Espectro de Absorci´ on on de la Clorofila (Presentado el 11 de abril del 2015)
Resumen En este experimento el espectro de la clorofila α y la clorofila β β de espinaca se estudiaron utilizando un espectrofot´ ometro (spectronic 21D). La clorofila α ometro clorofila α y y la clorofila β clorofila β se se extrajeron de la espinaca esp inaca utilizando utiliz ando ´eter eter de d e petr´ p etr´oleo, ole o, alcohol alco hol met´ılico ıli co y ´eter ete r et e t´ılico. ıli co. La clorofil clor ofilaa α se α se obtuvo de una soluci´on on de ´eter eter de d e petroleo p etroleo y la clorofila β se se obtuvo en una soluci´on on de ´eter et er et´ılico ıl ico.. Los L os picos pi cos del espectro de absorci´ absorci´ on que se obtuvo para la clorofila α fueron de 430nm on 430nm y y 620nm 620nm((±1nm) nm) y los picos del espectro de absorci´on on para la clorofila β clorofila β fueron fueron de 450nm 450nm y y 610nm 610nm(+ (+// − 1nm). nm). ´ 1. INTRODUC INTRODUCCI CION
La clorofila es un pigmento de las plantas, que les proporciona su color verde y que absorbe la luz necesaria para la fotos´ıntesis. ıntesis. La L a clorofila clorofil a absorbe absorb e principalmente princip almente luz lu z violeta violet a roja y azul y refleja luz verde. La abundancia de clorofila en hojas y su ocasional presencia en otros tejidos vegetales es la causa de que esas partes de las plantas aparezcan verdes, pero en algunas hojas la clorofila es enmascarada por otros pigmentos. La extracci´ on y reconocimiento de estos pigmentos es interesante on para el estudio y conocimiento de sus propiedades.
Los colores de los carotenoides son familiares por los colores en la ca´ ca´ıda de las hojas. ho jas. Cuando las ho jas pierden su clorofila, los carotenoides m´as as persistentes dan los agrada agradable bless rojos, rojos, ama amaril rillos los y naranj naranjas as del follaje en oto˜ no. El beta-caroteno es el m´as no. as importante de los carotenoides. El licopeno, el color de los tomates, tomate s, tambi´en en es un carotenoide. caroteno ide. ·
El beta caroteno es el m´as as importante de los carotenoides que sirven como pigmentos accesorios en la l a ffotos´ otos´ıntesis. ıntesis. La medici´on on de la absorci´on on de estos pigmentos como funci´on on de la producci´on on fotosint´ etica, etica, deja claro que las clorofilas son las m´ as importantes, pero el beta caroteno contribuas ye de manera significativa. El beta caroteno da el color a las zanahorias,y tambi´en en a las l as calabazas c alabazas,, los l os pl´ p l´atanos atanos y aguacates. Tambi´ ambi´ en en aparece aparece en los colores colores de las hojas en oto˜ no. no.
Los Pigmentos vegetales, que se encuentran en los cloroplastos, plastos , son mol´eculas eculas qu´ qu´ımicas que reflejan o transmiten transm iten la luz visible, o hacen ambas cosas a la vez. El color de un pigmento depende de la absorci´on on selectiva de ciertas longitudes de onda de la luz y de la reflexi´on de otras. Constituyen el sustrato fisicoqu´ fisicoqu´ımico donde se asienta el proceso pro ceso fotosint fot osint´´etico. eti co. Hay diversas clases de pigmentos [1]: 1- Clorofilas: Clorofilas: ·
Clorofila-α Clorofila-α:
Beta-caroteno:
·
Licopeno: El licopen licopenoo es conocid conocidoo por proporc proporcion ionar ar el color rojo al tomate.
