UNIVERSIDAD NACIONAL “PEDRO RUIZ GALLO”
Numeración de Staphylococcus aureus MICROBIOLOGIA DE LOS ALIMENTOS I DOCENTE: DOCENTE: AL BINO CORNEJO, CORNEJO, GRACIELA GRA CIELA ALUMNA: ORTIZ BACA, RUBI SUGGEY
Numeración de Staphylococcus aureus
PRÁCTICA Nº 9 NUMERACION DE Staphylococcus aureus
I.
INTRODUCCION Staphylococcus aureus , es una especie bacteriana integrada por formas cocaceas de 0.8-1.0 µm de diámetro, que se dividen en más de un plano, por lo que se agrupan irregularmente en racimos.
S. aureus , es un microorganismo Gram (+), anaerobio facultativo y se halla ampliamente distribuido en carnes, leches, quesos y ambientes naturales como suelo, polvo, aire, etc. Es altamente vulnerable a la destrucción por tratamiento térmico y a casi todos los agentes sanitizantes. Así la presencia de esta bacteria o sus
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enterotoxinas”
en alimentos procesados
o en equipos de procesamiento de alimentos generalmente es un indicador de una sanidad deficiente.
Los alimentos se examinan para determinar la presencia de S. aureus a fin de confirmar que éste es el agente causante de enfermedades transmitidas por alimentos. Las conclusiones deben de tratarse con mucho cuidado. La presencia de una gran cantidad de S. aureus en los alimentos puede indicar una manipulación o condiciones sanitarias deficientes. Sin embargo, no es suficiente evidencia para aseverar que un alimento sea la causa de envenenamiento. Se debe demostrar que S. aureus aislado produce enterotoxinas. Las cepas del género Staphylococcus que producen intoxicación alimentaria pertenecen a la especie Staphylococcus aureus , casi todas las cepas de esta especie elaboran una enzima denominada coagulasa, de allí que una de las principales pruebas para determinar la presencia de esta bacteria es la coagulasa utilizando plasma de conejo.
La presencia en los alimentos de números mayores de 10 4 células de S.aureus por enterotoxina
gramo, (1ng/g)
pueden de
forma
producir que
cantidades
desencadenen
suficientes intoxicación
de por
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Numeración de Staphylococcus aureus
estafilococos en los consumidores. Los alimentos cocidos, cuando se vuelven a contaminar mediante una manipulación inadecuada, promueven la fácil multiplicación de S. aureus, especialmente a la escasa competencia microbiana que resulta de la cocción. Los alimentos producidos o almacenados de forma inapropiada han estado vinculados frecuentemente con brotes de intoxicación por estafilococos. Los reportes indican que la contaminación del alimento ocurre después de la cocción, dado que la bacteria se halla en números mayores y raras veces iguales a las dosis infectante.
Los alimentos contaminados son principalmente productos de confitería, dulces y bocadillos así como también pasteles de crema, natillas ya que tienen presión osmótica alta por su contenido de azúcar y también por presentar zonas de escasa humedad que siguen siendo adecuadas para el crecimiento de estafilococos. Otro alimento de alto riesgo es el jamón que contiene muchas sales como conservantes o saborizantes, estos aditivos para el curado inhiben más a los microorganismos competidores que a los estafilococos.
En términos generales, se espera que los estafilococos vivan, al menos en número escaso en cualquier alimento de origen animal o en aquellos que son manipulados directamente por las personas, a no ser que se apliquen fases de tratamiento térmico para llevar a cabo su destrucción.
II.
OBJETIVOS
Conocer los procedimientos para un análisis de numeración de Staphylococcus.
Determinar la presencia de Staphylococcus aureus de muestras de queso.
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Numeración de Staphylococcus aureus
III.
MATERIALES
Muestra: queso fresco
Lugar de muestreo: Mercado Modelo de Lambayeque Hora: 7:45 am Materiales
IV.
Medios de cultivo o
Agar baird Parker
o
Diluyente: agua peptonada con citrato de sodio al 2%.
Frascos estériles. Tubos de ensayo de 16x160mm
Placas Petri
Pipetas estriles de 10mL y 1mL
Asa de drigalsky
Gradillas
Mecheros, algodón, alcohol.
