Laboratorio 1. Espectrofometría: Espectros de absorción y cuantificación espectrofotométrica de biomoléculas OBJETIO! Establecer el espectro de absorción UV-Vis UV-Vis para clorofila para determinar su λ max Aplicar la ley de Lambert-Beer y realizar una recta de calibrado para clorofila Calcular grficamente el !alor del coeficiente de extinción molar" molar" #eterminación cuantitati!a de clorofila en una muestra problema
I"T#O$%&&I'"
energ&tico basal o fundamental' E /' a un estado de mayor mayor energ% energ%aa +estad +estadoo excita excitado do' ' E 0" 1 sólo se absorber la energ%a $ue permita el salto al estado excitado" Cada mol&cula tiene una serie de estados excitados +o bandas $ue la distingue del resto de mol&culas" Como consecuencia' la absorción $ue a distintas longitudes de onda presenta una mol&cula -esto es' su espectro de absorción- constituye una se2a se2a de iden identitida dadd de la mism misma" a" 3or 3or (lti (ltimo mo'' la mol& mol&cu cula la en form formaa excit excitad adaa liber liberaa la ener energ% g%aa absorbida .asta el estado energ&tico fundamental"
El estu estuddio a ni!el i!el bio$ io$u%mic %micoo de cua cual$u l$uier ier biomo biomol&c l&cula ula re$ui re$uiere ere la utiliza utilizació ciónn de t&cnic t&cnicas as anal%ticas $ue permitan su determinación cualitati!a y cuantitati!a' as% como su caracterización f%sico$u%m $u%mic icaa y biol biológ ógic ica" a" Uno Uno de los los m&to m&todo doss ms ms senc sencilillo los' s' acce accesib sible les' s' (til (tiles es y util utiliza izado doss es la espect espectros roscop cop%a' %a' en genera general'l' y la espect espectros roscop cop%a %a ultr ultra! a!io iole leta ta-! -!is isib ible le'' en part particu icula larr" )e pued pueden en identificar y cuantificar biomol&culas en solución y en muestras biológicas' con el empleo de reacti!os espec% espec%fic ficos os $ue $ue reaccio reacciona nann con el compue compuesto sto a analizar y forman un producto coloreado $ue permite detectarlo en muestras comple*as" El fundamento de la espectroscop%a se debe a la cap capacid cidad de las las mol mol&cu &culas las para ara abso bsorbe rber radiaciones' entre ellas las radiaciones dentro del espectro UV-!isible" Las longitudes de onda de las radiaciones $ue una mol&cula puede absorber y la eficiencia con la $ue se absorben dependen de la estructura atómica y de las condiciones del medio +p,' +p,' temp temper erat atur ura' a' fuer fuerza za ióni iónica ca'' cons consta tant ntee diel&ctrica' por lo $ue dic.a t&cnica constituye un !ali !alios osoo inst instru rum mento ento para para la deter etermi mina naci ción ón y caracterización de biomol&culas"
(i)ura 1" $ia)rama de ni*eles de ener)ía en una molécula " La absorción de energ%a luminosa .ace $ue la mol&cula pase desde un estado fundamental +E/ a otro otro exci excitad tadoo +E0" 3osteriorment 3osteriormentee la mol&cula rela*a su energ%a mediante distintos mecanismos +!ibración' rotación' etc"
En espectroscopia el t&rmino luz no sólo se aplica a la forma !isible de radiación electromagn&tica' sino tambi&n a las formas UV e 45' $ue son in!isibles" En espectrofo espectrofotome tometr%a tr%a de absorban absorbancia cia se utilizan utilizan las regiones del ultra!ioleta +UV cercano' de /67-899 nm y el !isible +899-:;9 + 899-:;9 nm"
Las mol&culas pueden absorber energ%a luminosa y almace almacenar narla la en forma forma de energ% energ%aa intern interna" a" Esto Esto permite poner en funcionamiento ciclos !itales como la fotos%ntesis en plantas y bacterias" Cuando la luz +considerada como energ%a es absorbida por una mol& mol&cu cula la se orig origin inaa un salt saltoo desd desdee un esta estado do 1
La re)ión % se define como el rango de longitudes
La transmitancia +T de una sustancia en solución es la relación entre la cantidad de luz transmitida $ue llega al detector una !ez $ue .a atra!esado la muestra' 4t y la cantidad de luz $ue incidió sobre ella' 4o' y se representa normalmente en tanto por ciento?
