AGRADECIMIENTO
Esta monografía se empezó a realizar en julio del 2008 y se culminó en agosto del 2008. Durante todo este tiempo tiempo fue necesario necesario tener tener mucha mucha dedi dedica caci ción ón y paci pacien enci cia a para para la comp compos osic ició ión, n, diagramación y revisión de los contenidos, sin duda una tarea verdaderamente invalorale, por lo !ue nos sentimos agradecidos de la colaoración de nuestros profesores"
•
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sí mismos mismos a todos todos !uiene !uieness contri contriuy uyer eron on de algu alguna na u otra otra for forma en la ela elaor orac ació ión n de la mono monogr graf afía ía,, pero pero muy muy espe especi cial alme ment nte e !uie !uien n 1gura en la lista de colaoradores.
DEDICATORIA
Dedicamos este traajo a nues nuestr tro o prof profes esor or #íct #íctor or )el3 )el3nd ndez ez uer uerrrero, ero, por por iniciarnos en la inve invest stig igac ació ión n y por por ser ser guía en nuestras primeras e4per e4perien iencia ciass acad3m acad3mica icass universitarias.
Dedicamos el traajo a nues nuestr tros os padr padres es por! por!ue ue son son nuestros guías y luz para alcanzar nuestros m5s grandes anhelos.
ÍNDICE
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2
Dedicamos este traajo a nues nuestr tro o prof profes esor or #íct #íctor or )el3 )el3nd ndez ez uer uerrrero, ero, por por iniciarnos en la inve invest stig igac ació ión n y por por ser ser guía en nuestras primeras e4per e4perien iencia ciass acad3m acad3mica icass universitarias.
Dedicamos el traajo a nues nuestr tros os padr padres es por! por!ue ue son son nuestros guías y luz para alcanzar nuestros m5s grandes anhelos.
ÍNDICE
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2
2. 9remio 9remio óel77.77. óel77.77..77777 .7777777.777 77.77777.7. 77.7... .. 77777777777777 @. De1nición7 De1nición777777 77777777777 777777777777 777777777777 7777777 7 77777777777 %9:&/*' $$" %*<$>$%%$6 DE %(')&'(>: . %romatografía de reparto 77777777777777... 7777777777777 2. %romatografía de adso adsorrción ción77 7777 7777 7777 7777 7777 7777 7777 7777 7777 7777 7777 7777 777. 7. @. %romatografía en gel7 gel777 7777 7777 7777 7777 7777 7777 7777 7777 7777 7777 7777 7777 7777 7777 77.. . %romatografía en gel de capa 1na77777777777777777777777.. A. %romatografía de intercamio iónico7777777777777777777777 B. %romatografía de a1ni a1 nid dad77 ad7777 7777 7777 7777 777 77777 777777 7777 7777 7777 7777 7777 777 7 ?. %romatografía de penetr etrailidad777777777777.......... ......... ............... ......... 8. %romatografía de interacción hidrofóica77777.. 7777777777777
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INTRODUCCIÓN Desde el siglo pasado las separaciones analíticas se llevaan a cao por m3todos cl5sicos como son la precipitación, destilación y e4tracción. *os crecientes esfuerzos por conocer m5s sore la composición y función de las proteínas han oligado a los cientí1cos a uscar t3cnicas, cada vez, m5s precisas. 9ara elegir una t3cnica de separación, adem5s de tener en cuenta los criterios económicos y de accesiilidad, hay !ue atender a dos
tipos de consideraciones" unas tienen !ue ver con las propiedades físicas y estructurales de las mol3culas !ue se pretende separar, o de las características de la matriz en !ue se encuentranI otras se derivan de los ojetivos del an5lisis sensiilidad, resolución, tiempo de an5lisis, necesidad de una detección especi1ca. El m3todo de selección incluye los pasos necesarios para la otención, preparación y posile fraccionamiento de la muestra, la aplicación de la t3cnica analítica adecuada y el tratamiento de los datos otenidos. *as t3cnicas analíticas m5s empleadas en la actualidad pueden engloarse en dos grandes grupos" t3cnicas de separación y t3cnicas espectroscópicas. *as t3cnicas espectroscópicas proporcionan, para cada compuesto analizado, una información compleja, relacionada con sus características estructurales especí1cas, por otro lado las t3cnicas de separación se utilizan para resolver los componentes de una mezcla y la seJal otenida puede utilizarse con 1nes analíticos cuantitativos o cualitativos. ctualmente las separaciones analíticas se fundamentalmente por cromatografía y electroforesis.
realizan
*a cromatografía es un proceso de separación muy comKn en ingeniería !uímica y io!uímica. Es un procedimiento altamente selectivo, capaz de distinguir y separar componentes con características físicas y !uímicas muy similares. Esta t3cnica se considera importante tanto a nivel de producción como de an5lisis. *a cromatografía no solo permite la separación de los componentes de una mezcla, sino tami3n su identi1cación y
A
cuanti1cación.
tres
t3cnicas
son
lí!uido,
gas
y
Luido
supercrítico
respectivamente. En la cromatografía lí!uida, la fase móvil es un lí!uido !ue Luye a trav3s de una columna !ue contiene a la fase 1ja.
B
CAPITULO I
HISTORIA Y DEFINICIÓN 1. ANTECEDENTES HISTORICOS
?
88 Way y Thompso " (econocieron el fenómeno de intercamio iónico en sólidos. 8A0 R!"#$ S%ho#&#'$ y Go#pp#(s)o#*#)" Estudiaron el an5lisis por capilaridad en papel. 8?B L#m&#)"" $lustró la reversiilidad y este!uiometría del intercamio iónico en minerales como el silicato de aluminio. 8C2 R##*"
e%$@ y el %u<'. C0B Ts+#,," $nventó la cromatografía en columna con el uso de solventes
puros
para
desarrollar
un
cromatograma,
usó
adsorventes suaves para resolver una mezcla de pigmentos, ver m5s detalles aajo. C@0 -a))#)$ -!h$ y S,)a' " /só adsorventes como hidró4ido de calcio activado, aluminio y magnesio C@A Ho(m#s y A*ams "
8
CA2 2am#s y Ma),'" Desarrollaron de la cromatografía de gas. CAB So&#) y P#,#)so" 9repararon las primeras celulosas para intercamio iónico. CAB La,h# y R!,h/a" /saron almidón natural y modi1cado como tamiz para la estimación del peso molecular. CAC Po)a,h y F(o*'" $ntrodujeron al de4tr5n entrecruzado como tamiz molecular CB 2. C. Moo)#" Desarrolló la cromatografía de permeación en gel. En C0B el ot5nico ruso )iMhail
C
m3todo m5s racional para la investigación de los pigmentos de las plantas llevó a &sXett a su principal logro cientí1co" el desarrollo de la cromatografía, !ue arió una nueva era en el estudio de estos pigmentos, y sore todo, de la cloro1la.
a
la siguiente
de1nición
5sica"
0
concentración de gases, vapores, lí!uidos o compuestos disueltos sore la super1cie de cuerpos sólidosZ. En una posterior pulicación en alem5n en C0B, &sXett descriió con detalle cómo otenía los pigmentos de hojas frescas trituradas con 3ter de petróleo al !ue aJadía pe!ueJas cantidades de alcohol, !ue posteriormente eran eliminadas por agitación con agua destilada. El e4tracto de pigmentos se separaa en sus componentes con ayuda del YcromatógrafoZ. En su primera versión fue tan simple como el !ue se encuentra en la 1gura todavía utilizado en cromatografía preparativa y despu3s evolucionó al sistema de la 1gura 2 para aumentar el nKmero de e4perimentos. En sus traajos hasta C0 &sXett e4aminó hasta 28 adsorentes en los !ue descriió diferentes comportamientos. &ras anunciar la invención de esta nueva t3cnica en C0@, &sXett la empleó para otener muestras !uímicamente puras de las cloro1las a y , y aportó la pruea incuestionale de la heterogeneidad del pigmento verde de las plantas, aun!ue no fue el primero en proponer esta heterogeneidad. dem5s descurió una tercera forma de cloro1la en algas, la cloro1la c. &sXett se le ha considerado posteriormente el descuridor de todas las formas de cloro1la, aun!ue 3l siempre atriuyó al cientí1co ingl3s
En los aJos siguientes se mantuvo una agria pol3mica entre los dos investigadores, centrada en la e4istencia de las distintas formas de las cloro1las, !ue pareció zanjada cuando )archleXsMi aceptó !ue la metodología de &sXett era adecuada y !ue
2
El B de junio de CC murió, a los ? aJos, víctima de su deilitado corazón y de una vida siempre en condiciones de precariedad económica. *a actitud enormemente crítica hacia la investigación de &sXett sore cloro1las y carotenoides por parte de sus colegas demuestra !ue sus innovaciones no encontraron gran apoyo. *as actitudes mayoritarias en a!uellos aJos fueron predominantemente negativas y durante la primera d3cada tras la muerte de &sXett el nKmero de pulicaciones en los !ue se usaa la cromatografía disminuyó radicalmente, principalmente por!ue los resultados otenidos por el primer cromatogra1sta del mundo fueron ignorados. /no de los motivos aducidos para esta falta de reconocimiento fue !ue la principal pulicación de &sXett no fue accesile para los cientí1cos de la Europa 'ccidental por!ue estaa escrito en ruso, y adem5s por!ue era una rareza iliogr51ca, una edición de su tesis doctoral. un!ue esto pueda ser cierto, no es menos cierto !ue &sXett pulicó numerosos artículos en revistas de otros países, y realizó demostraciones de su t3cnica en las distintas sociedades cientí1cas europeas, pues sus conocimientos de franc3s, ruso, ingl3s y alem5n le permitieron estar en contacto con las sociedades internacionales de mayor prestigio. &ami3n se ha aducido para justi1car esta falta de reconocimiento el !ue las pulicaciones de &sXett fueran mayoritariamente dedicadas al campo de los pigmentos vegetales en revistas de ot5nica, pero tami3n presentó sus resultados en revistas de !uímica francesas y alemanas. El olvido en el !ue se mantuvo el descurimiento de &sXett es posile !ue se dea sore todo a la falta de con1anza !ue alguno de los principales cientí1cos de su tiempo mantuvo acerca de la cromatografía, fundamentalmente [illst\ter. )ientras vivió, nadie e4cepto &sXett se atrevió a desa1ar a [illst\ter cuando a1rmaa !ue 3l haía sido el primero en otener las cloro1las a y
@
!uím !uímic icam amen ente te pura puras, s, y tras tras la muer muerte te de &sX sXet ettt en CC CC,, la investigación sore los pigmentos de las plantas fue pr5cticamente monopolizada por la escuela de [illst\ter. %omo Ettre y ;orv5th escriieron mucho m5s tarde, Y7en este periodo [illst\ter era el 9apa sic en este campoZ el de las croro1las, por lo !ue
*os primeros e!uipos de cromatografía de gases aparecieron en el mercado a mediados del siglo FF. su vez, la cromatografía lí!uida de alta alta resol resoluci ución ón ;9*% ;9*% comenz comenzó ó a desar desarro rolla llarse rse en los aJos aJos CB0, aumentando su importancia en las d3cadas siguientes, hasta conv conver erti tirs rse e en la t3cn t3cnic ica a crom cromat atog ogr5 r51c 1ca a m5s m5s empl emplea eada da..
1.1 ASPECT ASPECTOS OS HISTÓR HISTÓRICO ICOS S DE LOS DISTIN DISTINTO TOS S TIPOS TIPOS DE CROMATOGRAFÍA C)oma,o")a45a # pap#(
>ue desarrolla desarrolla por )artin. &iene como soporte un papel de celulosa. d!uirió una gran e4tensión por su sencillez y presenta la ventaja de poder utilizar miligramos y microgramos, adem5s presenta la opción de utilizar tanto la t3cnica descendente en columna, etc... como la t3cnica ascendente. C)oma,o")a45a # %apa 9a
>ue originada por los traajos de los investigadores rusos $zmailov y
Esta t3cnica apareció durante la $$ uerra )undial y en principio tenía la 1nalidad de separar las tierras raras y los elementos de transición. En C@8 &aylor y /rey utilizan este m3todo para separar isótopos de *itio y 9otasio utilizando resinas de zeolita. En C@C
>odin odin y 9orat orath h en CA CA8 descu escur ren en !ue !ue usand sando o como omo fase ase estacionaria geles se consigue separar polímeros sint3ticos de alto peso molecular. C)oma,o")a45a *# a9'*a*.
$dea $deada da por por 9orat orath h en CB? CB?,, usan usando do como como fuen fuente te un p3pt p3ptid ido o o proteína unida covalentemente a un ligando y se utiliza para la separación de mol3culas proteicas. C)oma,o")a45a *# "as.
A
Es una de las t3cnicas m5s utilizadas e importantes, de forma !ue ha revolucionado el campo de la !uímica analítica.
<. PREMIOS NO0EL EN CROMATOGRAFÍA
Hhun, Hamer y (uzucca desarrollan la cromatografía en el campo de la !uímica org5nica e inorg5nica, y otienen el premio oel por sus traajos en C@?, C@8, C@C respectivamente
.
En CA2 rcher ]. 9. )artin y (ichard *. ).
=. DEFINICIÓN
*a pala alara ra %romatografía sign signi1 i1ca ca OEscri OEscrii irr en %oloresO %olores O ya !ue cuan cuando do fue fue desa desarrrolla ollada da los los comp compon onen enttes sepa separa rado doss eran eran colorantes. *a cromatografía es un conjunto de t3cnicas asadas en el principio de reten etenci ción ón sele select ctiv iva a cuyo cuyo oje ojeti tivo vo es sepa separa rarr los los dist distin into toss componentes de una mezcla y en algunos casos identi1car estos si es !ue no se conoce su composición. *as t3cnicas cromatogr51cas son muy variadas, pero en todas ellas hay una fase móvil !ue consiste en un Luido gas gas,, lí!uido o Luido supercrítico !ue supercrítico !ue arra arrast stra ra a la mues muesttra a trav trav3s 3s de una una fase fase esta estaci cion onari aria a !ue !ue se trat trata a de un sólido sólido o un lí!uido lí!uido 1jado en un sólido. *os componentes de la mezcla interaccionan en distinta forma con la fase fase esta estaci cio onari naria a y con con la fase ase móvil. vil. De este ste modo, do, los los componentes atraviesan la fase estacionaria a distintas velocidades y se van separando. Despu3s de haer pasado los componentes por la fase estacionaria y haerse separado pasan por un detector B
!ue genera una seJal !ue puede depender de la concentración y del tipo de compuesto. E 1>?@ Ts+#,, *#9': (a %)oma,o")a45a %omo
)3todo en el cual los componentes de una mezcla son separados en una columna adsorente dentro de un sistema Luyente. R#%'#,#m#,# (a I.U.P.A.C *#9# (a %)oma,o")a45a *# 4o)ma mBs amp('a %omo
)3todo usado principalmente para la separación de los componentes de una muestra, en el cual los componentes son distriuidos entre dos fases, una de las cuales es estacionaria, mientras !ue la otra es móvil. *a fase estacionaria puede ser un sólido o un lí!uido soportado en un sólido o en un gel matriz. *a fase estacionaria puede ser empa!uetada en una columna, e4tendida en una capa, distriuida como una película, etc.
parte de una masa, y deido a la tendencia !ue esta tiene a formar mezcla con la primera, asorción pura, o a reaccionar !uímicamente con la misma, asorción con reacción !uímica, considerando amas como un fenómeno m5sico y no super1cial.
?
