DETERMINACIÓN DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS OBJETIVO
Aprender a determinar el Microorganismos de Staphylococcus aureus Explicar el fundamento de todas las etapas del método de detección de Staphylococcus aureus en alimentos.
FUNDAMENTOS Se basa en determinar la deficiente manipulación de los alimentos a través del número de Staphylococcus aureus presentes causantes de toxinas.
MARCO TEORICO Los Staphylococcus son cocos anaerobios facultativos, son Gram positivos y se presentan solos, en pares o racimos, no son móviles, ni esporulados; algunos biotipos son capaces de producir una toxina altamente termoestable, así por ejemplo, Staphylococcus aureus produce 5 toxinas, que pueden provocar severas intoxicaciones en el hombre. Su metabolismo es oxidativo/fermentativo, es catalasa-positivo y puede metabolizar una gran variedad de carbohidratos en condiciones aeróbicas, con la subsecuente liberación de ácido, principalmente ácido acético con pequeñas cantidades de bióxido de carbono; en condiciones anaerobias, el producto principal de la fermentación es el ácido láctico. Las tres condiciones necesarias para su óptimo desarrollo son: pH cercano a la neutralidad, temperatura alrededor de 30 °C y ausencia de microorganismos competitivos. Este último punto es importante, ya que Staphylococcus aureus no es competitivo en presencia de otros microorganismos. Staphylococcus se puede encontrar en a) medio ambiente como puede ser: aire, polvo, superficies en donde se manejan alimentos, agua, agua residual, b) en alimentos: por ejemplo los que presentan un alto contenido proteico, como puede ser la leche y derivados lácteos, también se desarrolla en aquellos alimentos que presentan altas concentraciones de sal, uno de ellos sería el jamón; otro factor importante en los alimentos es el pH, así tenemos en el caso de la mayonesa, ésta tiene un pH lo suficientemente bajo para inhibir el desarrollo de S. aureus, sin embargo, al diluirse y neutralizarse en una ensalada por ejemplo, el pH asciende lo suficiente como para permitir el desarrollo de este microorganismo enterotoxigénico y finalmente c) también se puede localizar en personas y animales. Estos últimos, los animales y las personas son los principales reservorios de estos microorganismos.
Con respecto a las condiciones ambientales, los alimentos son susceptibles a una contaminación pos proceso con tipos enterotoxigénicos de Staphylococcus aureus, por ejemplo, si son sometidos a un inadecuado manejo o bien a temperaturas de conservación inapropiadas; este problema se acentúa por la ausencia de flora competitiva, que normalmente restringe el desarrollo de este microorganismo El crecimiento de Staphylococcus aureus en alimentos, tiene gran importancia por tratarse de un microorganismo capaz de producir una poderosa enterotoxina, que al ingerirse causa intoxicaciones severas al hombre. Como se mencionó con anterioridad son 5 enterotoxinas: A, B, C, D y E, siendo la “A” la más nociva
Los alimentos contaminados con esta cantidad de bacterias, no presentan ninguna diferencia perceptible en cuanto a su apariencia, sabor y olor, por lo que no se distinguen de los alimentos que no están contaminados con este microorganismo, por esta razón el peligro de ingerir alimentos contaminados con Staphylococcus aureus sin darse cuenta es alto. Los alimentos sometidos a intensa manipulación durante su preparación y que se mantienen a temperaturas de riesgo (por encima de 7.2 °C y por debajo de 60 °C) después de su preparación, son los alimentos más involucrados en la intoxicación estafilocóccica. Los alimentos perecederos tales como carnes crudas y procesadas, ensaladas, productos de pastelería, como pasteles rellenos con crema, pies de crema, coberturas de chocolate, leche y sus derivados, rellenos para sándwiches y papas, son los más comúnmente asociados con intoxicaciones estafilocóccicas. En los humanos, las cepas de Staphylococcus habitan en forma específica en el tracto nasofaríngeo, cabello y piel del 50% o más de los individuos, sin causar daño aparente (portadores asintomáticos), pudiendo transferirse de los dedos y manos a los alimentos y desarrollarse con rapidez en ellos. La especie aureus, es la considerada patógena dentro del género Staphylococcus y está comúnmente asociado a casos de artritis, osteomielitis, meningitis, neumonía y en algunos casos puede llegar a ocasionar pérdida del conocimiento. Las cepas de este microorganismo que producen enzimas extracelulares y toxinas, son las más importantes por ser causante de intoxicaciones alimentarias. El establecimiento de los síntomas de la intoxicación, por lo general se presentan rápidamente y en muchos casos de forma aguda, aunque depende de: la susceptibilidad de la persona hacia la toxina, la cantidad consumida del alimento contaminado, la cantidad de toxina en el mismo y en general la salud del individuo. Los síntomas más comunes de intoxicación consisten en náusea, vómito, dolor o espasmos abdominales y postración. Sin embargo, existen algunos individuos que pueden no manifestar todos estos síntomas asociados a la enfermedad. En casos más severos, se puede presentar dolor de cabeza, calambres musculares así como cambios intermitentes en la presión sanguínea y pulso. La recuperación parcial se alcanza a los 2 días, sin embargo la recuperación completa puede durar más días en casos muy severos. El término Staphylococcus coagulasa-positivo se utiliza para describir aquellas cepas que secretan una enzima que provoca coagulación del fibrinógeno sanguíneo, utilizando el microorganismo esta capacidad contra la fagocitosis y otros mecanismos de defensa del huésped. Esta reacción se utiliza in vitro para la identificación de cepas de Staphylococcus productoras de toxinas, mediante el uso de plasma. Algunas razones para determinar Staphylococcus aureus son: Confirmar la presencia de este microorganismo como agente causal de intoxicaciones. Determinar si un alimento o ingrediente de los mismos, es fuente potencial de este microorganismo enterotoxigénico.