de onda de /67 a 899 nm" Es una región de energ%a muy alta" 3ro!oca da2o al o*o .umano as% como $uemadura com(n" Los compuestos con dobles enlaces aislados' triples enlaces' enlaces pept%dicos' sistemas aromticos' grupos carbonilos y otros .eterotomos tienen su mxima absorbancia en la región UV' por lo $ue &sta es muy importante para la determinación cualitati!a y cuantitati!a de compuestos orgnicos" #i!ersos factores -como p,' concentración de sal y el disol!ente- $ue alteran la carga de las mol&culas' pro!ocan desplazamientos de los espectros UV"
, T - ItIo / 100 La transmitancia nos da una medida f%sica de la relación de intensidad incidente y transmitida al pasar por la muestra" La relación entre y la concentración no es lineal' pero asume una relación logar%tmica in!ersa" La absorbancia ++ es un concepto ms relacionado con la muestra puesto $ue nos indica la cantidad de luz absorbida por la misma' y se define como el logaritmo de /D' en consecuencia? + - lo)
La fuente de radiación ultra!ioleta es una lmpara de deuterio" En la re)ión *isible apreciamos el color !isible de una solución y $ue corresponde a las longitudes de onda de luz $ue transmite' no $ue absorbe" El color $ue absorbe es el complementario del color $ue transmite"
1T - lo) T - lo) ItIo Cuando la intensidad incidente y transmitida son iguales +4o @ 4t' la transmitancia es del /99 e indica $ue la muestra no absorbe a una determinada longitud de onda' y entonces A !ale log / @ 9"
3or tanto' para realizar mediciones de absorción es necesario utilizar la longitud de onda en la $ue absorbe luz la solución coloreada"
La cantidad de luz absorbida depender de la distancia $ue atra!iesa la luz a tra!&s de la solución del cromóforo y de la concentración de &ste .
La fuente de radiación !isible suele ser una lmpara de tungsteno y no proporciona suficiente energ%a por deba*o de <09 nm"
1.2 Ley de LambertBeer
longitud de onda color de luz $ue se color de luz $ue se aproximada absorbe refle*a o !e
Esta ley expresa la relación entre absorbancia de luz monocromtica +de longitud de onda fi*a y concentración de un cromóforo en solución?
<69 - 8<7 Violeta Amarillo !erdoso 8<7 - 869 Azul Amarillo 869 - 7;9 Verde 5o*o 7;9 - 767 Amarillo Azul 767 - =79 >aran*a Azul !erdoso =79 - :;9 5o*o Verde azulado
+ - lo) IIo - 3c3l La absorbancia de una solución es directamente proporcional a su concentración Fa mayor n(mero de mol&culas mayor interacción de la luz con ellas-G tambi&n depende de la distancia $ue recorre la luz por la solución Fa igual concentración' cuanto mayor distancia recorre la luz por la muestra ms mol&culas se encontrar-G y por (ltimo' depende de ' una constante de proporcionalidad -denominada coeficiente de extinción +en algunas referencias se mane*a con el nombre de absorti!idad- $ue es espec%fica de cada cromóforo" Como A es adimensional' las dimensiones de dependen de las de c +concentración y l +anc.o de la celda $ue
1.1. Transmitancia y +bsorbancia Cuando un rayo de luz de una determinada longitud de onda de intensidad 4 o incide perpendicularmente sobre una disolución de un compuesto $u%mico $ue absorbe luz o cromóforo' el compuesto absorber una parte de la radiación incidente +4 a y de*ar pasar el resto +4t' de forma $ue se cumple? 4 o @ 4a 4t
2
contiene la muestra" La segunda magnitud +l se expresa siempre en cm mientras $ue la primera +c se .ace' siempre $ue sea posible' en H' con lo $ue las dimensiones de resultan ser H -/Icm-/" Este coeficiente as% expresado' en t&rminos de unidades de concentración molar +o un subm(ltiplo apropiado' se denomina coeficiente de extinción molar +H" Cuando' por desconocerse el peso molecular del soluto' la concentración de la disolución se expresa en otras unidades distintas de H' por e*emplo gDL' las dimensiones de resultan ser distintas' por e*emplo g -/ILIcm-/' y al coeficiente as% expresado se denomina coeficiente de extinción espec%fico +s"
$ue se !a a realizar la medida" ,ay espectrofotómetros de un solo .az +con una sola celdilla para alo*ar la cubeta con la muestra y de doble .az +con dos celdillas para dos cubetasG en nuestro caso se traba*ar con los de un solo .az" )e mide primero la absorbancia del disol!ente +conocido como blanco y al $ue se le asigna el !alor de cero mediante el a*uste del mando' de forma $ue la intensidad incidente y transmitida sean iguales +4o @ 4t' y por tanto la absorbancia es cero" A continuación se pone en la celdilla la cubeta con la muestra y se lee la absorbancia de &sta"
