ISOLASI DAN IDENTIFIKASI STAPHYLOCOCCUS SP I.
PENDAHULUAN Isolasi adalah mengambil mikroorganisme yang terdapt di alam dan menumbuhkannya dalam suatu media buatan. Proses pemisahan atau pemurnian dari mikroorgnanisme lain perlu dilakukan karena semua pekerjaan mikrobiologis, misalnya telaah dan identifikasi mikroorganisme, memerlukan suatu populasi yang hanya terdiri dari satu jenis mikroorganisme saja. Proses isolasi dapat dilakukan dengan menumbuhkan pada media padat, selanjutnya sel – sel microorganism akan membentuk suatu koloni sel yang tetap pada tempatnya. Staphylococcus sp merupakan gram positif berbentuk bulat, biasanya bergerombol seperti buah anggur. Saat ini terdapt kurang lebih 32 spesies Staphylococcus sp namun yang penting secara klinik bagi manusia yaitu Staphylococcus aureus, Stapylococcus epidermidis, dan Staphylococcus saprophyticus.
II.
PRINSIP Prinsip Isolasi
: memisahkan satu jenis mikroorganisme dengan mikroorganisme lainnya yang berasal dari campuran bermacam – macam mikroorgnanisme tersebut
Prinsip Kerja
: pemeriksaan dilakukan dengan melakukan identifikasi
berdasarkan
mikroskopik
dengan
pada
pemeriksaan
pewarnaan
gram,
pembiakan (morfologi dan sifat koloni), uji katalase dan uji biokimia, uji plasma koagulase dan DNase, dan uji resistensi terhadap antibotik novobiosin.
III.
TUJUAN Untuk
mengisolasi
mengidentifikasi
jenis
Staphylococcus
spesies
dari
sp
sehingga
Staphylococcus
dapat sp
(
mengidentifikasi Staphylococcus aureus, Stapylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophyticus ).
IV.
TINJAUAN PUSTAKA Staphylococcus berasal dari kata staphylos berarti kelompok buah anggur dan coccus berarti bulat. Kuman ini sering ditemukan sebagai flora normal pada kulit dan selaput lendir manusia.Pada tahun 1880 Pasteur mengenal mengisolir micrococcu yang membentuk kelompok. Pada tahun 1881 Oyston berhasil mengisolir micrococci dari abces. Pada tahun 1884 Rosenbach untuk pertama kalinya mempelajari Staphylococcus secara mendalam sehingga berhasil mengenal varietas aureus, albus dari micrococcus pyogenes. A. Kalasifikasi Staphylococcus Genus Staphylococcus mencakup 32 spesies. Kebanyakan tidak berbahaya dan tinggal di atas kulit dan selaput lendir manusia dan organisme lainnya. Mereka juga menjadi mikroba tanah. Genus ini dapat ditemui di seluruh dunia. Kingdom
: monerA
Divisio
: Firmicutes
Class
: Bacilli
Order
: Bacillales
Family
: Sthapylococcacae
Genus
: Staphyloccocus
Spesies
: Staphylococcus aureus Staphylococcus citerus Staphylococcus albus Staphylococcus epidermidis Staphylococcus saprophyticus (Cahtim dkk, 1993)
B. Morfologi dan Fisiologi Morfologi Bentuk : bulat, ukuran 1 mikron. Tidak membentuk spora. Tidak mempunyai flagela. Letak sel satu sama lain yang karakteristik bergerombol seperti buah anggur. Sifat karakteristik ini dipakai sebagai pemberian nama Staphylococcus. Tetapi kadang-kadang ada yang letaknya tersebar atau terpencar. Pengelompokan ini akan terlihat baik pada pengamatan penanaman dalam media padat. Pasangan atau rantai pendek lebih sering terlihat dalam smear nanah dan kultur dalam kaldu. Sifat pewarnaan : pada kultur muda bersifat Gram (+), sedang pada kultur tua bersifat Gram (-). Koloni micrococci tumbuh cepat pada media agar pada suhu normal (370), dan biasanya bergaris tengah 1-2 mm setelah inkubasi 24 jam. Koloni tadi halus, basah, menonjol dengan tepi bulat dan berwarna, yaitu pada varietas albus berwarna putih, varietas citreus berwarna kuning jernih dan varietas aureus berwarna kuning emas. (Jawtez, 1996)