S#" -#!(#mas ha *#9'*o (a %)oma,o")a45a %omo
/n m3todo físico de separación en el cual los componentes a separar se distriuyen entre dos fases, una de las cuales constituye la fase estacionaria, de gran 5rea super1cial, y la otra es un Luido fase móvil !ue pasa a trav3s o a lo largo de la fase estacionaria. *a fase estacionaria puede ser un sólido o un lí!uido dispuesto sore un sólido !ue actKa como soporte, de gran 5rea super1cial. *a fase móvil es un Luido puede ser gas, lí!uido o Luido supercrítico !ue se usa como portador de la mezcla. En la cromatografía ocurren dos fenómenos muy importantes y !ue son pr5cticamente los rectores del proceso de separación" la adsorción y la asorción. *a adsorción es la retención de una especie !uímica en los sitios activos de la super1cie de un sólido, !uedando delimitado el fenómeno a la super1cie !ue separa las fases o super1cie interfacial. Esta retención super1cial puede ser física o !uímica. *a adsorción depende de la naturaleza de la sustancia adsorida, de la temperatura, de la naturaleza y estado de sudivisión del adsorente, y de la concentración. *a asorción es la retención de una especie !uímica por parte de una masa y depende de la tendencia !ue tiene 3sta a formar mezcla o reaccionar !uímicamente con la misma.
8
C
CAPITULO II
CLASIFICACIÓN DE CROMATOGRAFIA 9ara clasi1car gloalmente los procesos cromatogr51cos es necesario atender a dos criterios 5sicos" •
>undamento del proceso cromatogr51co, lo !ue conduce a los
tipos de cromatografías.
20
•
>orma de realizar el proceso cromatogr51co, es decir, lo !ue
constituye las distintas t3cnicas cromatogr51cas. 1. CROMATOGRAFÍA DE REPARTO
2
_l5minas teóricas` !ue contienen, cada una, las dos fases. %onsid3rense 2AB mol3culas id3nticas !ue se distriuyen igualmente entre las dos fases, estacionaria y móvil, y una columna con dieciocho l5minas 1gura 8N. En la placa superior u origen las 2AB mol3culas est5n distriuidas de forma !ue 28 se encuentran en cada fase. %uando las 28 mol3culas móviles de la l5mina entran en la segunda l5mina, se redistriuyen en B y BI de las 28 !ue permanecen en la l5mina tami3n se distriuyen B y B segKn se indica en la 1gura 8N.
22
ciones ponen d3 mani1esto !ue en un caso ideal en el !ue la distriución venga Knicamente determinada por el reparto, la resolución de dos sustancias mejorar5 con el aumento de la longitud de la fase estacionaria. 1.1 Ejemplos de cromatografía de reparto
*os dos tipos de cromatografía de reparto m5s corrientes son la cromatografía en papel y la de capa 1na. En los dos casos la matriz contiene un lí!uido, en la cromatografía en papel se trata de las mol3culas de agua unidas a la celulosa y en la cromatografía de capa 1na el lí!uido unido al soporte es el disolvente utilizado para formar la capa 1na v3anse las p5ginas CANCC. Estas t3cnicas a veces se consideran como tipos de cromatografía de adsorción, por!ue los efectos de adsorción entran dentro de la consideración de separaciónI sin emargo, el principal tipo de acción !ue tiene lugar es el reparto. *a cromatografía de reparto tami3n puede realizarse en columnas, utilizando una matriz !ue no adsora los solutos. *os materiales de soporte m5s corrientes son la tierra de diatomeas p. e., %elita, el gel de sílice, la celulosa en polvo y algunos de4tranos !ue forman tramas p. e.,
2@
*a cromatografía de reparto se utiliza, sore todo, para mol3culas de ajo pesoN molecular. 9ara reducir la e4tensión por difusión es decir, el ensanchamiento de los picos, son necesarias zonas de iniciación muy pe!ueJas y una separación r5pida. En los apartados !ue tratan de cromatografía en papel y en capa 1na, se descriir5 con detalle cómo se realizan estos procesos.
<. CROMATOGRAFÍA DE ADSORCIÓN
%onsid3rese una super1cie sólida !ue contenga una amplia variedad de sitios de unión NNpor ejemplo, regiones con una densidad electrónica elevada cargadas negativamente, con una densidad electrónica aja cargadas positivamente, no polares, y así sucesivamente^ y un lí!uido !ue contiene un soluto, en contacto con la super1cie.
2
se une no es una fracción constante, sino !ue disminuye a medida !ue disminuye la concentración. *a velocidad con !ue se mueve la sustancia est5 relacionada con la fuerza de unión, siendo m5s lento el movimiento cuanto m5s 1rme es la unión. En consecuencia, las mol3culas pueden separarse si tienen isolíneas de adsorción diferentes, deido a !ue sufrirían un grado diferente de retraso. &ala . )ateriales de uso corriente en la cromatografía de adsorción. )aterial lKmina el de sílice %arón activado el de fosfato c5lcico ;idro4iapatito
2.1 Tipos de cromatografía de adsorción
*a cromatografía de adsorción utiliza una fase lí!uida móvil y una fase estacionaria sólida, con la Knica e4cepción de la cromatografía de gases. *a separación puede tener lugar en columnas o en capa 1na. *a tala 8N indica los adsorentes m5s comunes y sus diferentes utilizaciones. /na importante variación de la cromatografía de adsorción, es la cromatografía de intercamio iónico. *a diferencia principal estria en la composición de la fase móvilI 3sta es de tal naturaleza !ue cuando el material se aplica al adsorente, el soluto !ueda inmovilizado. *a migración no empieza hasta !ue se aJade una fase móvil. o hay diferencias de principio, pero 3ste es un caso especial en el cual la adsorción es muy fuerte. Es importante comprender !ue las cromatografías de adsorción y reparto no son e4clusivas entre sí, ya !ue los efectos de adsorción pueden estar presentes en la cromatografía en papel, de capa 1na e incluso, a veces, en la cromatografía en gel. 2A
<.< Funcionamiento de las columnas
9roalemente el m3todo m5s corriente para contener la .fase estacionaria o soporte es una columna. /na columna cromatogr51ca consiste en un tuo !ue
2B
separados se encuentran e identi1can titulando alícuotas de cada fracción ^haciendo mediciones espectroscópicas, prueas !uímicas, radiactividad, etc. En los casos en !ue el an5lisis se realiza midiendo la asorción de la luz, se utiliza un espectrofotómetro de registro continuo. *a muestra pasaO 5 trav3s de un tuo antes del fraccionamiento, se mide la asorancia en la longitud de onda apropiada y se representan los valores en un registrador gr51co de forma continua. *as columnas pueden ser eluidas de tres formas" el m3todo m5s sencillo consiste en un Lujo continuo del disolvente a trav3s de la columna. Este m3todo es de uso corriente en la cromatografía de intercamio iónico y en la cromatografía en gel. *a elución por pasos se utiliza, en general, cuando la columna funciona con propósitos preparativos. *a columna es eluida con un disolvente hasta !ue se alcanza un volumen previamente determinado. continuación se aJade un segundo disolvente. Este m3todo tiene la ventaja de !ue se pueden disponer las condiciones de forma !ue un material concreto pueda eluirse en un volumen astante pe!ueJo. %onsid3rese, por ejemplo, una mezcla de sustancias en la !ue la sustancia F sufre un fuerte retardo cuando se emplea el disolvente , mientras !ue las dem5s sustancias e4perimentan un retraso muy pe!ueJoI adem5s F e4perimenta Oun retraso muy d3il con el disolvente G. 9or lo tanto, si se lava la columna con un e4ceso de disolvente , la mayor parte del material es eluido de la columna, mientras !ue la mayor parte de F permanece unido a ella.
2?
se preparan por medio de aparatos del tipo !ue se muestra en la 1gura 8NA. Estos aparatos constan de dos recipientes, un depósito y una c5mara de mezcla, !ue est5n conectados por sus ases. El depósito contiene el disolvente m5s concentrado. El lí!uido sale de la c5mara de mezcla y entra en la columna. %omo los niveles hidrost5ticos deen corresponderse las alturas de los lí!uidos no tienen !ue ser necesariamente iguales, por!ue las densidades de los lí!uidos en amos recipientes puede variar, el li!uido Luye simult5neamente del depósito a la c5mara de mezcla.
*a cromatografía en gel !ue algunas veces recie el nomre de cromatografía de tamiz molecular es un tipo especial de cromatografía de reparto, en la !ue la separación se asa en el tamaJo molecular. *a ase de la cromatografía en gel es astante sencilla.
28
9or lo tanto, las mol3culas son eluidas de la columna por orden de tamaJos decrecientes, o, si la forma es relativamente constante por ejemplo, gloular o cilíndrica, por orden de pesos moleculares decrecientes. En un an5lisis detallado de la cromatografía en gel, !ueda claro !ue este efecto est3rico, aun!ue es el principal factor, no e4plica por si sólo el comportamiento cromatogr51co de todas las mol3culas. 'tro factor importante es la carga de la mol3cula, aun!ue 3sta se mani1esta sólo en condiciones de aja fuerza iónica, en las !ue las mol3culas pe!ueJas, fuertemente cargadas, parecen !uedar e4cluidas de los poros, independientemente de !ue su tamaJo sea lo su1ciente pe!ueJo. Este efecto se dee, con proailidad, a la repulsión electrost5tica entre las mol3culas, !ue limita el nKmero de mol3culas en un poro en cual!uier momento dado. %uando la fuerza iónica es muy pe!ueJa, tami3n parecen e4istir efectos de adsorción, al menos en apariencia y en algunos tipos de geles. 3.1 Materiales para la cromatografía en gel
/n gel es un retículo tridimensional cuya estructura se dispone, por lo general, al azar. *os geles !ue se utilizan como tamices moleculares constan de polímeros entrecruzados, por lo general, inertes, !ue no se unen ni reaccionan con el material analizado y !ue no presentan carga el3ctrica. El espacio del interior del gel est5 ocupado por un lí!uido !ue rellena la mayor parte del gel. *os geles de uso corriente son de tres tipos" de4trano, agarosa y poliacrilamida.
prepara
con
diversos
grados
de
entrecruzamiento para controlar el tamaJo del poro y es suministrado en forma de granos secos, con diversos grados de 1nura, !ue se dilatan cuando se les aJade agua. El proceso por el !ue los poros !uedan llenos del lí!uido utilizado como eLuente,
2C
recie el nomr mre de hinchazón. El de4trano se otiene come comerc rcia ialm lmen ente te con con el nom nomre re de ine ine %hemicals, $nc.. *a agarosa !ue !ue se oti otien ene e de cier cierta tass alga algass mari marina nas s es un polímero lineal de DNgalactosa y @,BNanhidroNNgalactosa y forma un gel
!ue
se
mantiene
compacto
sin
necesidad
de
entrecruzamientos, por medio de puentes de hidrogeno. ine %hemicals, $nc. y de GioNg oNgel GioN( oN(ad *aoratories. *os geles de poliacrílamida se preparan entrecruzando acrilamida con .Nmetil3nNisNacrilamida. En este caso el tamaJo de poro tami3 tami3n n viene viene deter determin minado ado por el grado grado de entre entrecru cruzam zamien iento to.. Estos geles se diferencian de los geles de de4trano y de agarosa en !ue contienen un grupo caro4ilamida polar en 5tomos de carono alternados.
@0
*os geles descritos hasta el momento se dilatan en agua y en unos pocos disolventes org5nicos" glicol, formamida y dimetiisulfó4ido. o sufren hinchazón en alcohol puro, hidrocaruros y la mayoría de los los diso disolv lven ente tess org5n org5nic icos os,, tant tanto o pola polare ress como como no pola polarres. o ostante, sustancias como lípidos, esferoides y algunas vitaminas, se mane maneja jan n con con mayo mayorr faci facili lida dad d en esto estoss diso disolv lven ente tes. s.
*a crom cromat atog ogra rafí fía a en gel gel es insu insupe pera rale le para para la sepa separa raci ción ón de mol3 mol3cu cula lass !ue !ue se dife diferrenci encian an en su peso peso mole molecu cula lar, r, por por las las siguientes razones"
@
. Deido Deido a !ue el comport comportami amient ento o cromat cromatogr ogr51c 51co o de casi todas todas las sustancias en los geles es independiente de la temperatura, p;, fuerza iónica y composición de los lampones, se pueden realizar separaciones pr5cticamente ajo cual!uier condición. %uando se traaja con materiales muy l5iles p. e., enzimas esto signi1ca !ue !ue pued pueden en mant manten eners erse e las las condi condici cion ones es para para una una esta estai ili lida dad d m54ima. 2. )uchas susta stancias l5iles no resultan afe afectadas por la cromatografía en gel, puesto !ue no hay pr5cticamente adsorción. 9or 9or ejemplo, ejemplo, algunos algunos enzimas enzimas resultan resultan inactivado inactivadoss o alterados alterados por la unión a super1cies adsorentes o resinas de intercamio iónico. @. E4iste E4iste menos menos disper dispersió sión n de las andas andas !ue con otras otras t3cnic t3cnicas as cromatoNgr51cas por razones !ue no est5n claras. . El volumen volumen de elución elución se relacio relaciona na de form forma a sencilla sencilla con el el peso molecular.
&ala &ala 2. )ateriales de uso corriente en la cromatografía en gel. )aterial
y
comercial De4trano
nomre
)argen frac fracci cion onam amie ient nto o molecular ?00 000 A 000 @ 000 ?0 000 A 000 800 000
de pes peso o
200 N2 000
GioNgel 9NB
000 B 000
GioNgel 9NA0
A 000 A0 000 @2
GioNgel 9N@00 garosa
B0 000 00 000
2 4 0B 2A 4 0B @ 4 0A A 4 0A @0 000 A00 000
GioNgel NA ) GioNgel NA0 )
@0 000 A 4 0B A 4 0B A0 4 0B
3.3 ESTIM !E" #ES$ M$"E%&"'
mol3culas de conocido para de1nir la línea recta, calcul5ndose entonces la ) de la muestra por interpolación. *a precisión de estas determinaciones es de cerca de un 0 b. /na variación algo m5s precisa de esta t3cnica se descrie en la sección de cromatografía en gel de capa 1na. *a determinación de la distriución de pesos moleculares es, con frecuencia, importante en la caracterización de polímeros naturales y sint3ticos. De nuevo, con m3todos físicos como la centrifugación, se re!uiere un material relativamente puro.
*a cromatografía en gel es 5sicamente un m3todo de separación y se ha utilizado ampliamente en la puri1cación de enzimas y otras proteínas, y en el fraccionamiento de 5cidos nucleicos. *os geles de de4trano son especialmente Ktiles para proteínas inestales, como se ha e4plicado anteriormente. En traajos preparativos, tanto los de4tranos como las poliacrilamidas se han utilizado en volKmenes !ue van desde unos pocos mililitros a varios litros. 9ara 1nes industriales se ha llegado a emplear columnas de 000 litros.
