los tubos de ensayo y evitar que tocaran de forma directa el fondo del vaso de precipitado en que se colocaron para el baño maría (el contacto directo con el calor de la parrilla puede llegar a inducir degradación de la materia prima, ya que se consume el solvente y no hay líquido que proteja las hojas). Una vez obtenida la solución con el pigmento, filtramos para eliminar la presencia de partículas, después colocamos las soluciones bajo luz ultravioleta para observar la fluorescencia que presentan los pigmentos fotosintéticos como la clorofila y asegurarnos que efectivamente lo que obtuvimos es clorofila o algún otro pigmento implicado en el proceso de fotosíntesis de las plantas. Posteriormente agregamos más etanol al 80% (10 ml) para diluir la solución y evitar que el pigmento altamente concentrado provoque una saturación al momento de medir transmitancia. Una vez diluido, usamos el espectrofotómetro para medir la transmitancia a partir de 410 nm a 692 nm con pasos de 2 nm, calibrando con etanol como la muestra blanco a cada cambio de longitud de onda. En la figura 4 se muestran imágenes que ilustran el proceso experimental redactado.
Tabla 1. En esta tabla se enlistan las distintas plantas y la masa usada de cada una, así como el volumen de solvente.
Figura 4. En esta imagen se ilustra el proceso de extracción de los pigmentos y el espectrofotómetro usado para las mediciones. (A)Se cortó y pesó la cantidad deseada de hojas. (B)Se disolvió con etanol al 80% y se cubrió con papel aluminio. (C)Se llevaron las soluciones a baño maría por 20 min a 80°C. (D)Un poco de extracto de pigmentos de la espinaca y la celda usada para contener la solución dentro del espectrofotómetro. (E) Espectrofotómetro UV-Visible Spectronic 21D.
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III. ANÁLISIS Y RESULTADOS Una vez terminada nuestra extracción, colocamos la disolución bajo una lámpara de luz UV, porque como ya se mencionó; la clorofila absorbe la radiación energética procedente de la luz ultravioleta y pasa a un estado excitado liberando el exceso de energía en forma de un fotón en la zona roja del espectro. Así que observar su fluorescencia es un buen método para visualizar si lo que extrajimos, realmente contiene clorofila. En la figura 5, se puede apreciar la fluorescencia de la extracción obtenida de tres plantas distintas.
Figura 5. Imágenes obtenidas la fluorescencia generada por la presencia de clorofila.
En las imágenes de la figura 5, se aprecia claramente el tono rojo característico el cual esperábamos observar por la presencia de clorofilas en nuestra disolución. Se realizaron medidas de la transmitancia de la disolución de espinaca para analizar el analito, comenzando a medir desde 410 a 692 nm, con pasos de 2 nm. Una vez obtenidos los datos se calculó la absorbancia y se analizaron los datos usando Origin 2017. Se gráfico absorbancia contra longitud de onda y se obtuvo la primer derivada de la función para obtener los puntos críticos. En la gráfica 1, podemos observar ciertos picos de máxima absorción los cuales se registran en la tabla 2, buscando asociarlos a alguno de los tres pigmentos más importantes en el proceso de fotosíntesis. Se observa una zona de mínima absorción, a la que llamamos zona de emisión, y se encuentra en el rango de 520-562 nm dichos valores corresponden a longitudes de onda del verde-amarillo del espectro visible. En la gráfica 2, algunos de los máximos encontrados se pueden asociar a la absorción característica de clorofila a, clorofila b y carotenoides. Sin embargo son más los pigmento presentes en las plantas en particular en el proceso de fotosíntesis que permiten captar la luz visible, son muchos, y dichos puntos
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pueden estar asociados a otros pigmentos. En el caso de los puntos de inflexión tenemos probables picos convulsionados los cuales pueden estar también asociados a la presencia de otros pigmentos, de los cuales desconocemos su absorción máxima.
Gráfica 1. Espectro de absorción obtenido de la extracción de la espinaca.
Gráfica 2. Puntos críticos de la función asociada al espectro de absorción, obtenidos al calcular la primera derivada.
Tabla 2. Máximos observados en el espectro de absorción, asociados a uno de los tres pigmentos más importantes en la fotosíntesis.
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De acuerdo con la ley de Lambert - Beer, la intensidad está asociada a la concentración de las partículas o grupos funcionales implicados en la absorción de la molécula, solo después de la zona de emisión es apreciable una mayor concentración de clorofila a, ya que la intensidad para la absorción de la clorofila b es muy baja a comparación de la a. La única diferencia entre la clorofila a y b es el radical que presentan, por lo que puedo sugerir que el grupo funcional metil (en clorofila a) y el grupo funcional aldehído (en clorofila b) son los cromóforos responsables de la absorción de la luz para esas longitudes de onda en particular que presentan de acuerdo el espectro obtenido.
VI. CONCLUSIONES ●
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Se logró sintetizar de forma correcta pigmentos de clorofila al observar una clara fluorescencia en rojo al estimular las moléculas con luz UV. Se lograron distinguir los tres principales pigmentos implicados en el proceso de fotosíntesis. La espinaca presenta una zona de emisión en longitudes de onda entre el verde y amarillo (520-562 nm).
REFERENCIAS 1) http://lucyzo.blogspot.mx/2017/10/fotosintesis.html 2) Lucas Hernández Hernández, Claudio González Pérez, Introducción al análisis instrumental, Ed. Ariel, 2002. 3) Harold Eric Avery, D. J. Shaw, Cálculos básicos en química física, Reverte, 1987. 4) G. E. W. Wolstenholme, David W. FitzSimons, Chlorophyll Organization and Energy Transfer in Photosynthesis, John Wiley & Sons, Sep 16, 2009. 5) Ralph C. Dougherty, Teoría de las perturbaciones de los orbitales moleculares (PMO) en química orgánica, Reverte, 1980.
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