Fisiologi Micrococci tumbuh paling baik pada suhu 220 – 370. Umumnya dapat tumbuh dalam lingkungan aerob maupun anaerob. Produksi warna terlihat baik pada situasi aerob dan terlihat paling baik pada kultur yang tumbuh pada suhu rendah. Produksi toksin pada semua strain terlihat pada penanaman dalam media sederhana yang berisi asam-asam amino, garam glukosa dan faktor pertumbuhan yaitu thiamin dan asam nicotinat. Dalam garis besarnya strain aureus lebih aktif metabolismenya dari pada strain albus. Dalam media kaldu yang berisi dekstrosa, sukrosa, maltosa, dan manitol akan terjadi pemecahan karbohidrat menjadi asam tanpa gas. (Jawetz, 1996)
C. Patogenitas Staphylococcus merupakan penyebab terjadinya infeksi yang bersifat poogenik. Untuk pembuatan kultur dapat diambil bahan dari pernanahan kecil, bisul kecil, bisul besar, dan abces diberbagai bagian tubuh. Bakteri ini dapat masuk ke dalam kulit melalui folikel-folikel rambut, muara kelenjar keringat dan luka-luka kecil. Kemampuan yang menyebabkan penyakit dari staphylococcus adalah gabungan dari efek yang ditimbulkan oleh produk-produk ekstraseluler,
daya
infasi
kuman
dan
kemampuan
untuk
berkembang biak. Staphylococcus patogen mempunyai sifat sebagai berikut: Dapat menghemolisa eritrosit Menghasilkan koagulasi’dapat membentuk pigmen (kuning keemasan) Dapat memecah manitol menjadi asam Diantara staphylococcus yang mempunyai kemampuan besar untuk menimbulkan penyakit ialah Staphylococcus aureus. Staphylococcus nonpatogen bersifat: Non hemolitik Tidak menghasilkan koagulasi Koloni berwarna putih Tidak memecah manitol Infeksi yang ditimbulkan oleh Staphylococcus dapat meluas ke jaringan sekitarnya, perluasannya dapat melalui darah atau limfe, sehingga pernanahan disitu bersifat menahun, misalnya sampai pada
sumsum
sehingga
terjadi
radang
sumsum
tulang
(osteomyelitis). Perluasan ini dapat sampai ke paru-paru, selaput otak dan sebagainya.
D. Toksin dan Enzim Staphylococcus
dapat
menyebabkan
penyakit
karena
kemampuannya berkembang biak dan menyebarluas dalam jaringan tubuh serta adanya beberapa zat yang dapat diproduksi olehnya, zat tersebut ialah:
1) Eksotoksin Bahan ini dapat diketemukan di dalam filtrat hasil pemisahan dari kuman dengan jalan menyaring kultur. Bahan ini bersifat tidak tahan pemanasan dan bila disuntikkan kepada hewan percobaan dapat menimbulkan kematian dan nekrose kulit. Eksotoksin ini mengandung hemolisin, yang dikenal dalam beberapa jenis: a) Alfa
hemolisin
: ialah
putih
telur
yang
dapat
menghancurkan eritrosit kelinci dan dapat mempengaruhi otot polos pembuluh darah. b) Beta hemolisin
: ialah suatu putih telur yang dapat
menghancurkan eritrosit kambing (tetapi tidak pada eritrosit kelinci) dalam 1 jam pada suhu 37o c) Gama hemolisin
: bersifat antigen.