La clorofila-α clorofila-α es el pigmento principal de la fotos´ fotos´ıntesis en las la s plan pl anta tas, s, pero per o el rang ra ngo o de abso ab sorc rci´ i´ o n de la luz Es el pigmento p igmento principa p rincipall para la fotos fot os´´ıntesis en es ampliado por la clorofila-β clorofila- β , el beta-caroteno y otros las plantas. Tiene la composici´on on C 55 55 H 72 72 O5 N 4 M g . pigmentos accesorios. Exhibe un color visual verde-hierba, y los picos de absorci´on on est´an an a 430nm 430nm y y 662nm 662nm.. Se da en La clorofila, es el pigmento que da el color verde a los todos los organismos fotosint´ eticos, eticos, excepto las vegetales y que se encarga de absorber la luz necesaria para bacteri bac terias as fotosint´ foto sint´eticas. eti cas. realizar la fotos´ fotos´ıntesis, proceso que posibilita la s´ıntesis de sustancias org´anicas anicas a partir de las inorg´anicas anicas (CO (CO2, 2, Clorofila-β Clorofila-β : H 2O y sales minerales), mediante la transformaci´on on de la energ´ ene rg´ıa ıa lumi lu minos nosaa en energ´ ene rg´ıa ıa qu´ımica ım ica.. Tiene la composici´on on C 55 55 H 72 72 O6 N 4 M g , que se diferencia de la clorofila-α clorofila- α, en la sustituci´ on on de un 2. PIGMENTOS VEGETALES VEGETALES grupo metilo, por un C un C H O. Presenta un color visual verde-azulado, y los picos de absorci´on on est´an an a 453nm 453nm y y 642nm 642nm.. Se da en todas las plantas, las Los colore coloress que presen presentan tan los veget vegetale aless son debido debidoss a algas verdes y algunas procariotas. En las plantas unos compuestos qu´ qu´ımicos llamados pigmentos. El color por lo general, hay aproximadamente la mitad de que que pres presen enta ta un dete determ rmin inad adoo organo o´rgano veget vegetal al depende depende clorofila-β clorofila-β que que de clorofila-α clorofila- α. generalmente del predominio de uno u otro pigmento o la combinaci´ on on de ellos. Adem´as, as, algunos de los pigmentos 2- Carotenoid Carotenoides: es: que condicionan condicionan el color est´ an estrechamente ligados a las an actividades fisiol´ogicas ogicas del propio vegetal[2]. ·
2.2
Espectroscopia UV-Visible
3
FOTOS´ INTESIS
nio general de los colores primarios: verde, amarillo, rojo, azul. Estos colores son conferidos a los vegetales por determinados compuestos qu´ımicos definidos, llamados pigmentos. El color particular que presenta un determinado ´organo vegetal depende generalmente del predominio de uno u otro o la combinaci´ on de ellos. Se debe tener claro que cuando un vegetal presenta un color blanco, es debido a la falta de tales pigmentos. La luz solar que incide sobre las partes en blanco no es absorbida selectivamente como ocurre en las partes coloreadas, sino que es transmitida o reflejada pr´ acticamente sin sufrir modificaci´on.
Figura 1. Estructura qu´ımica de la clorofila-α y clorofila-β . El color verde en los vegetales es debido a la presencia de dos pigmentos estrechamente emparentados llamados clorofila-α y clorofila-β . Se encuentran pr´acticamente en todas las plantas con semilla, helechos, musgos y algas. Tambi´ en aunque aparentemente falten en algunas hojas de color rojo o amarillo, cuando se extraen las otras sustancias colorantes de estas, puede comprobarse incluso all´ı la presencia de las clorofilas, que estaban enmascaradas por los dem´ as pigmentos. Asociados con las clorofilas, existen tambi´en en los cloroplastos dos clases de pigmentos amarillos y amarillo-anaranjados que son los xantofilas y carotenos. 2.1 Pigmentos fotosint´ eticos
Entre todos los caracteres m´as externos de los vegetales, el m´ as notable y caracter´ıstico es probablemente el color. El color no es u ´ nicamente un car´acter llamativo de la vegetaci´ on, sino que, adem´as, algunos de los pigmentos que lo condicionan est´an estrechamente ligados a las actividades fisiol´ ogicas del propio vegetal. Por consiguiente, el estudio de c´omo las plantas viven y se desarrollan requieren el previo conocimiento de los pigmentos vegetales[2].