@
dar como resultado la p3rdida de las muestras inestales. o ostante, la cromatografía en gel proporciona un camino r5pido para realizar este proceso. 9or ejemplo, las sales y las mol3culas pe!ueJas pueden eliminarse con rapidez deido a !ue resultan retrasadas en todos los geles. El intercamio de tampones puede realizarse haciendo pasar una disolución de macromol3culas a trav3s de una columna e!uilirada previamente con el tampón deseado. %omo las macromol3culas se mueven con m5s facilidad a trav3s del gel !ue los componentes del tampón original, podr5n ser eluidas en el tampón en el !u3 se ha e!uilirado el gel. *a concentración de macromol3culas se logra con facilidad aJadiendo partículas secas de gel y utilizando un tipo cuyo tamaJo de poro sea menor !ue el de las mol3culas con la !ue se est3 traajando. medida !ue se hinchan los gr5nulos, asoren el agua pero no las macromol3culas, concentr5ndose 3stas Kltimas. *a mayor parte de los m3todos de concentración de macromol3culas presenta el prolema de !ue tami3n concentran las sales y una concentración e4cesiva de sales puede alterar e incluso disociar y desnaturalizar algunas macromol3culas. Este prolema no e4iste si se utilizan geles !ue asoran el agua y las sales. continuación se descrien algunos ejemplos especí1cos de cromatografía en traajos preparativos" . En la síntesis !uímica de algunos reactivos es necesario, en general, separar el producto de las sustancias iniciales. 9or ejemplo, cuando se preparan anticuerpos Luorescentes haciendo reaccionar los anticuerpos con isotiocianuro de Luoresceína, la proteína conjugada dee separarse del colorante !ue no ha reaccionado. Esto puede realizarse con
@A
2. En la titulación de enzimas o en la determinación de los re!uerimientos de cofactores, la preparación de enzimas contiene a veces inhiidores de pe!ueJo tamaJo molecular o los mismos cofactores. &ami3n en los estudios físicos de algunas mol3culas p. e., en la espectroscopia de Luorescencia pueden estar presentes sustancias de interferencia. Estas mol3culas pe!ueJas pueden eliminarse con facilidad utilizando geles de de4trano o de poliacrilamida. @. De forma similar, pueden e4istir contaminantes de gran tamaJo molecular en mezclas en las !ue est5n analizando mol3culas pe!ueJas. En estos casos pueden utilizarse de4tranos de poro pe!ueJo. &ami3n en ocasiones deen separarse 5cidos nucleicos de proteínasI esto puede hacerse algunas veces mediante el empleo de geles de agarosa, !ue impiden el paso a las proteínas y permiten el paso a los 5cidos nucleicos por el volumen vacío. . En la mayoría de los an5lisis físicos de 5cidos nucleicos, la muestra dee estar lire de proteínas. Esto puede hacerse con facilidad. /n ejemplo de inter3s en mi propio laoratorio es la preparación de D a partir de e4tractos celulares en crudo, para el an5lisis con el microscopio electrónico, utilizando la t3cnica del citocromo c de Hleinschmidt v3ase el capítulo @.
dem5s. El paso en el !ue tiene lugar la separación por tamaJos utiliza, casi invarialemente, la cromatografía en gel. *a cromatografía en gel es tami3n un valioso instrumento analítico. *a determinación de pesos moleculares !ue se ha citado anteriormenteO es un ejemplo importante. 'tros ejemplos son" . En el estudio del metaolismo del (, algunas fracciones del ( se distinguen, en general, por centrifugación zonal, o aKn mejor, por electroforesis en geles de poliacrilamida. *a cromatografía en gel de agarosa es tami3n muy utilizada. En la 1gura 8N20 se muestra un ejemplo. 2. *as fracciones proteicas del plasma deen ser, a menudo, determinadas cuantitativamente paraN el diagnóstico de algunas enfermedades humanas. 9uede hacerse directamente en geles de de4trano y se ha desarrollado como una pruea de utilidad en la macrogloulinemia e hipergioulinemia. @. El intercamio de tritio para el e4amen de la estructura de la proteína o el D, re!uiere !ue la macromol3cula sea separada con rapidez del @;2'. Esto puede hacerse en unos 0 segundos utilizando geles cargados, deido a !ue el @;2' sufre grandes retrasos en todos los geles.
@?
. CROMATOGRFIA EN GEL DE CAPA FINA
*a cromatografía en capa 1na tiene las ventajas de una r5pida separación, el empleo de un e!uipo sencillo y una f5cil eluciónI como m3todo analítico, est5 reemplazando a la cromatografía en papel. *a cromatografía en gel de capa 1na &*, _thinNlayer gel` ofrece
las
mismas
ventajas,
adem5s
de
todas
a!uellas
proporcionadas por la utilización de geles. *a cromatografía en gel de capa 1na es similar a la cromatografía en capa 1na, en la !ue se e4tiende una 1na capa de material sore una placa de vidrio, se coloca una gota de la muestra y una fase móvil atraviesa la capa 1na.
@8
)ientras !ue la cromatografía en capa 1na se utiliza, sore todo, con amino5cidos, azKcares, oligosac5ridos, lípidos, esferoides y otras mol3culas pe!ueJas, la cromatografía en gel de capa 1na se aplica a proteínas, p3ptidos, 5cidos nucleicos, nucleótidos y otras sustancias hidrofílicas de gran tamaJo. El principal uso de la cromatografía en gel de capa 1na se encuentra en la determinación de los pesos moleculares de proteínas y p3ptidos.
precisos,
sore
todo,
si
se
efectKan
varias
determinaciones. *a cromatografía en gel de capa 1na se utiliza en el diagnóstico clínico para detectar proteínas patológicas en el suero sanguíneo, lí!uido cereroespinal y orina. &ami3n es de gran utilidad en la medida de la pureza de las proteínas, enzimas, etc. &ami3n se est5 desarrollando como una modi1cación de la inmunodifusión, inmunoelectroforesis y electroenfo!ue. *a iliografía sore la cromatografía en gel de capa 1na es muy limitada, pero la utilización de este m3todo aumenta con rapidez. . CROMATOGRAFÍA DE INTERCAM0IO IÓNICO
/n intercamiador iónico es un sólido !ue tiene enlazados !uímicamente grupos cargados, a los !ue se unen iones por fuerzas electrost5ticasI puede intercamiar estos iones por iones de una disolución acuosa. *os intercamiadores iónicos pueden utilizarse en columnas de cromatografía para separar mol3culas de acuerdo con su carga. El principio 5sico de la cromatografía de intercamio iónico es !ue las mol3culas cargadas se adsoren a los intercamiadores de forma reversile, de modo !ue dichas mol3culas pueden ser unidas o desunidas camiando el amiente iónico. *a separación mediante intercamiadores iónicos se realiza, por lo general, en dos fases" en
@C
la primera, las sustancias a separar se unen al intercamiador utilizando condiciones !ue originan una unión fuerte y estaleI a continuación, se eluye la columna con tampones de diferente p; o diferente fuerza iónica, compitiendo los componentes del tampón con el material, por los sitios de unión. *.1 #ropiedades de los intercam+iadores iónicos
/n intercamiador iónico es, por lo general, un retículo tridimensional o matriz !ue tiene grupos cargados unidos.
captación de iones intercamiales y se e4presa, por lo general, como milie!uivalentes de grupos intercamiales por miligramo de peso seco. Este nKmero es suministrado por el faricante y es
0
importante deido a !ue, si se e4cede en su capacidad, los iones pasar5n a trav3s de la columna sin unirse.
&ala @ 9ropiedades de algunos intercamiadores iónicos. )atriz De4trano
$ntercamiad ork >% D% > D
rupo funcional
omre comercial <9N
hidro4ipropil aminoetilo
EN
Dietilaminoetilo
DEE
%elulosa
EstirenoN divinilN enceno crílica >enólica Epo4iamina
%
%aro4imetilo
de4 %)Ncelulosa
%
>osfo Dietilaminoetilo 9oliletilenimina
9Ncel DEEN celulosa
Dietilaminoetilo, enzoiladoN naftolilado
9E$N celulosa DEE GDN celulosa
>%
cido sulfónico
9G celulosa A0
D% >% D
%aro4ílico cido sulfónico mino terciario
GioN(e4 ?0 Gio (e4 0 N@
La capacidad aprovechable es la capacidad ajo unas condiciones
e4perimentales determinadas es decir, p;, fuerza iónica. 9or ejemplo, la e4tensión con la !ue un intercamiador iónico est5 cargado depende del p; el efecto del p; es menor con los intercamiadores iónicos fuertes. 'tro factor es la fuerza iónica, deido a !ue los iones pe!ueJos situados cerca de los grupos cargados compiten con las mol3culas de la muestra por estos grupos. Esta competición es astante e1caz si la muestra es una macromol3cula, deido a !ue el elevado coe1ciente de difusión del ion implica un mayor nKmero de encuentros. 9or lo tanto, conforme aumenta la concentración del lampón, la competición se hace, m5s intensa. La porosidad de la matriz es una característica importante, deido
a !ue los grupos cargados se encuentran dentro y fuera de la matriz. *as mol3culas mayores pueden ser incapaces de penetrar en los poros, de forma !ue la capacidad disminuye segKn aumentan las dimensiones moleculares. *a porosidad de las resinas asadas en el poliestireno se determina por la cantidad de 2
entrecruzamientos producidos por el divinilenceno la porosidad disminuye segKn aumenta la cantidad de divinilenceno. %on las series DoXe4, el porcentaje de divinilenceno viene indicado por un nKmero situado despu3s de una FI por lo tanto, DoXe4NA0NF8 signi1ca !ue contiene un 8 b de divinilenceno. *os intercamiadores iónicos vienen en distintos tamaJos de partícula !ue recien el nomre de tamaJo de malla. *as mallas m5s 1nas presentan una mayor relación super1cieNvolumen y, por lo tanto, aumentan la capacidad del intercamiador. 9or otra parte, las mallas 1nas implican una velocidad de Lujo menor, con lo !ue puede aumentar la e4tensión por difusión. De entre tal conjunto de intercamiadores iónicos con propiedades tan diferentes ^carga, capacidad, porosidad, malla^ se puede hacer la selección del m5s apropiado para realizar una separación particularmente difícil. En los siguientes apartados se descrie cómo decidir el tipo de material de la columna y las condiciones para la unión de los iones y la elución de los mismos. *.2 Elección del intercam+iador iónico
*a primera elección !ue se dee hacer es si el intercamiador ser5 aniónico o catiónico.
@
intercamiadores fuertes o d3iles tami3n est5 asada en el efecto del p; sore la carga y la estailidad. 9or ejemplo, si se va a cromatogra1ar una sustancia d3ilmente acida !ue necesita p; muy altos o muy ajos para su ionización, se re!uiere un intercamiador fuerte deido a !ue 3ste funciona a p; e4tremos. o ostante, si la sustancia es l5il, es preferile la utilización de intercamiadores d3iles. *os intercamiadores d3iles son tami3n e4celentes para la separación de mol3culas con una carga elevada de a!uellas con poca carga, deido a !ue los iones d3ilmente cargados no se unen, por lo general, al intercamiador. *os intercamiadores d3iles permiten, asimismo, una mayor resolución de las sustancias si las diferencias de carga son muy pe!ueJas. *os intercamiadores
*as mol3culas pe!ueJas se separan mejor sore matrices con tamaJo de poro pe!ueJo o sea, un elevado grado de entrecruzamientos deido a !ue la capacidad disponile es grande, mientras !ue las macromol3culas necesitan un tamaJo de poro mayor. o ostante, e4cepto con el
los intercamiadores no deparan la oportunidad de aparejar la porosidad con el peso molecular. *os intercamiadores de celulosa han proado ser los mejores para la puri1cación de mol3culas grandes como proteínas, y polinucleótidos. Ello es deido a !ue la matriz es 1rosa, por lo !ue todos los grupos funcionales se encuentran en la super1cie y disponiles, incluso, para las mol3culas mayores. *a selección del tamaJo de malla es di1cultosa. *os tamaJos de malla pe!ueJos mejoran la resolución pero disminuyen la velocidad de Lujo, lo !ue incrementa la dispersión zonal y disminuye la resolución. 9or lo tanto, el tamaJo de malla se determina, por lo general, de forma empírica. *.( Elección del p/ tampón , condiciones iónicas
Deido a !ue los lampones est5n formados por iones, tami3n pueden intercamiar y como resultado puede afectarse el e!uilirio del p;. 9ara evitar estos prolemas se adopta la llamada regla de los tampones" se deen utilizar tampones catiónicos con los intercamiadores amónicos y tampones amónicos con los intercamiadores catiónicos. Deido a !ue la fuerza iónica es un factor a tener en cuenta para la unión, dee escogerse un tampón con elevada capacidad de tamponación, de modo !ue su fuerza iónica pueda ser lo su1cientemente aja. dem5s, para otener una uena resolución se ha encontrado !ue, por lo general, las condiciones iónicas utilizadas para colóN car la muestra en la columna las denominadas condiciones iniciales deen ser apro4imadamente las mismas !ue las !ue se utilizan para la elución de la columna. *.* E0uili+rio de intercam+io de iones
%ual!uier intercamiador de iones tendr5 sus grupos cargados unidos electrost5ticamente a contratónos, de forma !ue el conjunto sea el3ctricamente neutro. *os distintos intercamiadores pueden
A
mostrar diferente a1nidad por unos contraiones u otros. sí, un conjunto de contraiones de uso frecuente en io!uímica, ordenados de mayor a menor a1nidad, para un intercamiador de aniones gen3rico, es cífralo o4alato %lN formiato acetato ';N, o, para un intercamiador de cationes gen3rico, %a2 )g2 H ; a ;. *os otros iones a tomar en cuenta en el proceso de intercamio son los propios solutos de la mezcla 5 separar. *a mayor parte de las iomol3culas son de naturaleza iónica. *os grupos 5cidos desprotonados aportar5n carga negativa, mientras !ue la protonación de los 5sicos dar5 carga positiva. En el caso particular de los iopolímeros, la presencia de varios grupos funcional de uno u otro tipo, da cuenta de su car5cter de polielectrólifos, por lo !ue se podr5n comportar como cationes o como aniones, segKn !ue el p; del medio sea inferior o superior a su p$, respectivamente.
(esina N <⊕ a⊕
donde se ha considerado !ue el soluto catiónico viaja a trav3s de una resina intercamiadora de cationes, cuyo contraión es a . El e!uilirio anterior vendr5 goernado por una constante [ Re sin a − S ][ Na + ] K = [ Re sin a Na ][ S + ]
cuyo valor concreto estar5 dictado por las a1nidades de la fase estacionaria por cada uno de los iones en juego, < y a. En estas a1nidades intervienen factores como la carga del ion, su radio de solvatación o su polarizailidad. %onsiderando constantes estos dos Kltimos factores sore los !ue se tiene poco control, la conclusión B
primera es !ue las variaciones del p; del medio !ue alteren la carga del soluto, modi1car5n la posición del e!uilirio anterior, desplaz5ndolo a la derecha o a la iz!uierda segKn !ue ad!uiera m5s o menos carga. 9or otra parte, dicho e!uilirio podr5 ser desplazado en un sentido u otro segKn sea la concentración de a en el medio ley de acción de masas. sí, si el valor de K fuese muy elevado, el soluto < !uedar5 unido a la resina desplazando a los iones a.
(esina H ⊕ <⊕
est3 desplazado a la derecha. En de1nitiva, el e!uilirio de intercamio iónico puede ser considerado como una competencia entre los iones !ue se desplazan por la fase móvil por unirse a los grupos cargados del intercamiador. %uanto mayor sea la concentración de un ion dado en la fase móvil, m5s grupos cargados del intercamiador ocupar5n, desplazando al ion !ue se encuentra en minoría. De lo e4puesto se deriva !ue el p; y la fuerza iónica de los eluyentes son las dos variales e4perimentales a considerar con vistas a controlar el e!uilirio de camio de ion. sí, aumentando la fuerza iónica del eluyente, van disminuyendo los factores fe de todos los solutos retenidos.
intercamiador. En el límite, cuando la fuerza iónica sea muy elevada, todos los solutos tendr5n fe ' e4clusión de la fase estacionaria, por lo !ue no podr5n ser resueltos, pero, si se emplean fuerzas iónicas compatiles con la retención, ser5 posile resolver los distintos solutos sin m5s !ue ir modi1cando la fuerza iónica. En suma, !ue la elución con fuerzas iónicas programadas elución en gradiente, permite al e4perimentador un control 1no de la resolución. De hecho, se pueden separar iopolímeros con muy pocas diferencias en su carga neta ej." resolución de dos proteínas !ue di1eran sólo en uno de sus amino5cidos ionizales. *. plicaciones de la cromatografía de intercam+io iónico
En principio, cual!uier sustancia cargada puede ser cromatogra1ada con un intercamiador iónico. *as resinas intercamiadoras son las m5s Ktiles para las mol3culas org5nicas pe!ueJas y pueden utilizarse incluso para separar iones met5licos p. e., %a 2 de )g2. *as proteínas y los polisac5ridos se separan mejor con los intercamiadores da celulosa, de4trano y poliacrilamida. *os intercamiadores de de4trano y poliacrilamida se han utilizado tami3n e4tensamente en la separación de nucleótidos, amino5cidos y otras mol3culas pe!ueJas de importancia iológica.
@. CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD
*a cromatografía de a1nidad es un tipo de cromatografía !ue utiliza la a1nidad especí1ca entre la sustancia !ue dee aislarse y una mol3cula a la !ue 3sta puede unirse de forma especí1ca un ligando. El material de la columna se sintetiza por unión covalente del ligando !ue puede ser una macromol3culas o una mol3cula pe!ueJa con una matriz insolule. partir de este momento la columna es capaz de adsorer de manera especí1ca, a partir de la disolución, la sustancia !ue va a ser aislada. *a elución se realiza
8
camiando las condiciones, de forma !ue la unión ya no tenga lugar. 9ara poder llevar a cao la cromatografía de a1nidad deen comunicarse varias condiciones" la matriz no dee adsorer por sí misma mol3culas de forma signi1cativaI 2 el ligando dee unirse a la matriz sin alteración de sus propiedades de uniónI @ dee escogerse un ligando cuya unión se fuerte, por!ue aun!ue una unión d3il consiga retrasar la elución puede no resultar adecuada para la separaciónI dee ser posile elución la elución sin destrucción de la muestra. *a matriz m5s Ktil es la agasa ine %hemicals, $nc., deido a !ue presenta una adsorción mínima, mantiene unas uenas propiedades de Lujo despu3s del enlace !uímico con el ligando y tolera los e4tremos de p; y fuerza iónica, así como el cloruro de guanidinio ?) y la urea, !ue se necesitan a menudo para una elución efectiva. Es posile ad!uirir agarosa a la cual est3n unidos covalentemente reactivos !ue puedan enlazar proteínas, memranas y esteroidesI o concavalina , un adsoreI !ue preparado para polisac5ridos y glucoproteínas !ue contengan residuos TNDNmanosilo y aNDN glucosilo p. e., memranas celulares y c3lulas enteras, lo cual es una ayuda adicional. El principal uso de la cromatografía de a1nidad hasta el momento ha sido la puri1cación de proteínas, memranas y polisac5ridos. continuación se indican algunos ejemplos" #uri)cación de enimas:
C
#uri)cación de anticuerpos
romuro de cianógenoN
la !ue se acopla la sustancia transportada p. e., gloulinas !ue enlazan tiro4ina, proteínas !ue enlazan estradiol y receptores de hormonas y drogas. #uri)cación de mem+ranas , partículas 0ue contienen sustancias conocidas *as memranas a las !ue se une una
hormona pueden puri1carse utilizando
utilizando aglutininas unidas a la matriz como concavalina , aglutina del germen de trigo o 1tohemaglutinina. 9or ejemplo, algunas c3lulas tumorales inducidas por virus pueden separarse de las c3lulas normales deido a !ue las c3lulas tumorales se unen con m5s fuerza a la concavalina N
.1 #reparación de la fase estacionaría
*a operación de anclar covalentemente un ligando a una matriz cromatogr51ca consiste 5sicamente en los siguientes pasos" a ctivación de la matriz o soporteI anclaje covalente del ligandoI y c lo!ueo de los grupos reactivos remanentes. En ocasiones, sore todo cuando el ligando es de pe!ueJo tamaJo, su anclaje covalente a la matriz puede dejarlo poco accesile a los solutos !ue
A0
viajan en la fase móvil. En esos casos es conveniente !ue el ligando no se ancle directamente, sino !ue !uede separado de la matriz por un razo espaciador. igura B.2C. En ocasiones, m5s !ue una activación como la comentada, lo !ue se hace es introducir en la matriz grupos funcionales menos reactivos ej." amino o caro4ilo. En esos casos, la formación de un enlace covalente con el ligando en condiciones suaves de reacción, re!uiere el empleo de agentes condensantes del tipo de las carodiimidas >igura B.2C. En el %uadro B.? se muestran los grupos de activación o funcionalización m5s frecuentes en las
A
matrices para cromatografía de a1nidad, así como los tipos de ligandos uniles a cada una de ellas. El anclaje consiste 5sicamente en incuar, ajo agitación suave, la suspensión formada por la matriz activada y una disolución del ligando. esta suspensión se le aJade la carodiimida si se precisa de un agente condensante. *as variales e4perimentales a controlar son, p;, fuerza iónica, temperatura y tiempo de incuaciónI estas dos Kltimas suelen estar inversamente relacionadas ej." para agarosa activada con %Gr, 2N horas a temperatura amiente o B horas en c5mara fría a %. Es imprescindile !ue en la unión covalente del ligando no !ueden involucradas regiones de su mol3cula !ue sean cruciales para la interacción iológica, o !ue, por encontrarse tan pró4imas al centro de interacción, dejen a 3ste inaccesile. )uchas veces, este ojetivo no se consigue, lo !ue impide la realización de este tipo de cromatografías. 'tras veces, para preservar la capacidad de interacción del ligando, se hace preciso reducir su concentración en la mezcla de incuación con la matriz activada. En el mismo sentido suele resultar efectivo traajar con matrices cuya proporción de grupos activos sea reducida, ien por!ue se ad!uieren con un ajo índice de activación, ien por!ue se someten a un proceso previo de desactivación lenta y controlada. %ual!uiera !ue sea la opción, el ojetivo es reducir la e4tensión del anclaje covalente, fundamentalmente para evitar las uniones del ligando por mKltiples sitios. Estas uniones multipunto suelen ser las principales responsales de la inactivación de los ligandos, en especial cuando se trata de ligandos macromoleculares. &erminada la incuación entre el ligando y la matriz cromatogr51ca, se procede a eliminar el e4ceso de ligando y reactivos por decantación o 1ltración del sorenadante, seguido de lavado con lampón.
A2
+stos deen ser eliminados para evitar interacciones inespecí1cas con los solutos de la muestra. 9ara ello se suelen lo!uear con aminas o 5cidos en concentraciones su1cientemente altas 0, a ,0 ). *a incuación con lampones catiónicos asados en &ris, o amónicos asados en 5cido ac3tico, suele ser su1ciente. En esencia, se trata de unir en los sitios remanentes otros ;2 ó %''; distintos a los del ligando. &ras el lo!ueo, un lavado e1ciente, seguido de e!uilirado en el lampón adecuado, dejar5 a la fase estacionaria lista para ser empa!uetada en la columna. .2 plicación de la muestra , elución
9or
regla
general,
el
volumen
de
lecho
cromatogr51co
empa!uetado es el necesario para traajar segKn la modalidad descrita en el apartado B.?.2, o en una modalidad intermedia entre y 2. %uando se emplean fases estacionarias asadas en ligandos especí1cos de grupo %uadro B.B puede ser necesario traajar con columnas m5s largas, a 1n de resolver diferentes solutos del mismo grupo !ue muestren a1nidades parecidas por la fase estacionaria. El lampón de e!uilirado se har5 escogido de forma !ue se favorezca la interacción iológica de inter3s, a la vez !ue se reduzcan al mínimo otras interacciones inespecí1cas. Dada la elevada a1nidad !ue suelen mostrar las mol3culas interaccionantes, lo normal es traajar con fuerzas iónicas relativamente elevadas ej." a%l 0,2 ). /na vez aplicada la muestra, se continuar5 pasando tampón de e!uilirado hasta lavar todos los contaminantes. El Lujo de la columna, durante la aplicación de la muestra y su posterior elución, puede ser una variale crítica en a!uellos casos en !ue las constantes de velocidad de las reacciones de asociación y disociación sean ajas. %on car5cter general, es recomendale emplear Lujos ajos durante la aplicación y la elución, mientras !ue en los lavados se podr5n utilizar Lujos altos.
A@
En ocasiones, la unión del soluto de inter3s es tan fuerte !ue su elución sólo es posile ajo condiciones incompatiles con la funcionalidad iológica, con lo !ue har5 !ue e4cluir el empleo de este tipo de cromatografía. En situaciones menos e4tremas, se podr5 acudir a eluciones especí1cas o inespecí1cas. /na elución especí1ca es la !ue se consigue cuando la fase móvil tiene algKn agente !ue compite por unirse al ligando anclado. %omo ejemplo se puede citar la frecuente utilización de eluyentes asados en αNal!uilglucósidos para la elución de glicoproteínas puri1cadas mediante cromatografía en %on Nagarosa. Este tipo de elución especí1ca ser5 el preferido siempre !ue resulte factile. 'viamente, la columna !uedar5 contaminada por el agente eluyente empleado, pero 3ste se podr5 eliminar por medios m5s dr5sticos, cuando ya la función iológica no sea una limitación. En las eluciones inespecí1cas se suele acudir a alterar la fuerza iónica del eluyente, o el p;, o incluso la temperatura. veces es necesario cominar estos tres recursos, o siendo m5s dr5stico, alterar la conformación del ligando, en caso de !ue 3ste sea macromolecular. %omo Kltima opción, en caso de !ue todo lo anterior fallase, se puede acudir al empleo de agentes caotrópicos ej." H<% o urea, uscando la desnaturalización del sistema iológico. Ello estar5 indicado en los casos en !ue esta desnaturalización sea reversile, o cuando la conformación nativa no sea un re!uisito para los estudios posteriores. En resumen, son pocas las reglas generales sore cómo disminuir la a1nidad entre dos iomol3culas interaccionantes. +ste es un terreno dominado por el empirismo, !ue re!uerir5 tomar en consideración las peculiaridades de cada sistema iológico. 9ara ilustrar lo e4puesto, en la >igura B.@0 se recoge un ejemplo de puri1cación de una proteína inhiidora de una enzima, la cual se utilizó como ligando anclado covalememente. .3 Tipos especiales de cromatografía de a)nidad
A
continuación se descrien tres sistemas cromatogr51cos !ue presentan peculiaridades su1cientes para reciir un tratamiento conceptual diferenciado. %romatografía de a1nidad sore metales inmovilizados. Esta variedad cromatogr51ca no se asa en el concepto de funcionalidad iológica !ue suyace en otras cromatografías de a1nidadI de ahí !ue muchos autores pre1eran engloarla dentro de otros tipos cromatogr51cos, en concreto, dentro del intercamio iónico, en una suvariedad !ue podría llamarse intercamio de ligandos. *o cierto es !ue la denominación !ue a!uí se emplea es la m5s aceptada en Gio!uímica, y justi1ca la areviatura por la !ue tami3n se la conoce" $)% del ingl3s $mmoilized )etal nity %hromatographyI tami3n conocida como )%% de )etal %helate nity %hromatography. %onviene mencionar !ue se trata de una cromatografía indicada para la separación de proteínas. sí, e4plota las propiedades !uelantes de muchas proteínas, capaces de formar compuestos de coordinación con metales de transición ej." %u2, -n2, i2, %o2. igura B.@. El empa!uetado de una matriz de este tipo, seguida del paso de un eluyente conteniendo alguno de los cationes anteriores, deja la columna cargada con el metal de transición. *a posterior aplicación de la muestra conteniendo las proteínas de inter3s se traducir5 en la retención de 3stas, siempre !ue la a1nidad del metal por el grupo !uelante de la matriz sea superior !ue por las proteínas. &al retención se muestra muy dependiente del p;, deiendo
AA
asegurarse un p; en torno a la neutralidad. p; alcalinos los grupos amino de las proteínas se encontrar5n desprotoNnados, convirti3ndose en los principales responsales de la unión al metal. Esta situación ha de evitarse en $)%, ya !ue se trata de favorecer a las histidinas como principales responsales de la interacción. dicionalmente,
como
forma
de
eliminar
interacciones
electrost5ticas inespecí1cas, los lampones de aplicación y lavado suelen tener fuerzas iónicas elevadas 0,AN,0 ) de a%l. *a elución de las proteínas retenidas puede llevarse a cao como en cromatografía de a1nidad, de forma especí1ca o inespecí1ca. En el primer caso, el lampón eluyente ha de contener un agente !ue compita con las protefnas, desplazandoNlasI por ejemplo, imidazol, histamina o glicocola. %on vistas a separar diferentes proteínas se puede emplear un gradiente de concentración de estos agentes, !ue introduzca la selectividad adecuada. El p; del lampón de elución se suele mantener constante a lo largo de todo el proceso. En el caso de elución inespecí1ca, se emplean gradientes de p; decrecientes, !ue ir5n protonando los residuos de histidina. *a selectividad vendr5 entonces determinada por los particulares valores de pH de las histidinas.
AB
aprovecharse para puri1car proteínas recominantes en un solo paso. %romatografía de a1nidad por unión covalente. diferencia de las cromatografías de a1nidad, y en general de interacción, 3sta se caracteriza por la retención de los solutos mediante unión covalente a la fase estacionaria. pesar de ello la reversiilidad de la retención !ueda asegurada, ya !ue se trata de uniones por puentes disulfuro. Gajo condiciones reductoras suaves ej." 2N mercaptoetanol o D&& AN20 m) se puede conseguir la elución. eneralmente, la fase estacionaria est5 constituida por una matriz cromatogr51ca a la !ue se ha anclado covalentemente un grupo tiopropilo o glutation >igura B.@2. Estas columnas est5n indicadas para la puri1cación de proteínas con grupos <;, y en general, compuestos tiólicos. *a aplicación de la muestra ha de llevarse a cao a un Lujo lento, compatile con la cin3tica de formación de puentes disulfuro. %romatografía de a1nidad de c3lulas. *a misma 1losofía !ue se aplica a la cromatografía de a1nidad de mol3culas en disolución, es aplicale a c3lulas en suspensiónI con las limitaciones inherentes a la viailidad celular.
A?
temperatura pueden ser incompatiles con la viailidad de las c3lulas.
. CROMATOGRAFIA DE PENETRA0ILIDAD
+ste es el m5s simple, conceptual y metodológicamente, de todos los tipos de cromatografía. El nomre !ue se le ha dado es una propuesta m5s entre las muchas e4istentesI algunas de ellas son" cromatografía de 1ltración en gel, cromatografía de permeación en gel, cromatografía de tamizado molecular y cromatografía de e4cluN sión por tamaJo. %uando este tipo de cromatografía se lleva a cao en sistemas de alta presión, parece !ue e4iste un consenso en denominarla como cromatografía de e4clusión por tamaJo areviado inalmente, mediante una operación de cria, clasi1can las micropartículas por intervalos de di5metro. En el %uadro B. se detallan los soportes de este tipo
A8
m5s empleados en Gio!uímica, especi1cando el nomre comercial por el !ue normalmente se los conoce. *as micropartículas en !ue est5n divididos estos soportes son esferas formadas por enrejados de 1ras del polímero correspondiente. *os huecos o poros de estos enrejados tendr5n un tamaJo determinado por la concentración de 1ras y su grado de entrecruzamiento. En suma, las micropartículas esf3ricas son como esponjas. Este símil es especialmente v5lido, ya !ue, adem5s de ser huecas, al ponerse en contacto con el agua se hinchan consideralemente. En un lecho cromatogr51co empa!uetado con un soporte de estas características, har5 !ue considerar !ue hay lí!uido, no sólo en los intersticios entre partículas, sino tami3n en el $nterior de las mismas. l arir la salida del eluyente, el lí!uido en los intersticios se desplazar5 con la velocidad de la fase móvil. El lí!uido atrapado por las partículas del gel no, sufrir5 este arrastre, protegido como se encuentra por el entramado de 1ras !ue actKa como matriz de contención. En esencia, este lí!uido internó se comporta como la fase estacionaria en cromatografía de penetrailidad. 9ara formarse una uena idea de la o!uedad de las partículas, asta considerar !ue con ciertos tipos de geles, m5s del 8Ab del lecho empa!uetado es lí!uido. En otras palaras, !ue el volumen ocupado por las 1ras de polímero lo Knico sólido dentro de la columna es muy pe!ueJo en comparación con el volumen total del lecho cromatogr51co >igura B.A. Este volumen total, # &, calculale a partir del di5metro de la columna, , y de la altura del lecho, *, ser5 π
.