1.6 Obtención de un espectro de absorción La ley de Lambert-Beer se cumple para soluciones diluidasG para !alores de c altos' !ar%a con la concentración' debido a fenómenos de dispersión de la luz' agregación de mol&culas' cambios del medio' etc"
El espectro de absorción es una representación grfica $ue indica cantidad de luz absorbida + a diferentes !alores de λ" A partir de di!ersas soluciones diluidas de un compuesto +la concentración mxima de traba*o depende de cada sustancia' cuya absorbancia mxima entra dentro del rango de medida del espectrofotómetro +se recomienda una absorbancia no mayor a 9";' pero en algunos casos se encuentra comportamientos lineales .asta /"0' se !er el !alor de absorbancia a diferentes longitudes de onda frente a un blanco $ue contenga el disol!ente de la solución de la muestra a caracterizar" A partir del espectro de absorción de las soluciones diluidas se obtendr el !alor de λ de traba*o en donde se presenta linealidad entre las diferentes absorbancias de las soluciones diluidas' sin $ue se sobrepasa el rango de medida del espectrofotómetro +En algunos casos el λmax a determinada concentración sobrepasa los l%mites recomendados del espectrofotómetro y no se toma en cuenta al menos se obser!e una correlación lineal" #ic.o λ se utilizar a la .ora de .acer determinaciones cualitati!as y cuantitati!as del compuesto"
1.4. Instrumentación para la medición de absorbancias de la lu5 *isible y ultra*ioleta: espectrofotómetro %*isible La medición de absorbancia de la luz por las mol&culas se realiza en unos aparatos llamados espectrofotómetros" Aun$ue pueden !ariar en dise2o' en especial con la incorporación de ordenadores para el anlisis de datos' todos los espectrofotómetros constan' seg(n se indica en la figura' de? /" Una fuente de energ%a radiante? lmpara de deuterio y tungsteno" 0" Un monocromador para la selección de radiaciones de una determinada longitud de onda? filtros' prismas' redes de difracción" <" Un compartimento donde se alo*a un recipiente transparente +cubetas o tubos $ue contenga la muestra 3ueden ser de !idrio' cuarzo o plstico transparente" 3ara medir en UV se deben usar las de cuarzo o s%lice fundido o plstico transparente' por$ue el !idrio no transmite la radiación UV" 8" Un detector de luz y un amplificador con!ertidor de las se2ales luminosas en se2ales el&ctricas" 7" Un registrador o sistema de lectura de datos"
El espectro de absorción de un cromóforo depende' fundamentalmente' de la estructura $u%mica de la mol&cula" >o obstante' .ay una gran cantidad de factores $ue originan !ariaciones en los !alores de λ max y H' entre los $ue se incluye el p,' la polaridad del sol!ente o
#esde el punto de !ista operati!o' el primer paso es seleccionar la fuente de luz y longitud de onda a la 3
mol&culas !ecinas y la orientación de los cromóforos !ecinosG y cada uno afecta de forma particular" 3or e*emplo' !ariaciones originadas por cambios de p, son debidas al efecto de &ste sobre la ionización del compuesto"
/" omar el patrón de clorofila +pastilla y macerarlo finamente con la ayuda del mortero" 0" 3reparar una solución patrón de clorofila de 7 mgDmL en una mezcla de etanol 69 y &ter de et%lico /9" <" )i no se disuel!e completamente el sólido lle!ar a cabo una centrifugación y tomar el sobrenadante" 8" Con el patrón montar una al%cuota en una celda de cuarzo 7" Lle!ar a cabo un barrido del espectro UV-Vis con la ayuda del espectrofotómetro =" En caso de no obtener pico+s definido+s diluir la muestra con la mezcla de etanol-&ter .asta determinar la λmax :" Una !ez determinada la λmax realizar la cur!a de calibración"
1.7 &ur*as de calibración 3ara obtener una cur!a de calibración de un compuesto se preparan soluciones de diferentes concentraciones del mismo' determinndose para cada una de ellas el !alor de absorbancia a λ max" Estos !alores de absorbancia para determinadas λ se representan en el e*e de las ordenadas +e*e de y y los de concentración en el e*e de abcisas +e*e de x" )e obser!ar $ue' a ba*as concentraciones' el aumento de concentración se corresponde con un incremento lineal en la absorbancia +zona de cumplimiento de la ley de Lambert-Beer" A concentraciones altas la linealidad se pierde y se obser!a $ue la l%nea se aplana' por lo $ue las medidas son poco fiables"