Las clorofilas. El color verde tan uniformemente presente en los vegetales es debido a la presencia de dos pigmentos estrechamente emparentados llamados clorofila-α y clorofila-β . Se encuentran pr´acticamente en todas las plantas con semilla, helechos, musgos y algas. Pueden formarse en las ra´ıces, tallos, hojas y frutos a condici´ on de que estos ´organos est´en situados por encima del suelo y queden expuestos a la luz. Tambi´ en aunque aparentemente falten en algunas hojas de color rojo o amarillo, cuando se extraen las otras sustancias colorantes de estas, puede comprobarse incluso all´ı la presencia de las clorofilas, que estaban enmascaradas por los dem´as pigmentos. 2.2 Espectroscopia UV-Visible
La espectroscopia UV-Visible explora la absorbancia de una materia con la regi´on espectral electromagn´etica del ultravioleta y visible. Este tipo de espectroscopia es ´util para identificar algunos grupos funcionales de mol´eculas, y adem´as, para determinar el contenido y fuerza de una sustancia. El principio f´ısico que utiliza un espectr´ometro UV-Visible es simplemente la atenuaci´on de luz que esta dada por la transmitancia: T =
I . I 0
(2.1)
donde I es la intensidad del haz que pasa por el material y I 0 es la intensidad del haz original. La absorbancia de un material simplemente esta dada por: A =
− log(T )
= − log
I I 0
(2.2)
El instrumento que se utiliza en la espectroscopia UVVisible es el espectrofot´ometro. El escama com´u n de un espectrofot´ometro se puede observar en la Fig 3. Como se observa en el diagrama, una fuente de tungsteno emite un haz de luz que pasa por un monocromador y una rendija. Despu´es el haz pasa por la muestra y finalmente por un fotodetector, donde es analizada. Muchos de los espectrofot´ ometros pueden medir la absorbancia y la transmitancia de la muestra. Figura 2. Espectro de absorci´on de los pigmentos fotosint´eticos.
3. FOTOS´INTESIS
Es posible encontrar en el reino vegetal todos los matices y combinaciones de colores del espectro, existe un predomi-
La fotos´ıntesis es un proceso en virtud del cual los organismos con clorofila, como las plantas verdes, las algas y 2
4
Figura 3. Esquema b´asico de un espectrofot´ometro. algunas bacterias, capturan energ´ıa en forma de luz y la transforman en energ´ıa qu´ımica. Pr´ acticamente toda la energ´ıa que consume la vida de la bi´ osfera terrestre -la zona del planeta en la cual hay vidaprocede de la fotos´ıntesis. La fotos´ıntesis se realiza en dos etapas: una serie de reacciones que dependen de la luz y son independientes de la temperatura, y otra serie que dependen de la temperatura y son independientes de la luz.
DESARROLLO EXPERIMENTAL
Dicho proceso se desencadena gracias a una energ´ıa almacenada en mol´eculas de AT P que da como resultado el carbohidrato llamado glucosa (C 6 H 12 O6 ), un tipo de compuesto similar al az´ ucar, y mol´eculas de agua como desecho. Despu´ es de la formaci´ on de glucosa, ocurre una secuencia de otras reacciones qu´ımicas que dan lugar a la formaci´on de almid´on y varios carbohidratos m´as. A partir de estos productos, la planta elabora l´ıpidos y prote´ınas necesarios para la formaci´on del tejido vegetal, lo que produce el crecimiento. Cada uno de estos procesos no requiere de la participaci´on de luz ni de la clorofila, y por ende se realiza durante el d´ıa y la noche. Por ejemplo, el almid´on producido se mezcla con el agua presente en las hojas y es absorbido por unos tubitos min´ usculos que existen en el tallo de la planta y, a trav´es de ´estos, es transportado hasta la ra´ız donde se almacena. Este almid´on es utilizado para fabricar celulosa, el principal constituyente de la madera.