Φ
4
2
. L
= V 0 + V i + V g
Donde" #0, volumen de los intersticios entre partículas o volumen de e4clusiónI #, volumen interno de las partículas de gel, o
AC
volumen de fase estacionariaI # g, volumen ocupado por las 1ras del polímero. Dado !ue # g, es consideralemente menor !ue # &, es f5cil intuir la gran esponjosidad de estos geles. En consecuencia, son geles landos !ue sólo pueden emplearse con ajas presiones hidrost5ticas, so pena de colmatación y deterioro de la matriz. En cromatografía de penetrailidad hay !ue camiar un poco los conceptos !ue se venían manejando. sí, no hay !ue considerar !ue la fase estacionaria permanece completamente est5tica durante el proceso cromatogr5fíco. El eluyente puede acceder al interior de las micropartículasI a 1n de cuentas, la composición de la fase estacionaria y el eluyente es la misma. 9ero, este acceso del eluyente al volumen interno, #i, no es la consecuencia del Lujo dictado por la presión hidrost5tica o el omeo perist5ltico. Es la difusión de las mol3culas del eluyente hacia el interior de las partículas del gel la !ue da cuenta de la progresiva renovación de la fase estacionaria. 9or tal motivo, si se pretende desplazar todo el volumen interno o fase estacionaria de un lecho cromatogr51co de este tipo, y para ello se empieza a pasar eluyente, caen dos opciones" o !ue el Lujo de eluyente sea muy r5pido en compaN ración con la velocidad de difusión al interior de las partículas, o !ue sea lento. En este segundo caso, es f5cil ver !ue la renovación completa de la fase estacionaria se har5 producido cuando el volumen de eluyente pasado por la columna sea igual a #0 #i #t donde #, es el símolo empleado para hacer referencia al volumen total de lí!uido contenido en el lecho cromatogr51co. 'viamente, #t # & #g En el caso de !ue el Lujo de eluyente sea muy r5pido en comparación con la difusión de sus mol3culas, puede resultar !ue la cantidad de eluyente necesaria para la renovación completa de la fase estacionaria sea superior a la calculada a partir de B.2@. En la pr5ctica esto no es deseale, y oliga al empleo de Lujos relaN
B0
tivamente ajos, como corresponde a una t3cnica donde la distriución de los solutos en #, viene goernada por la difusión. En efecto, pi3nsese en el caso de un soluto cuyas mol3culas fuesen de un tamaJo tan grande !ue no pudieran penetrar por el entramado de 1ras de las partículas del gel. &ales mol3culas no se distriuirían en asoluto en la fase estacionaria, vi3ndose en todo momento oligadas a viajar por los espacios intersticiales. Esta situación sería radicalmente distinta a la de un soluto de mol3culas tan pe!ueJas !ue no encontraran restricción alguna, no sólo para desplazarse por los espacios intersticiales, sino tampoco para difundir a los espacios internos. En todo momento, la concentración de estas mol3culas pe!ueJas seria la misma dentro y fuera de las partículas, 3sto es, en los volKmenes # 0 y #i. 9ara diferenciar estas dos situaciones e4tremas se suele utilizar el coe1ciente de reparto, K av , de1nido como la proporción del volumen interno !ue le resulta accesile a una mol3cula de soluto"
K av
=
V acc V i
donde #acc es el volumen interior de las partículas de gel al !ue puede acceder un soluto dado. En el caso del soluto de gran tamaJo antes mencionado, # acc 0 K av 0, mientras !ue para el soluto pe!ueJo, # acc #i K av . En la pr5ctica podr5n encontrarse situaciones como las comentadas, o intermedias entre ellas. 9or tanto, con car5cter general, 0 ≤ #acc ≤ #i y 0 ≤ K av . Es f5cil ver !ue el volumen de elución de un soluto vendr5 dado por #e #0 #acc y, de acuerdo con B.2A, #e#0 K av #i El soluto e4cluido de la fase estacionaria K av 0 presentar5 un volumen de elución igual a #0, lo !ue e4plica !ue a este volumen
B
se le conozca como volumen de e4clusión. 9or su parte, un soluto tan pe!ueJo !ue K av , eluir5 con # e #0 #i#t. 9ara geles muy porosos # g # &, y, de acuerdo con la e4presión B.2, se puede asumir !ue # t ≈ # &. *o anterior tiene una inmediata aplicación pr5ctica" en cromatografía de penetrailidad se ha de cumplir !ue, una vez aplicada la muestra, el paso de un volumen de eluyente igual al volumen geom3trico del lecho cromatogr51co, dee traducirse en la elución de todos los solutos presentes en la muestra >igura B.B.
K av
=
V e V t
− V 0 − V 0
!ue permite el c5lculo del coe1ciente de reparto de un soluto cuyo pico de elución se centre en el volumen #, >igura B.?, siempre !ue se conozcan los valores de # 0 y #t. &anto uno como otro dependen de las dimensiones del lecho cromatogr51co, y har5n de ser determinados e4perimentalmente para cada columna. /na vez determinados, se puede asumir !ue sus valores permanecen constantes durante el tiempo de vida Ktil de la columna, con tal de !ue no se produzca ninguna alteración en el empa!uetado, ni deterioro del soporte. 9eriódicamente convendr5 reevaluar # g como forma de asegurar lo anterior. .1 %oe)ciente de reparto , tama-o molecular
En el apartado anterior, para e4plicar las diferencias en los coe1cientes de reparto de diferentes solutos se ha acudido a los conceptos de e4clusión o penetrailidad en relación con el tamaJo
B2
de las mol3culas. /n an5lisis en mayor profundidad oligaría a tratar la penetrailidad como una función, no sólo del tamaJo, sino tami3n de la forma molecular. mos par5metros est5n presentes en lo !ue se conoce como di5metro hidrodin5mico de una mol3cula. 9ara entender el concepto !ue hay detr5s de este par5metro hay !ue recordar !ue las mol3culas en disolución est5n en continuo movimiento traslacional y rotacional. %omo consecuencia de sus r5pidos movimientos rotacionales en las tres direcciones del espacio, las mol3culas se comportan como si ocuparan m5s volumen !ue el de1nido por sus dimensiones geom3tricas. En concreto, ese volumen de inLuencia descrito por el volteo continuo tendría forma esf3rica, cuyo di5metro seria el di5metro hidrodin5mico.
B@
per1l sigmoidal en las representaciones semilogarítmicas de masa molecular frente a K av . >igura B.8 igura B.8. *os v3rtices de esta representación teórica de1nen el llamado intervalo de fraccionamiento de un gel. Es 3sta una propiedad intrínseca de cada gel, !ue depende de cu5l sea el tamaJo promedio de sus poros y la distriución de tamaJo de 3stos. En el %uadro B. se muestran los intervalos de fraccionamiento de soportes comerciales para cromatografía de penetrailidad. En la pr5ctica, los per1les sigmoidales como el de la >igura B.8 tienen una porción central K av 0.2 N 0.8 !ue puede ser considerada lineal. Ello tiene utilidad en la estimación de masas moleculares mediante cromatografía de penetrailidad. .2 Estimación de masas moleculares
*a metodología a seguir es ien sencilla.
B
molecular uscada. El conjunto de operaciones a realizar se resumen en el ejemplo pr5ctico !ue se recoge en la >igura B.C. %on frecuencia, estos an5lisis se llevan a cao sin calcular los valores de K av, sino utilizando en su lugar los cocientes # e#0, o incluso utilizando sólo # e. &al forma de operar oliga a traajar siempre con la misma columna mismo # 0, mismo #t. *a m54ima utilidad de esta evaluación cromatogr51ca de masas moleculares de proteínas se otiene cuando se comina con la correspondiente determinación mediante 9EN
*a cromatografía de penetrailidad presenta una aja capacidad resolutiva. Ello se dee a !ue la difusión es la causa Kltima de la separación, y, por tanto, la difusión a4ial apartado B.A reviste una importancia considerale, !ue se llega a traducir en ensanchamientos de las zonas de elución de hasta diez veces o m5s respecto al tamaJo de la zona de aplicación. >rente a estas desventajas, una gran ventaja de la cromatografía de penetrailidad es !ue impone muy pocas restricciones en cuanto a la composición de la fase móvil. %oncretamente, las Knicas de oligado cumplimiento son las relativas a los p; y temperaturas compatiles con la estailidad del gel. sí, la elución en cromatografía de penetrailidad se suele llevar a cao en condiciones suaves las m5s suaves de entre todos los tipos de cromatografía, lo !ue hace !ue sea la m5s compatile con la preservación del estado conformacional de los iopolímeros. *a selección del soporte y de la longitud del lecho cromatogr51co, vendr5 determinada por la naturaleza del prolema, esto es, por el di5metro hidrodin5mico del soluto !ue se pretende puri1car. 9uesto !ue tales factores no se suelen conocer a priori, puede ser necesario llevar a cao eluciones e4ploratorias, utilizando columnas
BA
cuyo intervalo de fraccionamiento sea muy amplio, y a ser posile caliradas. El per1l de elución !ue se otenga ej." 280 de las fracciones recogidas, en el caso de mezclas de proteínas, informar5 sore la distriución de tamaJo de los componentes en la mezcla prolema. igura B.20. >inalmente, una precaución de tipo pr5ctico a tener en cuenta, no sólo en cromatografía de penetrailidad, sino en todos los tipos de cromatografías, es !ue el eluyente no asora intensamente en el intervalo de longitudes de onda a emplear para la detección y cuantí1cación espectrofotom3trica de los solutos.
.( %riterio de purea
*a forma del pico de elución de un soluto es el primer criterio para valorar la calidad con !ue se ha separado. +sta ha de mostrar un per1l gaussiano sim3trico, como corresponde a una distriución zonal ideal. 9ara un soluto puro, la falta de simetría en su pico de elución indica una aja calidad del empa!uetado. *a asimetría de un pico se suele cuanti1car midiendo la separación de cada rama de la gaussiana respecto al eje central. Esta medida se lleva a cao a una altura, desde la línea ase, del 0b de la altura total.
BB
por lo !ue el per1l de elución !ue engloe sus distriuciones zonales podr5 resultar asim3trico >igura B.2. En el supuesto de !ue casualmente dos solutos no resueltos est3n presentes en la misma concentración, el per1l de elución conjunto podría resultar sim3trico, pero proalemente presentar5 una anchura superior a la esperale. *a cromatografía de penetrailidad proporciona un criterio de pureza negativo m5s severo !ue otros tipos de cromatografía. Ello tiene !ue ver con la ausencia de interacciones entre solutos y fase estacionaria. En el resto de tipos cromatogr51cos, el pico de elución de un soluto puro puede presentar cierta asimetría lo !ue se conoce como caeceo o coleo, !ue puede e4plicarse atendiendo a la dependencia de la interacción solutoNfase estacionaria con la concentración de soluto. %uando esta dependencia es lineal, el per1l de elución suele ser sim3trico y resulta v5lido lo e4puestoI sin emargo, para dependencias no lineales lo !ue suele ocurrir con cierta frecuencia, la asimetría de los picos de elución est5 asegurada, tanto m5s cuanto mayor sea la concentración del soluto en la muestra aplicada. *a conclusión es inmediata, la asimetría de un pico no puede emplearse como criterio para negar la pureza de una muestra, salvo !ue se pueda asegurar una interacción lineal en las cromatografías de adsorción, o cuando se trate de un pico de elución de cromatografías de penetrailidad, donde la adsorción no ha de jugar ningKn papel. nalizar la forma de los picos re!uiere disponer de un registro gr51co, por ejemplo medidas de asorancia del eluido. igura B.22 ilustra la utilidad de estos registros cominados. .* !esalado de muestras. %am+io de disol4ente
B?
/na Ktil aplicación de la cromatografía de penetrailidad en el terreno preparativo es el desalado yo camio de disolvente. !uí, el papel !ue ejerce el gel cromatogr51co no es separar diferentes iopolímeros entre sí, sino separarlos del disolvente o las sales !ue les acompaJen. Determinados geles %uadro B., est5n formados por un entramado de 1ras tan tupido, !ue sólo los solutos de pe!ueJo tamaJo podr5n acceder al # i. %asi cual!uier iopolímero presentar5 un H av 0 en una columna empa!uetada con estos geles.
cuyo
disolvente
sea
un
tampón
salino,
los
iopolímeros eluir5n con # t, mientras !ue las sales H av eluir5n con #t. *os iopolímeros !uedar5n disueltos en la fase móvil en !ue se encontraa e!uilirada la columna en el momento de la aplicación. /n efecto similar de desalado se haría conseguido mediante la cl5sica operación de di5lisis, sólo !ue en 3sta el tiempo re!uerido haría sido mayor. En efecto, la columna cromatogr51ca !ue se ha de emplear para un desalado como el descrito no ha de ser muy larga, pues se trata de separar dos componentes con H av, e4tremos. En la pr5ctica asta con emplear columnas de unos pocos cm, cuya elución se produce en unos pocos minutos AN0 min. /na lógica e4tensión de la aplicación anterior es el camio de disolvente o tampón en el !ue est5 disuelto un iopolímero, o una mezcla de ellos.
. CROMATOGRAFIA HIDROFÓ0ICA
&anto 3sta, como el resto de cromatografías de interacción !ue se comentan en los siguientes apartados, comparten con la
B8
cromatografía de intercamio iónico los mismos planteamientos e4perimentales" retención de los solutos en la columna y posterior elución mediante camios en la composición de los eluyentes. *a interacción hidrofóica no es una interacción en sí misma, sino el resultado de la asociación entre regiones apelares promovida por entornos acuosos. Esta agregación hidrofóica est5 favorecida termodin5micamente por el aumento de entropía !ue supone. En efecto, la solvatación de las super1cies hidrofóicas re!uiere !ue las mol3culas de agua implicadas adopten un orden estricto. l interaccionar las regiones hidrofóicas entre sí, su super1cie e4puesta disminuye, y con ello el nKmero de mol3culas de agua ordenadasI en suma, disminuye el orden gloal. De a!uí se derivan dos conclusiones de importancia pr5ctica" a *a solvatación iónica disminuye el nKmero de mol3culas de agua disponiles para solvatar las super1cies hidrofóicasI la consecuencia es el favorecimiento de las interacciones hidrofóicas por las fuerzas iónicas altas, El car5cter entrópico de las interacciones hidrofóicas, justi1ca !ue se vean favorecidas por aumentos en la temperatura. En una columna de interacción hidrofóica las muestras !ue se apli!uen han de contener iones en su1ciente cantidad para favorecer la retención de los solutos. hora ien, no todos los iones favorecen por igual las interacciones hidrofóicasI incluso, determinados iones las desfavorecen. continuación, se listan diferentes aniones y cationes en orden decreciente de su capacidad favorecedora de las interacciones hidrofóicas" 9'@N <'2N cetato %l N GrN <%N ; H a )g2 %a2 En estas series, los iones m5s a la iz!uierda son los !ue mayor orden inducen en la estructura del agua anticaotrópícos o cosmotrópicos, mientras !ue los de la derecha provocan desorden
BC
caotrópicos.