Eksotoksin ini bila ditambah formalin akan kehilangan sifat toksinnya dan terbentuk toksoid yang dapat digunakan untuk imunisasi, walaupun akhirnya tidak dipakai karena nilai imunitasnya tidak ternilai. (Lowy, F. 2003) 2) Leukosidin Yaitu
suatu
suspensi
yang
dihasilkan
oleh
Staphylococcus yang bersifat membinasakan atau mematikan leukosit dari berbagai macam spesies binatang. Leukosidin juga suatu antigen tetapi lebih termolabil daripada eksotoksin. (Lowy, F. 2003) 3) Enterotoksin Yaitu suatu suspensi yang dihasilkan oleh jenis Staphylococcus tertentu, terutama bila ditanam pada media setengah padat dengan konsentrasi CO2 yang tinggi (30 %). Sifat-sifat enterotoksin: bersifat antigen Termostabil, tidak mengalami perubahan pada perebusan selama 30 menit. Merupakan salah satu penyebab gejala keracunan makanan dengan gejala berupa: lesu, kejang perut, berak-berak
(diare), muntah-muntah, yang terjadi 1-6 jam setelah makan makanan yang mengandung enterotoksin. (Lowy, F. 2003)
4) Koagulase Yaitu suspensi seperti enzim yang terdiri atas putih telur yang dapat mengendapkan plasma sitrat atau plasma oksalat. Staphylococcus patogen kebanyakan menghasilkan bahan ini. (Lowy, F. 2003)
5) Lain-lain produk ekstra seluler dari Staphylococcus : a) Stafilokinase yang dapat dengan lambat melarutkan fibrin seperti streptokinase. b) Penisilinase, yang dapat merusak penisilin G. c) Hialuronidase d) Proteinase e) Lipase (Lowy, F. 2003)
E. Pemeriksaan Laboratorium Untuk pemeriksaan staphylococcus secara laboratorium dapat dilakukan dengan bermacam-macam cara. Bahan pemeriksaannya dapat berupa: Nanah Darah Cairan otak Usapan luka Pengambilan sampel untuk pemeriksaan mikrobiologi berneda dengan pemeriksaan laboratorium lainya. Pengambilan sampel untuk mikrobiologi harus dilakukan secar aseftik unuk mengindari adanya kuman bakteri lain yang tumbuh pada saat pembiakan pada media. Pengambilan sampel darah untuk mikrobiologi harus dilakukan dengan cara :
1. Tindakan asepsis kulit secara melingkar dengan iodophor dan alkohol 70% 2. Darah diambil dengan spuit secara steril 3. Tanpa antikoagulan atau dengan sodium polyanetholsulfonate (SPS) (Yellow-capped tube) dan pindahkan darah ke botol media kultur Pengambila sampel dari luka atau usapan luka : Cara
:
biopsi(jar.
Luka
diambil
sedikit)
(terbaik),
aspirasi(disedot)(ex, bisul yg tertutup), dan swab Anaerob : biopsi dan aspirasi Aspirasi untuk : Abses tertutup Luka bergaung dengan cairan di dalamnya yang tertutup debris superfisial Swab : Pus diluar dibersihkan terlebih dahulu dengan swab yang telah dicelupkan dengan NaCl steril dengan swab baru buat usapan dari dasar ulkus Tidak dianjurkan untuk mengambil pus yang berasal dari drain (Wahid, M. H. 2007)
V.
CARA KERJA Identifikasi dilakukan berdasarkan pada : 1. Pemeriksaan mikroskopik dengan pewarnaan gram Alat dan bahan : Alat :
Bahan :
-
Kaca obejek
suspensi bakteri Staphylococcus
-
ose
sp
-
Lampu spirtus
-
Mikroskop
Cara kerja : 1) Buat apusan kering dari suspense bakteri yang tealh disediakan 2) Sedian yang telah difiksasi di bubuhi Kristal violet (1 menit)