La velocidad de la primera etapa, llamada reacci´on lum´ınica, aumenta con la intensidad luminosa (dentro de ciertos l´ımites), pero no con la temperatura. En la segunda etapa, llamada reacci´on en la oscuridad, la velocidad aumenta con la temperatura (dentro de ciertos l´ımites), pero no con la intensidad luminosa. 1- Fase primaria o lum´ınica La fase lum´ınica de la fotos´ıntesis[4] es una etapa en la que se producen reacciones qu´ımicas con la ayuda de la luz solar y la clorofila. La clorofila es un compuesto org´anico, formado por mol´eculas que contienen ´atomos de carbono, de hidr´ogeno, ox´ıgeno, nitr´ogeno y magnesio. Estos elementos se organizan en una estructura especial: el ´atomo de magnesio se sit´ ua en el centro rodeado de todos los dem´ as ´atomos. La clorofila capta la luz solar, y provoca el rompimiento de la mol´ecula de agua (H 2 O), separando el hidr´ogeno (H ) del ox´ıgeno (O); es decir, el enlace qu´ımico que mantiene unidos al hidr´ o geno y al ox´ıgeno de la mol´ecula de agua, se rompe por efecto de la luz. El proceso genera ox´ıgeno gaseoso que se libera al ambiente, y la energ´ıa no utilizada es almacenada en mol´eculas especiales llamadas AT P . En consecuencia, cada vez que la luz est´e presente, se desencadenar´ a en la planta el proceso descrito. 2- Fase secundaria u oscura La fase oscura de la fotos´ıntesis[4] es una etapa en la que no se necesita la luz, aunque tambi´ en se realiza en su presencia. Ocurre en los cloroplastos y depende directamente de los productos obtenidos en la fase lum´ınica. En esta fase, el hidr´ogeno formado en la fase anterior se suma al di´oxido de carbono gaseoso (CO 2 ) presente en el aire, dando como resultado la producci´on de compuestos org´anicos, principalmente carbohidratos; es decir, compuestos cuyas mol´eculas contienen carbono, hidr´ogeno y ox´ıgeno.
Figura 4. Esquema b´asico de la fotos´ıntesis en un cloroplasto. El resultado final, y el m´as trascendental, es que la planta guarda en su interior la energ´ıa que proviene del Sol. Esta condici´ o n es la raz´on de la existencia del mundo vegetal porque constituye la base energ´etica de los dem´ as seres vivientes. Por una parte, las plantas son para los animales fuente de alimentaci´ on, y, por otra, mantienen constante la cantidad necesaria de ox´ıgeno en la atm´osfera permitiendo que los seres vivos puedan obtener as´ı la energ´ıa necesaria para sus actividades. Si los qu´ımicos lograran reproducir la fotos´ıntesis por medios artificiales, se abrir´ıa la posibilidad de capturar energ´ıa solar a gran escala. En la actualidad se trabaja mucho en este tipo de investigaci´ on. Todav´ıa no se ha logrado sintetizar una mol´ecula artificial que se mantenga polarizada durante un tiempo suficiente para reaccionar de forma u ´ til con otras mol´ eculas, pero las perspectivas son prometedoras. 4. DESARROLLO EXPERIMENTAL Para la preparaci´on del extracto de clorofila se necesitaron unas cuantas hojas de espinaca, el manual de laboratorio para esta practica[3] indicaba el uso de solo 2.5 gr. de espinaca, pero para tener una mayor cantidad de clorofila 3
4
DESARROLLO EXPERIMENTAL
se decidi´ o seguir las instrucciones del manual usando una proporci´on de 1.5 de todas las cantidades necesarias para la extracci´on de las clorofilas α y β [3]. Para la extracci´on de las clorofilas α y β se mezclaron 3.75 gr. de espinaca molida con 60 ml. de acetona diluida al 80%. Una vez que la acetona adquiere un color verde oscuro intenso, se filtra en un embudo de separaci´on, el extracto de acetona contiene los pigmentos de los cloroplastos.