En cromatografía de interacción hidrofóica, gran parte de las veces, las muestras !ue se aplican proceden de un paso previo de precipitación con sulfato amónicoI de este modo se asegura !ue la muestra se encuentre en condiciones idóneas para su retención. igura B.28. lternativamente se puede acudir al empleo de sales caotrópicas ej." H<%, si ien ello puede conducir a desnaturalizaciones. El empleo de gradientes de p; es otra alternativa. inalmente, la disminución de temperatura tami3n puede emplearse con vistas a favorecer la elución. *as elevadas concentraciones salinas de los eluyentes introducen ciertos inconvenientes en cromatografía hidrofóica. saer" a di1cultad de detección mediante medidas de asorancia en el /#I desviaciones en las líneas 5sales de los cromatogramas por las importantes variaciones en el índice de refracción de los eluyentes al pasar de alta a aja fuerza iónicaI c elevada viscosidad de los eluyentes, !ue se traduce en ensanchamiento de los picos apartado B.AI d ensanchamientos adicionales por camios en los estados de agregación y conformación de los iopolímeros al variar la fuerza iónicaI e necesidad de emplear sales de muy elevada pureza, dadas las elevadísimas concentraciones en !ue se manejan.
?
CAPITULO III ?2
TECNICAS CROMATOGRAFICAS
1. CROMATOGRAFIA PLANA
*a cromatografía plana, la integran un conjunto de tecnicas ampliamente difundidas por la sencillez del e!uipo e4perimental re!uerido, !ue pueden considerarse incluidas dentro de la cromatografía li!uida *% deido a !ue la fase móvil es li!uida. En ella, la fase estacionaria no se encuentra en el interior de una columna sino e4tendido en una super1cie plana y la fase móvil li!uida se desplaza por capilaridad o por adsorción. En función del tipo de super1cie !ue actue como soporte, e pueden distinguir dos tipos fundamentales de cromatografía plana" •
*a cromatografía de papel
•
*a cromatografía en capa 1na
?@
1.1 CROMATOGRAFÍA EN PAPEL
*a cromatografía de reparto puede realizarse en columnas de celulosa. *a cromatografía en papel es una variante de este m3todo, en la !ue el soporte de celulosa adopta la forma de una hoja de papel. *a celulosa contiene una gran cantidad de agua enlazada, incluso cuando ha sufrido procesos de deshidratación. El reparto tiene lugar entre el agua y el disolvente de revelado. menudo este disolvente es tami3n agua, por lo !ue cae preN guntarse si realmente el modo de acción en este caso es por adsorción o no.
M7,o*o #p#)'m#,a( *# (a %)oma,o")a45a # pap#(
compaJando al camio en la forma del soporte de columna a papel tami3n tiene lugar un camio en la metodología. En la cromatografía en papel no hay eLuente y las sustancias se distinguen entre sí por sus posiciones relativas en él papel después de que el disolvente ha recorrido una distancia dada
?
muestra al comienzo de la migración de sus componentes, uno de los factores !ue determina la separación de los componentes es la velocidad de soluilización de los mismos dentro de la fase móvil. Despu3s de !ue el $rente del disolvente haya alcanzado un punto situado cerca del otro e4tremo del papel v3ase la 1gura 8NB, se saca la hoja de la c5mara y se seca. *as manchas, !ue pueden ser visiles o no, se detectan a continuación y se marcan sus posiciones. *a distancia relativa recorrida por una mancha con respecto a la distancia recorrida por el frente del disolvente, se denomina (f . *os valores !ue adopta %$ dependen de la sustancia, del papel y del disolvente utilizado. *os cromatogramas en papel pueden ser revelados por Lujos ascendentes o descendentes del disolvente. En la 1gura 8N? se muestra la disposición e4perimental para cada uno de los dos tipos. ;ay muy poca diferencia en la calidad de los cromatogramas y la elección, por lo general, es cuestión de preferencias personales. *a cromatografía con Lujo descendente tiene dos ventajas" es m5s r5pida deido a !ue la .gravedad ayuda al Lujo. 2 en las separaciones cuantitativas de materiales !ue poseen valores de %$ muy pe!ueJos y !ue, por lo tanto, re!uieren recorridos largos, el disolvente puede recorrer todo el papel. 9resenta la desventaja de !ue el aparato dee montarse con cuidado, ya !ue la e4istencia de suciedad o un mal contacto en la zona en la !ue el papel pasa al otro lado de la varilla soporte, puede ocasionar un Lujo no homog3neo y el susiguiente Lujo acanalado. /na variante muy Ktil es la cromatografía idimensional en papel. En este m3todo, despu3s de haerse realizado la cromatografía en una dirección, se seca el papel y se vuelve a cromatografíar en 5ngulo recto con respecto a la dirección original del Lujo, utilizando un disolvente diferente 1gura 8N8. De esta forma las sustancias
?A
!ue no se separan en el primer disolvente, pueden separarse en el segundo disolvente. D#,#%%': # '*#,'9%a%': *# (as ma%has
*as manchas en los cromatogramas de papel pueden detectarse por su color, Luorescencia, por las reacciones !uímicas !ue tienen lugar tras pulverizar el papel con distintos reactivos, o por la radiactividad de las manchas 1gura 8NC. *a detección de las manchas por medio de la autorradiografía utilizando película de rayos F, se ha descrito en el capítulo B. *a identi1cación se asa, por lo general, en la comparación con est5ndar de %, conocido o por elución. *a elución se realiza recortando la mancha y sumergiendo el papel en el disolvente apropiadoI esto puede hacerse a menudo de una forma cuantitativa. H!#((as
*a%,'(a)#s
!a
ap('%a%':
#sp#%'a(
*#
(a
%)oma,o")a45a # pap#( a( #s,!*'o *# (as p)o,#5as
/n prolema importante de la iología molecular consiste en identi1car una proteína una vez aislada o en identi1car el lugar donde ha camiado un amino5cido en una proteína mutante. *a t3cnica de la _huella dactilar`, desarrollada por #emon $ngram, permite realizar identi1caciones de una forma relativamente sencilla.
*a huella dactilar de una proteína mutante con un Knico camio de amino5cidos se diferencia de la huella de la proteina normal 1gura 8N0.
la proteína se encuentran en la de la proteína G, es proale !ue la proteína sea una parte de la secuencia de amino5cidos de la proteína G. 9or lo tanto, o la proteína G se origina a partir de la por adición de amino5cidos o la proteína aparece por hidrólisis de la proteína G. En general, los estudios de la cin3tica Ode la síntesis de y G permiten distinguir entre estas posiilidades. I*#,'9%a%': *# (os am'oB%'*os 's#),a*os po) *'/#)sos RNA *# ,)as4#)#%'a s!p)#so)#s.
lgunas mutaciones ocasionan una terminación prematura de la secuencia de amino5cidos en las proteínas. &al terminación puede ser revertida por la presencia de mol3culas de t(Nsupresoras. Estas mol3culas insertan un amino5cido en el lugar de terminación y permiten, por lo tanto, la continuación de la síntesis hasta su 1nal natural. El resultado es una proteína con un camio en un amino5cido. *as huellas dactilares de .tales proteínas permiten la
??
identi1cación del amino5cido insertado por cada i uno de los t( supresores conocidos. 'dentifcación de los cambios de bases producidos por mut(genos determinados Deido a !ue se conoce la clave gen3tica, es
posile identi1car los camios de ases !ue producen una mutación en particular.
cromatogr51co &*%, del ingl3s )hin La&er *hromatograph&# se puede considerar como una optimización de Este
modo
la cromatografía en papel. *a idea suyacente es la misma" hacer avanzar, por capilaridad, una fase móvil sore una fase estacionaria plana, de forma !ue los solutos de la muestra aplicada se separen por su diferente %$ El soporte de la fase estacionaria ya no es una estructura 1rosa, como la del papel, sino un sólido pulverizado, el cual se encuentra e4tendido en forma de una 1na capa 0.AN0.A mm de espesor sore una plancha de vidrio, pl5sN tico o metal. 9ara conseguir la cohesión del conjunto, el sólido pulverizado suele incluir un agente cementante, normalmente sulfató c5lcico alcohol polivinLico. En comparación con la cromatografía en papel, las ventajas derivadas del uso de sólidos pulverizados y e4tendidos en capas 1nas son mKltiples %uadro B.2. l traajar con sólidos pulverizados se asegura !ue la super1cie especí1ca m 2g sea muy elevada, y, por tanto, tami3n la interfase de contacto entre fases móvil y estacionaria. Es frecuente traajar con sólidos pulverizados en los !ue el di5metro promedio de las partículas se
?8
sitKa en el intervalo de 0NA µm, con lo !ue se pueden conseguir super1cies especi1cas de hasta 00 m 2g. dem5s, mientras en cromatografía en papel el soporte es normalmente un papel de 1ltro, o lo !ue es lo mismo, las 1ras de celulosa !ue lo forman, en &*% son muchos los sólidos !ue pueden actuar como soporte, una vez pulverizados y e4tendidos" celulosa, poliamida, alKmina o gel de sílice. Este Kltimo, tami3n llamado sílica+gel o sílica, es, con diferencia, el !ue m5s se utiliza.
ase estacionaria 1namente dividido
usencia de estructura 1rosa
E4#%,o
Elevada acción capilar Elevada super1cie de contracto entre fase móvil y fase estacional. (educida dispersión de los solutos en la aplicación de la muestra y durante el desarrollo cromatogr51co.
J#,aKas 4)#,# a (a %)oma,o")a45a # pap#(
)ayor rapidez de desarrollo )ayor e1ciencia cromatografía )ayor sensiilidad en la detección )ayor versatilidad
#5lida cual!uier fase estacionaria !ue pueda ser 1namente dividida.
?C
*a estructura !uímica en la super1cie de estas partículas se caracteriza por presentar grupos silanoles
los
resultados
9ara eliminar este inconveniente, se procede a activar las placas de sílicaNgel antes de la aplicación de la muestra. Esto consiste en someterlas a temperaturas superiores a 00 % durante m5s de una hora. *a aplicación de muestras y el desarrollo cromatogr51co en &*% es algo similar a lo descrito para la cromatografía en papel, con la diferencia de !ue la &*% siempre se desarrolla en sentido ascendente. En el caso de muestras complejas, puede ser difícil o imposile encontrar una Knica fase móvil !ue permita la adecuada separación de todos los solutos. En estos casos se puede acudir a desarrollos idimensionales >igura B.2. &ras emplear una fase móvil en una dirección, se utiliza 'tra para el segundo desarrollo en dirección perpendicular a la del primero. En estos casos la placa ha de secarse antes de proceder al segundo desarrollo cromatogr51co. %uando la &*% se utiliza con 1nes preparativos, los solutos se han de e4traer de la capa 1na despu3s del desarrollo cromatogr51co. Ello es tan simple como raspar la capa 1na normalmente con la 80
punta de una esp5tula en la posición donde se encuentre un soluto !ue se desee e4traer. El polvo, o fase estacionaria, raspado se suspende en algKn disolvente adecuado, con lo !ue el soluto emeido en 3l se disolver5. )ediante una simple 1ltración o centrifugación se dispondr5 de una disolución de tal soluto, separado del resto de contaminantes !ue le acompaJaan en la muestra inicial. 9ara esta utilización de la &*% con 1nes preparativos suele ser deseale cromatogra1ar un volumen de muestra mayor O 200 q$ al !ue se cromatografía en aplicaciones analíticas N0 jid.
8
%on car5cter general, el procedimiento a seguir ser5 el de rociar la placa con un lí!uido !ue provo!ue la reacción de detección. inalmente, conviene recordar !ue si las muestras sometidas a &*% se encuentran marcadas radiactivamente, ser5n de aplicación los m3todos autorradiogr51cos ya descritos %apítulo .
CUADRO < M7,o*os *# D#,#%%': # C)oma,o")a45a *# Capa F'a
M7,o*o
Ap('%a%':
Co(o)
%ompuestos org5nicos
9ardo amarillentoreversil e
$nespecí1co #apores de yodo c.
%ompuestos org5nicos
egro caronización
%ompuestos
82
ina
caronílicos
aranja
g'@';N
%ompuestos caronílicos
)arrón
cido iodoplatínico #erde romocresol inhidrina
Gases de
cidos minas primarias amino5cidos minas secundarias
(odamina ó
*ípidos
9Krpura negro zul viol5ceo )arrón >luorescencia amarillo ros5cea λe4c @BB nm
<. CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA
En este modo cromatogr51co la fase estacionaria se dispone como el relleno de un recipiente cilíndrico, de vidrio, pl5stico o metal, aierto por amos e4tremos, !ue se denomina columna Dicho relleno, tami3n llamado lecho cromatogr(fco, ha de tener una estructura porosa a 1n de !ue pueda Luir la fase móvil. El Lujo estar5 propiciado por la acción de la gravedad cromatografía convencionalI apartado B.A o por sistemas de omeo de alta presión cromatografía lí!uida de alta resoluciónI apartado B.. *a esencia misma de la cromatografía se encuentra en el íntimo contacto entre fase móvil y estacionaria. 9ara conseguirlo es necesario evitar la formación de grietas y acanaladuras en el lecho, ya !ue de e4istir, la fase móvil circularía m5s f5cilmente por ellas, en lugar de por los intersticios entre partículas, disminuyendo el contacto entre fases. *a operación de preparación de un uen lecho cromatogr51co recie el nomre de empaquetado, & es crucial para unos uenos resultados cromaNtogr51cos apartado B.A. l igual !ue en &*% y cromatografía en papel, tami3n en cromatografía en columna lo normal es llevar a cao una aplicación onal de la muestra. En cromatografía en columna esto
8@
se consigue depositando la disolución prolema sore la parte superior del lecho cromatogr51co >igura B.@. /na vez aplicada la muestra, se are la columna por el e4tremo opuesto y se deja !ue la disolución prolema vaya Luyendo hacia el interior del lecho. ntes de !ue la parte superior de 3ste se se!ue, se aporta nueva fase móvil, y así se sigue de modo continuado hasta el 1n del proceso. El ir pasando fase móvil hasta la salida de los solutos se llama elución, y el t3rmino eluido hace referencia a la fase móvil !ue se. recoge desde la aplicación de la muestra hasta la salida de todos los solutos. %on car5cter general, a la fase móvil se la suele llamar tami3n elu&ente En su viaje a trav3s de la fase estacionaria, los solutos no sólo se ir5n separando cromatogr51camente sino !ue tami3n difundir5n, por lo !ue la zona en la !ue viaja cada uno se ir5 ensanchando y sus límites difuminando. De este modo, la distriución de cada soluto en el eluido de la columna ser5 de tipo gaussiano. El perfl de elución, perfl cromatogr(fco o cromatograma es la sucesión de curvas gaussiaNnas !ue informa sore la salida de los diferentes solutos >igura B.. 9ara cada soluto, la posición en el eje de ascisas del correspondiente pico gaussiano, informa sore el tiempo transcurrido desde !ue se aplicó la muestra hasta !ue se produjo la elución de la columna. este tiempo se le llama tiempo de retención, t %
ormalmente, el caudal a-u.o de fase móvil /01 mlmin se mantiene constante durante la elución cromatogr51ca, luego, V R
= F .t R
8
siendo 2 % el volumen de retención, tami3n llamado volumen de elución, 2 e, !ue es el volumen de fase móvil !ue ha de pasar a trav3s de la columna para !ue eluya un soluto dado. /n soluto !ue no sufra retraso alguno por la fase estacionaria soluto a en la >igura B., viajar5 en todo momento con la velocidad de la fase móvil, u 9ara una columna de longitud L el tiempo !ue tarda en eluir este soluto vendr5 dado por" t M
= L u
donde el suíndice 3 hace referencia a la fase )óvil. El volumen de elución de este soluto no retrasado ser5" V M F t M
. .