3) Cuci dengan air mengalir, tetesi lugol (1 menit) 4) Cuci dengan air mengalir, tetesi alkolhol 96 % (20 – 30 detik) 5) Cuci dengan air mengalir, tetesi safranin (30 detik) 6) Cuci dengan iar mengalir, keringkan 7) Amati dengan mikroskop perbesaran 100X 2. Pembiakan (morfologi dan sifat koloni) Bahan pemeriksaan ditanam pada perbenihan media agar darah dan MSA (manitol salt agar), inkubasi pada suhu 37℃ selama 18 – 24 jam. Kemudian hari berikutnya lakukan pengamatan koloni pada media tersebut. Kemudian dilakukan kembali pewarnaan gram dari koloni yang tumbuh untuk di identifikasi jenis spesies Staphylococcus nya. 3. Uji katalase dan uji biokimia Uji katale untuk membedakan Staphylococcus dengan Streptococcus. Alat dan bahan : Alat :
Bahan :
-
Objek glass
-
Koloni bakteri tersangka
-
Ose
-
Larutan 2H2O
-
Lampu spirtus
Cara kerja : 1) Siapkan objek galss, ambil 1 ose koloni bakteri 2) Tetesi dengan 2H2O aduk dengan ose 3) Amati terbentuknya gelembung gas Uji bikomia dengan manitol untuk membedakan spesies dari bakteri Staphylocccus sp. Alat dan bahan : Alat :
Bahan :
-
Ose
-
Koloni bakteri tersangka
-
Lampu spirtus
-
Media manitol
Cara kerja : 1) 1 ose koloni ditanam pada media manitol 2) Inkubasi pada suhu 37℃ selama 24 jam 3) Amati perubahan waran pada media 4. Uji plasma koagulase
Uji
plasma
koagulase
digunakan
untuk
mengetahui
bakteri
Staphylococcus yang pathogen. Alat dan bahan : Alat :
Bahan :
-
Ose
-
Plasma
-
Lampu spirtus
-
Koloni bakteri
-
Objek glass
Cara kerja : 1) 1 ose koloni bakteri di tempatkan pada objek glass 2) Tambahkan 1 tetes plasma sitrat manusia 3) Campur dan baca hasilnya, hasil positif akan di tandai dengan gumpalan putih. 5. Uji resistensi terhadap novobiosin Cara kerja : 1) Sediakan lempeng agar Mueller hinton, buat suspense kuman pada NaCl fisiologis sampai didapat kekeruhan 1 Mc farland 2) Tanam suspense kuman pada agar 3) Letakkan cakram antibiotic novobiosin 4) Inkubasi pada suhu 37 ℃ selama 24 jam.
VI.
HASIL DAN PEMBAHASAN A. Hasil pengamatan Hari I : 1. Hasil direct preparat dengan pewarnaan Gram Sampel : se
Bentuk
: coccus
Susunan
:
bergerombol,
satu kokus, diplokokus Sifat
: Gram positif
Tersangka
:Staphylococcus
sp Sampel : sa
Bentuk
: coccus
Susunan : bergerombol Sifat
: gram positif
Tersangka : Staphylococcus sp
Hari II : 1. Morfologi koloni Media Cirri-ciri koloni
Agar Darah
MSA
Koloni : se
Koloni : sa
Koloni : se
Bentuk koloni
Bulat
Bulat
Bulat
Diameter(mm)
3 mm
3 mm
0.1 mm
Warna
Putih
Putih
Putih
Elevasi
Convex
/ Convex
/ Convex
cembung Permukaan
cembung
cembung
Molst
/ Molst
basah
basah
Rata
Rata
Rata
Sifat hemolisis* -
hemolisis
-
Mempermentasi -
-
Tidak
Pinggiran
manitol
/
/ Molst / basah
memfermentasi manitol
2. Hasil pewarnaan Gram dari koloni tersangka media AD Sampel : se
Bentuk
: coccus
Susunan
: bergerombol,
satu kokus, diplokokus Sifat
: Gram positif
Tersangka
:Staphylococcus
sp Sampel : sa
Bentuk
: coccus
Susunan
: bergerombol,
satu kokus, diplokokus
Sifat
: Gram positif
Tersangka
:Staphylococcus
sp
3. Hasil uji katalase
: koloni + H2O2 → bergelembung, katalase positif (+)
Hari III : No.
Parameter pemeriksaan
Hasil
1.
Plasma koagulase
Negatif (-)
2.
Gula manitol
Negatif (-)
3.
Gula glukosa
Positif (+)
4.