PROCEDIMIENTO 1. Dilución de la muestra: se pesan 3 gramos de queso y se coloca en un frasco pequeño que contenga agua peptonada con citrato de sodio al 2% la finalidad es hacer una dilución 10 -1. 2. Luego se toma 1mL de la dilución 10 -1 y se inocula a un tubo con 9mL de diluyente para hacer una dilución 10 -2. 3. De la dilución 10-2 se toma 1mL y se inocula a un tubo con 9mL de diluyente para hacer una dilución 10 -3. 4. De las diluciones se sembraran por duplicado en placas Petri que contengan agar Baird Parker por el método en siembra en superficie, colocando 0,1 mL de inoculo y distribuyéndolo cualitativamente con el asa de drigalsky por toda la superficie. 5. Incubación: 35 - 37ºC durante 24 - 48 horas. 6. Lectura: colonias negras brillantes de margen estrecho y blanco de tamaño mediano, rodeadas de áreas claras que se extienden
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en el medio opaco. La probabilidad de que estas colonias correspondan a S. aureus es muy elevada. 7. Realizar tinciones de Gram, prueba de catalasa. 8. Realizar el recuento de las colonias características. Elegir placas que contengas entre 20 a 200 colonias. 9. Confirmar la presencia de S. aureus realizando prueba de coagulasa y de termonucleasa. o
Prueba de coagulasa: se incuba en un tubo con caldo nutritivo una asada con muestra de la colonia característica o sospechosa. Luego de 18 horas de incubación colocar 0.5mL de cultivo en 0.5ml de plasma sanguíneo. Lectura: cada 30 minutos durante 24 horas. La positividad se indica por la coagulación del medio lo que indica que el microorganismo produce la enzima coagulasa.
o
Prueba de termonucleasa: se ha comprobado que existe una estrecha relación entre producción de termonucleasa y enterotoxina estafilocócicas. Para detectar termonucleasa en alimentos, se procede de la forma siguiente:la muestra por analizar se mezcla, a partes iguales, con agua templada a 3040ºC. triturar y homgenizr. Ajustar el pH a 5,5. Calentar a 100ºC durante 20 minutos. Enfriar.la muestra asi tratada se centrifuga a 27 000 rpm durante 20 minutos o a 7 500 rpm durante 45 minutos. El sobrenadante se utiliza para la prueba de termonucleasa. En placas de Petri de 15x60mm esteriles, se vierten, asépticamente, 5ml de agar DNasa-azul de toluidina. Una vez solidificado el medio, se hacen pocillos de 1cm de diámetro. Con pipeta Pasteur, se llenan los pocillos con el sobrenadante del centrifugado de la muestra. Incubar, sin invertir las placas a 50ºC durante 2-4 horas. Pasado este tiempo, se vierte sobre la superficie del medio solución de azul de toluidina. En caso positivo, aparecen zonas rosadas alrededor de los pocillos.
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Numeración de Staphylococcus aureus
o
Se hacen tinciones
Esquema del Procedimiento
Muestra de queso fresco Lugar de recolección: Mercado modelo Lambayeque
30 gr
-2
10 10
-3
10
-1
1mL
27mL de agua peptonada con citrato al 2%
0.1ml 0.1ml
0.1ml
Incubar 35ºC - 37ºC x 24horas
Lectura: colonias negras, borde blanco, halo transparente, medianas
Confirmar: pruebas de coagulasa y termonucleasa.
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V.
RESULTADOS o
Placas con colonias características de Staphylococcus aureus.
o
Prueba de coagulasa realizada a 2 de las colonias características.
Lectura: coagulasa (+)
Tinción Gram: positiva (+)
Prueba de catalasa: positiva (+)
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Numeración de Staphylococcus aureus
Tabla de resultados de la numeración de colonias características de S. aureus.
DILUCION RESULTADOS PROMEDIO 10-1
148
10-1
304
10-2
43
10-2
30
10-3
12
10-3
1
226
36.5
6.5
( ) VI.
CONCLUSIONES Se logró realizar la numeración de Staphylococcus aureus en la muestra de queso fresco presentando 37 x 103 células por gramo de queso. Esto nos determina una muestra no apta para el consumo ya que la NTP solo permite un máximo de 103 microorganismos por gramo de queso fresco. Se confirmó la presencia de Staphylococcus aureus realizando prueba de coagulasa.
VII.
BIBLIOGRAFIA Pascual M. y V. Calderón. 2000. Microbiología Alimentaria: metodología analítica para alimentos y bebidas. Editorial Díaz de Santos. Segunda edición. Madrid-España.
James M. Jay. 2002. Microbiología moderna de los alimentos. Editorial Acribia S.A. Cuarta edición. Zaragoza-España.
Dirección general de Salud Ambiental (DIGESA). Manual de Análisis Microbiológico de Alimentos. 2001. Lima-Perú.
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