PARTE EXPERIMENTAL MATERIAL Y EQUIPO
Pipetas graduadas estériles de 1 ml con tapón de algodón Pipetas Pasteur estériles Placas Petri Espátula de drigalsky Solución salina peptonada Agar Baird Parker
Utensilios estériles para manipular las muestras: cuchillos, c ucharas, pinzas, tijeras, espátulas Vaso de licuadora estéril Motor para licuadora Balanza Incubadora a 37 °C
Muestra QUESO SALADO
TÉCNICA SIEMBRA DIRECTA EN PLACAS DE AGAR DE BAIRD PARKER
Preparar la muestra de alimento para las diluciones Añadir el agar de Baird- Parker (previamente se le agregado solución de telurito de potasio y solución de yema de huevo) Transferir un 1 ml del homogeneizado y de sus diluciones a la superficie del medio contenido en placas independientes y extender el inóculo con ayuda de las varillas de vidrio Incubar las placas en posición invertida a 37 °C durante 30 horas a 48 horas Pasados las primeras 30 horas de incubación, elegir las placas que contenga entre 20 a 200 colonias aisladas y contar todas las colonias negras y brillantes de margen estrecho y blanco rodeadas de áreas claras que se extiende en el medio opaco. La probalidad de que estas colonias corresponda a S aureus es muy elevada. Marcar la posición de estas colonias e incubar las placas por 18 horas Una vez finalizado el segundo periodo de incubación (48 horas), contar todas las colonias que presenten el aspecto mencionado y también aquellas cuyo color sea negro brillante con o sin margen estrecho blanco y que no presenten el área de aclaramiento Realizar la lectura mediante el contaje en placa con el contador de colonias y multiplicar por su factor de dilución
Homogenizar con 450 ml S.S.P de diluyente
9 ml S.S.P
Pesar 50 g de muestra en condiciones de ase sia
0.1 ml
−
0.1 ml
0.1 ml
−
−
Incubar a 37 °C por 30 horas a 48 horas Extender el inoculo con ayuda de la espátula Drigalsky
PARTE EXPERIMENTAL
RESULTADOS Muestra: queso salado Dilución
N° de colonias
Ufc/g
-2 (Fig.1)
0
<10 Ufc/g
10-3 (Fig. 2)
0
<10 Ufc/g
10
9 ml S.S.P
9 ml S.S.P
10
-4 (Fig.3)
−
0
<10 Ufc/g
−
−
En la determinacion de determinación de Staphylococcus aureus nuestro resultados salió negativos en todas nuestras placas Petri y está en el rango de <10 Ufc/g
DISCUSIONES
La presencia de S. aureus en queso y en los alimentos en general, debe interpretarse desde diferentes puntos de vista. Por un lado, se ha señalado la existencia de una relación directa entre el número de unidades formadoras de colonias por gramo o mililitro de producto y la probabilidad inminente de la presencia de alguna de sus enterotoxinas. Por otro lado, se ha indicado que un número elevado de microorganismos, aunque es indicativo de una manipulación deficiente, no es suficiente para vincular el producto con el riesgo de una intoxicación alimentaria y debe demostrarse su capacidad para producir enterotoxinas .Por razones obvias, los límites microbiológicos máximos permitidos, deben estar por debajo de los valores antes indicados a los fines de asegurar un producto inocuo, evitando así la posibilidad de su multiplicación, durante la distribución y comercialización del queso.
Para determinar el número de S. aureus enterotoxigénico presentes en 1.0 g de alimento se deben de considerar: a) el número total de colonias sospechosas y caracterizadas en el agar Baird Parker y b) el número de colonias que resultaron positivas en las pruebas bioquímicas efectuadas.
CONCLUSIONES En la determinación de la muestras tiene relativamente bajo de S. aureus, unido a las características de humedad del producto y a la deficiente manipulación durante su comercialización, convierten al queso analizado, en un vehículo de alto para la salud de los consumidores, ya que está libre de microorganismo enteropatógenos. Se determinó que la muestra queso salado tiene una calidad sanitaria por lo cual no permite la presencia de microorganismo enteropatógenos En la determinacion de determinación de Staphylococcus aureus nuestro resultados salió negativos en todas nuestras placas Petri y está en el rango de <10 Ufc/g
BIBLIOGRAFÍA
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Instituto Panamericano de Protección de Alimentos y Zoonosis – Organización Panamericana de la Salud ( INPPAZ-OPS/OMS). 1997. Vigilancia de las Enfermedades Transmitias por Alimentos ( ETA) en Latinoamérica y el Caribe.1995-1997.