Resistensi terhadap novobiosin
Sensitif (diameter 20 mm)
B. Pembahsan Cara pemeriksaan bakteri tersangka dapat dilakukan dengan car : 1. Pemeriksaan langsung Dari bahan dibuat sediaan/preparat, kemudian diadakan pewarnaan. Dapat dipakai zat warna sederhana, tetapi lebih baik dengan zat warna Gram. Umumnya bersifat gram positif. Secara mikroskopis tidak dapat dibedakan antara staphylococcus patogen dan yang non patogen. 2. Penanaman Kalau ditanam pada media agar darah selama 18 jam suhu O 37 C akan tumbuh koloni. Untuk melihat ada tidaknya hemolisin, atau terbentuknya pigmen. Pengeraman harus lebih lama lagi. Pada infeksi campuran penanaman pada media ditambah 75 % NaCl agar flora lain sukar tumbuh. 3. Tes Koagulase Plasma sitrat yang telah diencerkan 1:5 dicampur dengan pertumbuhan Staphylococcus dalam media cair dalam jumlah yang sama. Kemudian ditunggu selama 3 jam, apabila terjadi perjendelan berarti bahwa Staphylococcus tersebut menghasilkan
koagulase. Semua staphylococcus aureus yang tes koagulase positif adalah bersifat patogen terhadap manusia, kecuali staphylococcus albus yang dapat menyebabkan endocarditis (radang selaput dalam jantung). 4. Tes Manitol Staphylococcus ditanam pada media cair (air pepton) + 5 % manitol + phenol merah (sebagai indikator). Setelah dieramkan 1824 jam akan terjadi perubahan warna menjadi kuning; karena terbentuk asam.( Juuti, K. 2004) Sama halnya dengan pemeriksaan bakteri tersangka pada praktikum kali ini yaitu dengan cara : 1. Pemeriksaan mikroskopik Dari kedua sampel didapat : Bentuk koloni : coccus Susunan Sifat
: bergerombol diplokokus, satu kokus : gram positef
Tersangka
: Staphylococcus sp
2. Isolasi Sampel bahan pemeriksaan diisolasi dalam media dan diinkubasi dalam inkubator dengan suhu 37o C selama 24 jam. a. Biakan pada Agar Darah (BAP= Blood Agar Plate) Media
BAP
untuk
membedakan
bakteri
yang
menghemolisa darah dan non hemolisa. Pengamatan
koloni
pada
media:
Media Agar Darah : Koloni berwarna putih, halus, dan basah. Pada sampel sa di sekitar koloni menjadi jernih atau transparan pada terjadi hemolisis. Kemudian Yang tumbuh pada media BAP dengan koloni hemolisa positif kemudian dilakukan pembuatan preparat dan pewarnaan metode Gram ( karena Streptococcus juga hemolisa positif ). Hasil Pemeriksaan : Bentuknya Coccus/bulat, ungu gram positif. Susunannya bergerombol seperti buah anggur. b. Biakan pada MSA (Manitol Salt Agar).
Media MSA : Koloni berwarna merah berarti tidak memecah manitol. c. Koloni pada subkultur dilakukan uji katalase dan parameter pemriksaan yang lain. Uji Katalase : 1 ose koloni + 1 ose H2O2 3%. Hasil positif dengan indikasi dengan terbentuknya gelembung. Tes katalase menentukan apakah organisme menghasilkan enzim katalase yang menguraikan hidrogen
peroksida
menjadi air dan oksigen. Parameter pemriksaan lain : No.
Parameter pemeriksaan
hasil
1.
Plasma koagulase
Negatif (-)
2.
Gula manitol
Negatif (-)
3.
Gula glukosa
Positif (+)
Resistensi terhadap
Sensitif (diameter 20
novobiosin
mm)
4.
VII.
KESIMPULAN Diagnostik bakteriologik : Dari
bahan
pemeriksaan
dengan
sampel
se
didapatkan
bakteri
Staphylococcus epedermidis sedangkan dari sampel sa didapatkan bakteri Staphylococcus aureus.
VIII.
DAFTAR PUSTAKA Cahtim, A., dan Suharto. 1993. Buku Ajar Mikrobiologi Kedokteran. Jakarta: Bina Aksara Rupa. hal.39-52. Jawetz, E., J. L. Melnick, E. A. Adelberg, G. F. Brooks, J. S. Butel and L. N. Orston. 1996. Mikrobiologi Kedokteran. Edisi 20. Diterjemahkan oleh E. Nugroho & R.F. Maulany. Jakarta: Buku Kedokteran EGC. hal. 211-215.
Juuti, K. 2004. Surface protein Pls of methicillin-resistant Staphylococcus aureus role in adhesion, invasion and pathogenesis, and evolutionary aspects. [Disertation]. Helinski: Department of Biological and Environmental Sciences Faculty of Biosciences. p. 61-63. Lowy, F. 2003. Gram positive : the example of Staphylococcus aureus. J Clinic Invest. 111(9): 1265-1273. Wahid, M. H. 2007. Pengambilan specimen mikrobiologi . Dalam: Andra. Jakarta, 29 Juni-1 Juli. Jakarta: Farmacia.