Figura 7. Agregado de agua destilada (tercera vez) a la mezcla previa dentro del embudo de separaci´on. se separen las mezclas de ´eter de petroleo y de alcohol met´ılico.
Figura 5. Mezcla de acetona al 80 % con espinaca molida.
Con ayuda del embudo de separaci´on se coloca la parte inferior (de alcohol met´ılico) en un vaso de precipitado y la soluci´on de la parte superior (de ´eter de petroleo) en otro.
Se agrega al embudo de separaci´on que contiene los pigmentos 75 ml. de ´eter de petroleo y se rota el embudo suavemente. Posteriormente se agregan 105 gr. de agua destilada en el embudo, de tal manera que el agua resbale por las paredes del recipiente hasta que llegue al fondo del embudo. Se rota el embudo hasta que la parte superior adopte un color verde intenso. Se lava la soluci´on de ´eter de petroleo a˜nadiendo 75 ml. de agua destilada. Se rota suavemente el embudo, esperando a que se separen la soluciones y se drena el agua con ayuda del embudo de separaci´ on. Se repite el procedimiento anterior de dos a mas veces.
Figura 8. Soluci´ on de ´eter de petroleo. La soluci´on de alcohol met´ılico contiene la clorofila β y xantofila, mientras que la soluci´ on de ´eter de petroleo contiene la clorofila α y carotenos. Una vez separadas las soluciones, se colocan 75 ml. de la soluci´ on de alcohol met´ılico en el embudo de separaci´ on (previamente se lav´o con acetona y agua destilada) y se a˜nadieron 75 ml. de ´eter et´ılico, se mezcla por rotaci´on dentro del embudo, una vez mezclado se a˜ n ade 7.5 ml de agua destilada haci´endola resbalar por las paredes del recipiente, se agrego agua destilada cada cierto tiempo (intervalos entre 2 y 5 mn.) respetando el agregar 7.5 ml. cada vez, este proceso se repiti´o hasta que se observaron dos faces, se desecha la parte inferior (de alcohol met´ılico).
Figura 6. Agregado de agua destilada (primera vez) a la mezcla previa dentro del embudo de separaci´on.
En dos tubos de ensayo grandes, se colocan 45 ml. de cada una de las soluciones por separado, esto es, la soluci´on de ´eter et´ılico en uno y de ´eter de petroleo en otro.
Despu´es se mezclan 69 ml. de alcohol met´ılico con 6 ml. de agua destilada. Se limpia la soluci´on de ´eter de petroleo a˜ nadiendo 75 ml. de la soluci´on de alcohol met´ılico, se mezcla rotando el embudo de separaci´on y se espera a que
Se prepara una soluci´on de 13.5 ml. de alcohol met´ılico con 31.5 mg. de hidr´oxido de potasio, cuidadosamente se vierte por las paredes de cada tubo de ensayo 22.5 ml. de la soluci´ on de alcohol met´ılico y se procede a agitar. 4
4
DESARROLLO EXPERIMENTAL
Figura 9. Soluci´on de alcohol met´ılico, ´eter de et´ılico y agua destilada.
Figura 12. Soluci´on de alcohol met´ılico y ´eter et´ılico (5 mn. despu´es de su preparaci´on). Figura 10. Soluci´on de alcohol met´ılico y ´eter de petroleo. Se espera un tiempo a que se formen dos faces en cada tubo y con ayuda del embudo de separaci´on se desecha la parte inferior de cada uno.