&ur*a de calibración para clorofila /" Con el patrón preparado en la primera parte preparar = diluciones de /9 o 07 mL de 0' 8' ;' /0' /= y 09 !eces" 0" #eterminar la absorbancia en el espectrofotómetro para cada dilución" <" 5ealizar la cur!a de calibración y determinar su coeficiente de correlación"
La representación de Lambert-Beer' A @ IcIl' nos permitir calcular el !alor del coeficiente de extinción molar' $ue corresponde a la pendiente de la recta"
8+TE#I+L 9 #E+&TIO! $eterminación de &lorofila en la muestra problema
Espectrofotómetro" Agitador de tubos de ensayo" Balanza" Jradillas con /0 tubos de ensayo" Kuego de pipetas graduadas +9"7' /"9' 0"9' 7"9' /9"9 y 07"9 ml" Kuego de micropipetas 3robetas /99 ml Vaso de precipitado /99 mL : Balones aforados de 07 mL Agitador de !idrio Hortero Celdas de cuarzo para medir en el espectrofotómetro"
/" 0" <" 8" 7"
3esar 099 g de acelga fresca Cortarla en trozos muy pe$ue2os #e*ar en estufa < . a 89C 3esar la acelga y determinar el de .umedad Colocar el material seco dentro de los dedales de sox.let y lle!ar a cabo la extracción con una mezcla de etanol-&ter et%lico +6?/ durante < ." +tener en cuenta el !olumen de sol!ente empleado por peso de muestra seca" =" 5etirar el extracto y descartar el material sólido" :" )ecar completamente el extracto' conociendo el peso de la capsula empleada y el peso de la muestra despu&s de secada" ;" 3reparar una solución de / mgDmL en la mezcla etanol-&ter et%lico para .acer la determinación de clorofila en las condiciones $ue se realizó la cur!a de calibración"
#O&E$I8IE"TO Espectros de absorción %is para clorofila para determinar su ; ma/ 4
&%E!TIO"+#IO
Calcular el coeficiente de extinción molar' "
/" El coeficiente de extinción molar de cierto soluto es de 0"
:" )e sabe $ue las sales de VR 0 tienen un coeficiente de extinción molar de /8999 a su longitud de onda de mxima absorción" )i se utiliza celda de 6"99 cm' calcular cuntos mgDml de VR 0 debern estar presentes para producir una absorbancia de 9"=:<" +3m VR 0 @ 6/"680"
0" )e sabe $ue una sustancia tiene un coeficiente de extinción molar de /0999 a su longitud de onda de mxima absorción" Calcular $ue molaridad de esta sustancia" M3odr medirse en un espectrofotómetro' si se desea $ue la lectura de absorbancia sea de 9";:9' en una cubeta de /"99 cmN"
;" El coeficiente de extinción molar + del cido benzoico en metanol es aproximadamente /;79 a 0;7nm" Mcul ser la mxima concentración de cido benzoico' en gDml $ue puede usarse en una celda de /"99 cm para $ue la absorbancia no exceda de 9"/9
<" El porcenta*e de transmitancia de una solución acuosa de fumarato de sodio a 0=9 nm y 07OC' es de /:"0 para una solución =x/9 -8 H" en una celda de /"99 cm" Calcular la absorbancia y el coeficiente de extinción molar correspondiente"
6" Una solución de permanganato de potasio de concentración C tiene una transmitancia de :9"9 en una celda de /"99 cm"' a una determinada longitud de onda" )i se dobla la concentración' calcular" a" El de b" La absorbancia y la concentración de SHnR8 para dar :9"9 de en una celda de /9"99 cm de paso de luz"
8" Una solución de concentración C de una sustancia coloreada tiene un de ;8"9 si la concentración se cuadriplica en es de 8="0" #emostrar $ue la solución obedece la ley de Lambert-Beer y calcular el para una concentración 0C"
/9" Una muestra de <"999 g $ue contiene manganeso se determinó por espectrofotometr%a' se preparó un extracto de :79 ml de la solución de concentración desconocida' se tomó una al%cuota de 0 ml y se diluyó en un balón aforado de 09 ml" Luego' para poder interpolar la cur!a estndar de manganeso a 787 nm de la (ltima solución' se tomó una al%cuota y se diluyó en una solución /?<" La transmitancia de la solución medida en un espesor de / cm es de <9 " )i el coeficiente de extinción molar es 0099 LDmol"cm' determine? a de Hn en la muestra b mgDSg de Hn en la muestra"
7" Cuando se analiza una muestra $ue contiene .ierro +44 por el m&todo del P-PQ bipiridilo se obtiene una transmitancia de 7<"7 contra un blanco de reacti!os' en una cubeta de /"99cm" )i el coeficiente de extinción molar del P-PQ bipiridilo ferroso es de ;"679" Mcul ser la concentración del .ierro en la muestra' en molesDlitroN =" Utilizando una cubeta de absorción de /"99 cm' se determinó la transmitancia de la luz de 8=< nm +8=< A para una solución de bromo en tetracloruro de carbono' encontrndose los siguientes resultados?
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