%on frecuencia t 3 yo 2 3 se designan tami3n como o y 2 4, respectivamente, d5ndoles los nomres de tiempo o volumen de exclusión, pues corresponden a un soluto !ue ni interacciona ni se reparte con la fase estacionaria, esto es, !ue !ueda e4cluido completamente de ella. l volumen 2 3 tami3n se le suele llamar volumen vacio o hueco en ingl3s void volume#, ya !ue corresponde al volumen del lecho cromatogr51co no ocupado por las propias partículas de la fase estacionaria fracción de volumen de lecho cromatogr51co ocupado por la fase móvil. %uando un soluto se encuentra en la fase móvil se desplaza con la velocidad de 3sta, u, pero cuando interacciona o se reparte con la fase estacionaria su velocidad es nula. 9or tanto, se puede a1rmar !ue el tiempo de un soluto es la suma del tiempo durante el cual sus mol3culas viajan en la fase móvil /t 3 #, m5s el tiempo neto !ue permanecen inmóviles en la fase estacionaria t (I tiempo de retención a.ustado#:
8A
= t + t '
t R
M
R
De la anterior e4presión se deduce !ue el tu de un soluto !ue e4perimenta un retraso cromatogr51co soluto b en la >igura B., se calcula como la diferencia entre su tiempo de retención t (, y el tiempo de elución de un soluto no retrasado t ). Este tiempo ajustado da una idea directa de la mayor o menor intensidad de la interacción o reparto del soluto con la fase estacionaria, Onene sentido utilizar este t (, no en t3rminos asolutos, sino referido al tiempo de e4clusión, t ).
'
t R t M
t R =
−
t M
t M
=
k
Este cociente, !ue se designa con la letra 5, recie el nomre de $actor de capacidad, y es característico de cada soluto para unas fases móvil y estacionaria dadas, independientemente de cu5les sean los valores del Lujo, 0, y de la longitud de la columna, L (eordenando la ecuación B.B se llega a
t R
= t (1 + k ) M
o en t3rminos de volumen de eluido, V R
= V m
(1 + k )
8B
En la puesta a punto de un m3todo cromatogr51co, el ojetivo es alcanzar un per1l de elución en el !ue la separación entre los picos cromatogr5fícos de dos solutos, y 2, !ue eluyan uno detr5s de otro, sea óptima. De acuerdo con las ecuaciones B.? y B.8, estas diferencias vendr5n dadas por t R , 2 V R , 2
− t R ,1 =
t M ( k 2
− V R ,1 = V M
−
( k 2
k 1 ) −
k 1 )
donde t(,, t(,2, #(, y # (,2, son los tiemposvolKmenes de retención o elución de los solutos y 2, y 5 6 & M2 son sus respectivos factores de capacidad. %on vistas a la separación efectiva de amos solutos, es preciso asegurar !ue las diferencias entre sus valores de 5 sean adecuadasI pero, adem5s, el ensanchamiento de sus picos cromatogr51cos no ha de ser tan acusado !ue arruine los efectos de una uena separación entre los m54imos. En la >igura B.A se presentan dos situaciones ien distintas en cuanto a separación y anchura de dos picos cromatogr5fícos. El caso representa un resultado cromatogr51co peor !ue el caso GI mientras en este Kltimo los dos picos est5n perfectamente separados, en el caso hay solapamiento entre ellos, lo !ue se pone de mani1esto en !ue no se alcanza la línea asal entre la salida del primer soluto y la del segundo. En de1nitiva, adem5s de la separación entre picos, hay !ue tener en cuenta su anchura. 9ara un par de solutos, y 2, un sistema cromatogr51co proporcionar5 un $actor de separación o selectividad, a, !ue vendr5 dado por α
=
k 2 k 1
( siendo k 2 > k 1 )
)odi1car la separación entre esos dos solutos implicar5, por tanto, la modi1cación en la selectividad de la columnaI en suma, alterar la termodin5mica valores de 5# del sistema. 8?
diferencia de la separación entre picos, la anchura de 3stos no viene determinada por factores termodin5micos, sino por factores cin3ticos apartado B.A. igura. B.A, en comparación con el I y ello, a pesar de su menor selectividad. En t3rminos cualitativos, una columna cromatogr51ca ser5 m5s e1ciente cuantos m5s estrechos sean los picos de elución !ue genere. En cromatografía se utiliza el concepto de plato teórico, para hacer referencia a cada una de las l5minas en !ue OimaginariamenteO se puede considerar dividida una columna cromatogr51ca.
t n= σ R
donde a hace referencia a la desviación est5ndar de la curva gaussiana !ue representa el pico de elución de un soluto >igura B.B.
88
En la pr5ctica, para el c5lculo de n se mide la anchura total del pico gaussiano a la mitad de su altura, lo !ue se conoce como 8h del ingl3s,OXidth at halfNheightO. 9ara un pico gaussiano perfecto, Xh 2.@A +σ con lo !ue la e4presión B. se transforma en
t n = 5.54 w
2
R h
o en t3rminos de volumen,
V n = 5.54 w
2
R h
donde ahora 8,, tami3n se mediría en unidades de volumen. El valor de n es independiente del pico cromatogr51co escogido para su evaluación. %uanto mayor sea el t ( o el 2 %, de un soluto, mayor ser5 la anchura de su pico de eluciónI pero el cociente de amos se mantendr5 constante. *ógicamente, n depende de la longitud de la columna. 9or ello, es frecuente halar de platos teóricos por unidad de longitud de lecho cromatogr51co. lternativamente, se puede especi1car la altura del plato teórico, h, !ue ser5 el resultado de dividir la longitud de la columna, *, por su nKmero de platos teóricos, n" h
= L n
*a altura del plato teórico se e4presa en unidades de longitud generlamente
milímetros
y
su
valor
est5
inversamente
relacionado con la e1ciencia de la colulmna, siendo adem5s
8C
independiente de la longitud del lecho cromatogr51co. Desde un punto de vista pr5ctico, la determinación de n o de h permite tener una medida de la calidad del empa!uetado de una columna. ;asta a!uí se han introducido dos conceptos claves en cromatografíaI selectividad y e1ciencia. *os respectivos par5metros α y n se han de optimizar con vistas a conseguir !ue los diferentes solutos de la mezcla inicial eluyan como picos independientes.
=
t R , 2
1 2
− r ,1 R
( w , 2 + w ,1 ) b
b
Donde X se re1ere a la anchura de los picos guassianos en su ase. El c5lculo de ( < a partir de la e4presión se suele llevar a cao con pares de picos !ue se encuentren relativamente pró4imos en el cromatograma. %ae esperar entonces !ue las respectivas anchuras 8b,6 y 8b,9 sean muy parecidas, por lo !ue la e4presión B.B se puede reducir a
R s
=
t R , 2
− t ,1 R
wb
siendo X la anchura en la ase de cual!uiera de los picos en consideración. sumiendo la forma gaussiana para estos picos, es posile e4presar esta anchura en. función de la desviación est5ndar" wb
=
4.σ
C0
=
t R .2
− t .1 R
4.σ
partir de la anterior es f5cil llegar a la siguiente, sin m5s !ue. considerar las e4presiones B.?, B.CNB. aplicadas al soluto 2, RS
=
n
4
.
k 2
1 + k 2
.
α
−1
α
Dado !ue los dos solutos en consideración eluir5n relativamente pró4imos
M2 ≈ M, la fracción M2l M2 !ue aparece en el
segundo t3rmino de la e4presión anterior podr5 ser reemplazada por 5l/6 5#, siendo 5 el factor de capacidad de cual!uiera de ellos, R S
=
n
4
.
k
1 + k
.
α
−1
α
ueda claro de esta e4presión !ue la resolución cromatogr51ca depende de factores cin3ticos (
n / 4) y
factores termodin5micos
[ k / (1 + k ).(α − 1) / α ]
)ejorar la resolución actuando sore los factores cin3ticos oliga a aumentar el nKmero de platos teóricos de la columna. Dado !ue este nKmero es proporcional a la longitud del lecho cromatogr51co, una posiilidad seria la de aumentar esta longitud.
largos. *a mejor forma de mejorar este factor cin3tico es empa!uetar lo mejor posile el lecho cromatogr51co, y utilizar fases estacionarias con un tamaJo de partícula pe!ueJo y homog3neo apartado B.A. 9or su parte, los factores termodin5micos a considerar son dos, capacidad, MM, y selectividad, αNNα. En cuanto al primero, el margen de maniorailidad es relativamente estrecho. En efecto, 5 puede variar desde ' hasta ∞, sin emargo el cociente MM tiene un valor límite de >igura B.8, y 3ste se alcanza relativamente pronto. sí, utilizar sistemas cromatogr51cos !ue proporcionen valores de fe superiores a 0 no aporta grandes ventajas, y sí considerales inconvenientes en cuanto al alargamiento de los tiempos de elución. inalmente, el t3rmino a N 6#6 a de la e4presión B.2 es el !ue resulta m5s Ktil para mejorar la resolución. El intervalo en !ue normalmente suele encontrarse a es entre y 2, donde correspondería a un par de solutos cuya separación en el correspondiente sistema cromatogr51co sería imposile, mientras !ue en el otro e4tremo α 2, la separación cromatogr51ca sería ciertamente f5cil. %on a variando en el intervalo mencionado, es f5cil ver !ue el t3rmino / α +6#lα puede llegar a variar hasta en tres órdenes de magnitud >igura B.8. )ejorar la relación αN α se limita, en esencia, a encontrar el par fase estacionariafase móvil m5s adecuado. &ami3n 3se es el camino para mejorar en lo posile el otro factor termodin5mico !ue
C2
inLuye en la resolución, MM. En la pr5ctica, la selección de la fase estacionaria est5 muchas veces limitada por el tipo de muestra prolema. En tales casos sólo !ueda como variale la modi1cación de la fase móvil. fortunadamente en %* se puede llevar a cao la elución de los solutos con fases móviles cuya composición !uímica vaya variando durante la propia elución, lo !ue se conoce como elución en gradiente De esta forma se puede ejercer un uen control sore la resolución de dos solutos, al poder modi1car los factores termodin5micos sore la marcha.
. CROMATOGRAFÍA DE GASES
En los tipos de cromatografía de reparto descritos hasta ahora, la muestra es arrastrada por una fase móvil lí!uida sore una fase estacionaria lí!uida, en la !ue el lí!uido est5 inmovilizado por adsorción o asorción a un soporte sólido. En la cromatografía de gases *%, _gasNli!uid chromatography` la fase móvil es un gasI la fase estacionaria es un lí!uido adsorido a la super1cie interna de un tuo o columna /$uncionamiento tubular o capilar# o a un soporte sólido /$uncionamiento en columna empaquetada# como la tierra de diatomeas, &eLon en polvo o 1nas cuentas de vidrio. En general, el lí!uido se aplica como un sólido disuelto en un disolvente vol5til, como el 3ter. 9or ejemplo, las cuentas de vidrio se sumergen en una disolución de polietilenglicol en 3ter. %uando el
3ter
se
evapora,
cada
cuenta
!ueda
recuierta
de
polietilenglicol. la temperatura utilizada para la cromatografía de gases, el polietilenglicol funde y permanece en las cuentas como una película lí!uida. *a muestra, !ue puede ser cual!uier compuesto capaz de ser volatilizado sin sufrir descomposición, se introduce como lí!uido con un gas inerte ^helio, argón o nitrógeno ^ y a continuación se calienta. Esta mezcla gaseosa pasa a trav3s del tuo !ue est5 dispuesto segKn se muestra en la 1gura 8N@.
C@
En el funcionamiento en columna empa!uetada el tuo tiene de a 20 metros de longitud y 0,A cm de di5metro. En el m3todo capilar la longitud es de @0 a 00 metros. 9ara conseguir resoluciones muy elevadas, se utilizan sistemas capilares de dos Milómetros de tuo. *os compuestos vaporizados se redistriuyen continuamente entre la fase móvil gaseosa y la fase estacionaria lí!uida, de acuerdo con sus
coe1cientes
de
reparto
y
son,
en
consecuencia,
cromatogra1ados. l 1nal de la columna se usa un detector apropiado.
D#,#%%': *# s!s,a%'as # #( #!#,#
En el traajo analítico se utilizan, por lo general, tres tipos de detectores" *a c3lula de conductividad t3rmica con una sensiilidad apro4imada de 0 pg, el detector de ionización de argón sensiilidad de 0NA µg y el detector de ionización de llama sensiilidad de apro4imadamente 0N A µg. *a acción de la c3lula de conductividad t3rmica est5 asada en el hecho de !ue la resistencia el3ctrica de un alamre es dependiente de la temperaN tura.
columna similar a un contador de eigerN)ller y es ionizado mediante omardeo con partículas β
CA
%ada uno de los detectores indica la cantidad de material !ue sale de la columna en función del tiempo. o ostante, no hay una indicación directa de la identidadN del material !ue produce un pico concreto ni de la cantidad de 3ste !ue e4iste en el pico. 9or ejemplo, si las sustancias presentes en una mezcla se conocen por adelantado y el propósito de la cromatografía es determinar la cantidad de cada una de ellas, los picos suelen identi1carse preparando una muestra duplicada !ue contenga una pe!ueJa cantidad de una sustancia conocida !ue se ha aJadido, y volviendo a cromatogra1ar.
la
mezcla,
aumentar5
el
tamaJo
del
pico
correspondiente 1gura 8NB.
CB
utilizar un detector no destructivo p. e., la c3lula de conductividad t3rmica. *a determinación cuantitativa de la cantidad de material en un pico no es un procedimiento directo. 9ara cual!uier compuesto, la cantidad de material es directamente proporcional al 5rea del pico. o ostante, la constante de proporcionalidad varía con las sustancias. 9or tanto, lo primero !ue se necesita es identi1car el material !ue se encuentra en un pico determinado. *a cuanti1cación re!uiere la preparación de una curva est5ndarI es decir, deen cromatogra1arse diferentes cantidades de la sustancia y hacer una gr51ca !ue relacione el 5rea del pico con la cantidad de material.
J#,aKas *# (a %)oma,o")a45a *# "as#s
%on la cromatografía de gases se consiguen e4celentes separaciones. *a velocidad y la sensiilidad son e4traordinarias, siendo detectales cantidades del orden de 0 N2 gramos para muchas sustancias. Deido a !ue la rapidez del revelado de los cromatogramas depende de la velocidad de difusión entre las fases móvil y estacionaria, y deido a !ue la velocidad de difusión de los gases es mucho mayor !ue la de los lí!uidos, el cromatograma de gases puede ser realizado unas mil veces m5s r5pido !ue el e!uivalente en la cromatografía lí!uida en columna. 9or consiguiente, las separaciones pueden otenerse, con frecuencia, en menos de un minuto. dem5s, utilizando un detector no destructivo y condensando la muestra en la recogida 1nal, es posile utilizar la cromatografía de gases deN forma preparativa. *os instrumentos de preparación en masa pueden puri1car cantidades importantes del material !ue se est5 tratando, hasta llegar a gramos. *a cromatografía de gases puede utilizarse con cual!uier sustancia !ue pueda volatilizarse. 9or lo tanto, hay miles de compuestos C?
org5nicos !ue pueden separarse con este tipo de cromatografía. *as sustancias no vol5tiles pueden e4aminarse, si es posile, convirti3ndolas en derivados vol5tiles por o4idación, acilación, al!uilación u otros procesos.