Figura 11. Soluci´on de alcohol met´ılico y ´eter de petroleo (5 mn. despu´es de su preparaci´on). La parte restante de cada tubo contiene los pigmentos, clorofila α (soluci´on de ´eter de petroleo) y clorofila β (soluci´ on de ´eter et´ılico).
Figura 13. Espectrofot´ometro utilizado en el experimento.
Una vez separados los pigmentos se procedi´o a obtener su absorbancia contra longitud de onda con ayuda de un espectrofot´ometro (spectronic 21).
5
REFERENCIAS
5. RESULTADOS Gr´ aficas obtenidas durante el experimento.
Figura 14. Espectro de absorci´on de alcohol met´ılico y ´eter de petroleo.
´ 6. ANALISIS Como se observa en la grafica 3, el espectro de absorbancia de los dos tipos de clorofila que se obtuvieron experimentalmente si son similares a los espectros te´oricos. Las dos clorofilas ten´ıan m´ axima absorbancia entre 400 − 500nm y 620 − 700nm y m´ınima absorbancia entre 500 − 610nm(±1nm). Los picos obtenidos para la clorofila α ocurrieron en 430nm y 620(±1nm) y para la clorofila β , los picos ocurrieron en 450nm y 610nm. Aunque estos picos si son consistentes con los valores te´ oricos del espectro, el espectro en general no es exactamente como se esperaba. El segundo pico de la clorofila α es mas grande que el de la clorofila β , cuando en teor´ıa el segundo pico de α tiene que ser mas grande que el de β . Otra observaci´on es el primer pico de β es muy ancho (un poco mas de 100nm). Esto no es consistente con el espectro te´o rico ya que lo mas ancho es de aproximadamente 50nm. Estas inconsistencias pueden ser dadas por el m´etodo experimental. Aunque los pasos de la extracci´on de las clorofilas son claros, se tiene que tener mucho cuidado de no contaminar las muestras y de asegurarse de que desechos no se queden soluci´on analizada. Contaminantes y desechos dentro de la muestra puede afectar el espectro de absorci´on un poco. Otro problema fue que el espectrofot´ometro tend´ıa a saturarse con valores grandes de la absorbancia. Esto fue un gran problema ya que la absorbancia del primer pico de la clorofila beta es grande. Se obtuvo la transmitancia sin saturaci´on pero los valores de los picos era peque˜nos con poca variaci´on que el espectroscopio no tenia la resoluci´ on necesaria para dar valores precisos (daba un intervalo constante cuando no lo eran y afectaba los valores obtenidos de la absorci´on). 7. CONCLUSIONES
Figura 15. Espectro de absorci´on de alcohol met´ılico y ´eter de et´ılico.
Los resultados fueron suficientemente consistentes para diferenciar entre clorofila α y clorofila β pero no fueron los mejores. Esto esta dado a que la muestra no era totalmente pura y conten´ıa desechos que afectaron el espectro de absorci´ on. Tambi´en el espectrofot´ometro se saturaba al llegar una cierta medici´ on. Estos problemas pueden ser eliminados asegurando que los instrumentos en uso esta limpio entre cada uso y asegurarse que los desechos no contaminen las soluciones. REFERENCIAS
Figura 16. Espectro de absorci´on de la soluci´on de ´eter de petroleo (clorofila α) menos el espectro de absorci´on del ´eter de petroleo y de la soluci´ on de ´eter et´ılico (clorofila β ) menos el espectro de del ´eter et´ılico (ambos menos el espectro de absorci´ on del alcohol met´ılico).
[1]-http://hyperphysics.phyastr.gsu.edu/hbasees/biology/pigpho.html, fecha de consulta: 16/05/15. [2]-http://www.bdigital.unal.edu.co/8545/18/08 Cap06.pdf, fecha de consulta: 16/05/15. [3]-Manual de laboratorio ”Espectro de absorci´ o n de la clorofila”. [4]-http://ocw.upm.es/produccionvegetal/viticultura/contenidos/Fotosintesisvid.pdf, fecha de consulta: 18/05/15.
6