. CROMATOGRAFÍA DE LÍUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN HPLC
En una primera etapa, la cromatografía de lí!uidos se realizaa en columnas de vidrio con di5metros comprendidos entre y A cm. y C8
longitudes entre A0 y A00 cm. *os tiempos de separación de las distintas muestras, eran largos y frecuentemente duraan varias horas. *os primeros intentos para acelerar el procedimiento cl5sico mediante la aplicación de vacio o por omeo, no resultaron efectivo. *os avances tecnológicos de los Kltimos aJos han permitido poner en funcionamiento una serie de m3todos cromatogr51cos para los !ue se emplea la denominación de cromatografía de lí!uidos de alta resolución ;9*%!ue son los m5s utilizados en la actualidad, y se caracterizan por"
9or ser utilizados para sustancia de gran inter3s en la industri, en muchos campos de la ciencia, etc.
*a cromatografía de lí!uidos de alta resolución, puede ser utilizada como m3todo d e separación de sustancias tan variadas como"
-
9la!uicidas ;idrocaruros.
N cidos nucleicos. N zKcares.
-
mino5cidos.
N Drogas.
-
9roteínas.
&erpenoides.
-
Es una %romatografía de alta presión es decir se aplica el Lujo a presión entre A00 a 2200 psi. El tamaJo de partícula es entre @ y 0 micras, la longitud de la columna es entre A y 2A cm. y re!uiere de e!uipo so1sticado.
CC
permite la aplicación de la muestra. la salida de la columna se coloca un detector generalmente de asorción ultravioleta o de Luorescencia y si se desea recuperar las mol3culas !ue eluyen de la columna, se re!uiere un colector. En los sistemas modernos el an5lisis de la información otenida se realizan mediante una computadora acoplada al e!uipoI lo !ue permite estandarizar la cromatografía, identi1car la naturaleza los picos eluídos y cuanti1car su contenido. *os picos se relacionan segKn su Otiempo de retenciónO con est5ndares, !ue permiten identi1car los amino5cidos presentes en la mezcla. *a cantidad relativa de cada uno de ellos se determina calculando el 5rea la curva del pico correspondiente.
00
CAPITULO IJ 0
FUNDAMENTO TEÓRICO *a cromatografía es la t3cnica !ue separa una mezcla de solutos asada en la velocidad de desplazamiento diferencial de los mismos !ue se estalece al ser arrastrados por una fase móvil li!uida o gaseosa a trav3s de un lecho cromatogr51co !ue contiene la fase estacionaria, la cual puede ser sólida o lí!uida. ;ay !ue indicar !ue el nomre de la t3cnica es incorrecto, ya !ue no consiste en escriir con colores. Este nomre proviene de la primera e4periencia cromatogr51ca realizada, la cual se utilizo para separar pigmentos coloreados de plantas. *a cromatografía fue descuierta por el ot5nico ruso de origen italiano )ijail &sXett en C0@. &sXett separo los pigmentos de las plantas cloro1la vertiendo e4tracto de hojas verde en 3ter de petróleo sore una columna de caronato de calcio en polvo en el interior de una proeta. o ostante, no e4isten datos sore la utilización de esta t3cnica hasta C@0 cuando Mhun y *ederer separaron tami3n pigmentos de las plantas usando como adsorentes alKmina y caronato de calcio. >ue a partir de ahí cuando se inicio el verdadero desarrollo de la cromatogra1a. 9ara e4plicar el fenómeno cromatogr51co es necesario estalecer dos tipos de fundamento" uno remoto y otro pró4imo F!*am#,o )#mo,o Este fundamento se encuentra en alguna o
algunas propiedades físicas o físico !uímicas de los analitos" soluilidad, adsorción tendencia a ser retenidos en sólidos 1namente 02
divididos, volatilidad, tamaJo, carga, reactividad !uímica o io!uímica, etc. *a mezcla de sustancias a separar se coloca en una situación e4perimental din5mica donde e4hien dos de estas propiedades, o ien una de ellas pero por duplicado tal como la soluilidad en dos lí!uidos diferentes como ocurre en cromatografía li!uido N li!uido. Deen cumplirse las condiciones siguientes" N *os componentes de los sistemas empleados deen estar en intimo contacto entre si. N El e!uilirio estalecido entre esos componentes dee ser lo mas completo posile. F!*am#,o p):'mo
improale !ue dos especies presenten cuantitativamente el mismo par de propiedades físicas o físico N !uímicas frente a un sistema cromatogr51co dado. 9or tanto, en estas diferencias, !ue pueden ser muy pe!ueJas, se asa la separación cromatogr51ca.
0@
cromatogr51ca concreta depender5 de la naturaleza y cantidad de la muestra, del ojetivo de la separación y de las limitaciones del tiempo y e!uipo ase!uile. 9uede hacerse una primera distinción entre las t3cnicas cromatogr51cas atendiendo a la integración continua o no del sistema de detección. sí, la cromatogra1a no conlleva a un sistema de detección, mientras !ue cual!uier cromatógrafo de lí!uidos o gases lleva incorporado dicho sistema siendo, por tanto, aut3nticos instrumentos.
IMPORTANCIA DE LA COMATOGRAFÍA
9uri1cación de la penicilina.
9uri1cación de las proteínas terapeKticas.
*a t3cnica cromatogr51ca con un enfo!ue al 5rea clínica nos sirve para identi1car acterias mediante la comparación otenida del cromatograma otenido con un patrón predispuesto, para identi1car distintos tipos de" amino5cidos, proteínas, nucleótidos,
hemogloina, esteroides etc.
0
En la producción sint3tica de acetaminofen, identi1cación de la imina de la Nacetilenzo!uinona. $denti1cación de levoNalfaNacido aminoadipico, durante la iosintesis de penicilina.
$denti1cación de 8Nnitroiso!uinolina, durante la síntesis de %iproLo4acina, un antiiótico.
APLICACIONES AL ANLISIS DE ALIMENTOS
Cos#)/a,#s a,'o'*a,#s se usa el gradiente de ;9*%
con un detector colorim3trico para medir simult5neamente los nueve antio4idantes m5s comunes.
AB('s's *# %a)&oh'*)a,os # &#&'*as la adición de mono y
disac5ridos a eidas y zumos sirve como propósito de enri!uecer el saor. 9ara determinar si la cantidad aJadida es correcta se miden los azucares usando ;9*% de intercamio
iónico con detección de pulso amperom3trico con detectores de refracción o ultravioletas. Is:m#)os *# %a)o,#o'*#s" el ;9*% en cominación con detectores calorim3tricos permite el an5lisis de los carotenoides diet3ticos en tejidos animales y vegetales. 0A
F(a/oo'*#s y 4#o(#s" en el vino la medición de estas
sustancias permite la determinación del color, la edad y las variedades de uva usadas. El ;9*% en cominación con
colorímetros, permiten la determinación de hasta 22 compuestos diferentes simult5neamente. L5p'*os la determinación de lípidos animales y vegetales como" colesterol, triglic3ridos, glic3ridos y esteroles, se asa en el uso del ;9*% y un detector de Dispersión de *uz Evaporativa E*<.
A%'*os ('po'%o y B%'*o *'h'*)o('po'%o # s!p(#m#,os a('m#,'%'os aun en estudio pero su detección cominando
;9*% con detectores colorim3tricos es importante ya !ue estos dos compuestos parecen importantes como antio4idantes y reguladores del ciclo celular.
M#*'%':
*#
!,)'#,#s
('poso(!&(#s
#
,a&(#,as
m!(,'/',am5'%as el uso del ;9*% permite la detección de
mKltiples vitaminas neonatos.
en
alimentos
suplementarios
para
;H'*)o'o#a( y o,)os a(*#h5*os se forman como
resultado de pero4idación de lípidos, durante la cocción o podredumre.
S!)4a%,a,#s o ':'%os la detección de estas sustancias es
crucial puesto !ue est5n altamente reguladas deido a prolemas medioamientales, se usa ;9*% cominado con dispersión de luz evaporativa.
Ca)&oh'*)a,os s'mp(#s usar ;9*% con E*
necesidad de usar ases fuertes o alto p;, convirti3ndose en un m3todo no destructivo.
Ca,#6!'as *#( ,7 las cate!uinas son Lavonoles del t3,
posilemente anticancerígenos.
0B
T)'"('%7)'*os ;9*% con E*
caracterización de todos los tipos de triglic3ridos. Co,am'a,#s ,)'p,:4aos el ;9*% con E*
APLICACIONES GENERALES
plicaciones de la cromatografía de reparto en productos de alimentación " edulcorantes arti1ciales, antio4idantes, aLato4inas, aditivos, colorantes, amino5cidos, proteínas, carohidratos, lípidos.
0?
plicaciones de la cromatografía iónica " el an5lisis de drogas y
sus metaolitos, sueros, conservantes de alimentos, mezclas para vitaminas, azKcares, y preparaciones farmac3uticas. plicaciones referidas a productos alimenticios en
cromatografía por e4clusión de tamaJos" separación de 5cidos grasos, determinación de glucosa fructosa y sacarosa en zumos enlatados. plicaciones de *a cromatografía de ases.
las siguientes aplicaciones o ejemplos" •
"minas arom(ticas heterocíclicas /;""# $ormadas durante la cocción de alimentos proteicos /carne & pescados# Donde estos
compuestos son mutag3nicos potentes ien conocidos y algunos de ellos son carcinógenos.
*ontrol de los procesos de destilado de aguardientes a escala industrial"
fase gaseosa a!uellos componentes !ue de1nen la calidad 5sica de los orujos y cuyo control e4ige la administración" grado alcohólico, acidez total, acetato de etilo, metanol, acetaldehido, acetal y alcoholes superiores. •
•
haciendo uso de ;9*% inversa y %. Estudio de vinos monovarietales
•
%aracterización de avellanas por su composición en (cidos grasos .
•
$denti1cación d compuestos vol(tiles en granos de cacao.
08
•
Determinación del perfl del (cido graso, acide & valor del peróxido en la calidad del aceite de oliva contra el almacena.e.
•
Determinación cuali y cuantitativa de componentes vol(tiles en hierbas & especias
•
•
n5lisis de compuestos terpénicos de la uva de la variedad
•
alariJo. Estudio de compuestos au$rados vol(tiles pesados es vinos tintos de la denominación de origen rieira sacra.
CONCLUSIONES 0C
0
ANEQOS CROMATOGRAFIA DE REPARTICION
F'"!)a ;=
F'"!)a ;
CROMATOGRAFIA EN GEL
F'"!)a ;1
F'"!)a ;
2
F'"!)a ;<<
CROMATOGRAFÍA DE INTERCAM0IO IONICO
@
CROMATOGRAFIA CROMATOGRAFIA DE PENETRA0ILIDAD
A
GLOSARIO
B
%romatografía5 *a cromatografía es un m3todo físico de
separación en el !ue los componentes a separar se distriuyen entre dos fases, una de las cuales est5 en reposo fase estacionaria mientras !ue la otra fase móvil se mueve en una dirección de1nida.
%romatógrafo5 El instrumento empleado para realizar una
separación cromatogr51ca.
%romatógrama5 /na gr51ca u otro tipo de presentación de la
respuesta de un detector, la concentración de un analito en el eLuente u otra magnitud usada como medida de la concentración en el eLuente, frente al volumen de eLuente o al tiempo. En la cromatografía plana, OcromatógramaO OcromatógramaO puede referirse al papel o capa con las zonas separadas.
Fase "igada5 "i gada5 /na fase estacionaria !ue est5 unida de forma
covalente a las partículas de soporte o a la pared interior de la columna.
Fase Inmo4iliada5 /na fase estacionaria !ue est5
inmovilizada sore las partículas del soporte o sore la pared interior de la columna, por ejemplo por polimerización in situ entrecruzamiento entrecruzamiento !uímico tras un recurimiento.
Fase Mó4i5 >luido !ue se 1ltra a trav3s o a lo largo del lecho
estacionario, en una dirección de1nida. 9uede ser un lí!uido %romatografía %romatografía *í!uida, un gas %romatografía %romatografía de ases o un Luido supercrítico %romatografía con >luido
?
Eluir5 plicar la cromatografía de elución. El proceso de elución
se puede detener mientras todos los componentes de la muestra est5n aKn en el lecho cromatogr51co, o continuarse hasta !ue lo hayan aandonado. ota"
E6uente5 *a fase móvil !ue aandona la columna.
Muestra5 )ezcla consistente en cierto nKmero de
componentes, cuya separación se pretende en el lecho cromatogr51co al ser arrastrados o eluidos por la fase móvil.
%omponentes de la Muestra5 *os constituyentes
!uímicamente puros de la muestra. 9ueden no ser retenidos por la fase estacionaria es decir, no retardados, retenidos parcialmente es decir, eluidos a tiempos diferentes o retenidos permanentemente.
Soluto 5 &3rmino !ue se re1ere a los componentes de la
muestra en la cromatografía de reparto.
!isol4ente5 &3rmino !ue en ocasiones se re1ere a la fase
estacionaria lí!uida en la cromatografía de reparto.
dsor+ente fase estacionaria en la %. de adsorción y de
reparto.
dsorción5 Es la retención de una especie !uímica en los sitios
activos de la 8
super1cie de un sólido, !uedando limitado el fenómeno a la super1cie !ue separa las fases o super1cie interfacial, esta retención super1cial puede ser física o !uímica.
%. en fase in4ersa5 %. con una fase estacionaria no polar y
una fase móvil polar.
%. en fase normal %. con una fase estacionaria polar y una
fase móvil no polar.
Elución5 9roceso de e4traer un soluto de la fase estacionaria.
Elu,ente *a fase móvil una vez !ue se e4trae de la columna.
$rigen *ugar físico donde se coloca la muestra al principio.
'e4elado5 9roceso de separar un soluto de la muestra por
medio de cromatografía.
Soporte5 El material sólido inerte !ue en la %romatografía de
reparto sirve para sostener la fase estacionaria lí!uida en su sitio.
Sor+ente %ual!uier fase estacionaria.
%ontraión5 &ermino usado en ;9*%, cromatografía iónica, /n
contraión es un ión !ue se comina con el ión analito para formar una pareja de iones, !ue es una especie neutra !ue es retenida por el relleno de la fase inversa.
Efecti4idad o selecti4idad de una columna cromatogr7)ca5
las especies a separar se eluyen a velocidades relativas C
su1cientemente diferentes los picos est5n su1cientemente separados.
E)cacia de una columna cromatogr7)ca5
columna es tanto m5s e1caz cuanto menos sea el ensanchamiento de los picos. *a e1cacia ser5 mayor cuanto m5s pe!ueJa sea la altura de plato y mayor sea el nKmero de platos.
'esolución de una columna5 9ar5metro !ue proporciona una
medida cuantitativa de su capacidad para separar dos solutos. Dee ser mayor a ,A para !ue se considere uena.
Tiempo de retención58 tr 9 Es el tiempo entre la inyección de
una muestra y la aparición de un pico de soluto en el detector de una columna cromatogr51ca.
Tiempo muerto5 8 tm 9 Es el tiempo !ue tarda en salir de la
columna una sustancia no retenida.
20
0I0LIOGRAFÍA
DOCON NAJAA$ Ca)m# GARCÍA SAAJEDRA$ 2os7 JICENTE GARCÍA$
2os7$
0=><"3?>)@S
A
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B'@C=D3'*@$ 1>>> Pa)a'4o$ Espaa.
GARCÍA SEGURA$ 2!a Ma!#( G. GAJILANE$ 2os7 MARTINE DEL
POO$
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MONTERO$
F)a%'s%o
OADERRA$
M#)%#*#s JIJANCO$ F#)a*o. )E*>'*"S '>S)%=3?>)"L?S FL'S'S ?> B'@C=D3'*" , 1>>> S5,#s's$ S.A. Espaa
GARRIDO MALO$ ?L L"B@%")@%'@ B'@C=D3'*@ *'?>)D0'*@ .
2
