UNIVERSIDAD TÉCNICA DE MANABÍ FACULTAD DE CIENCIAS MATEMÁTICAS, FÍSICAS Y QUÍMICAS
7mo DE INGENIERÍA QUÍMICA FUNDAMENTO DE MICROBIOLOGÍA Y LABORATORIO II ING. VIRGINIA SÁNCHEZ PROYECTO INVESTIGATIVO INTEGRANTES
CHÁVEZ LOOR JORGE JAVIER SABANDO MOLINA CRISTINA
INTRODUCCIÓN En el pres presen ente te trab trabajo ajo inve invest stig igat ativ ivo o cons consis iste te en la impl implem emen entac tació ión n de pruebas microbiológicas para el análisis, afirmación y confirmación de la presencia de la bacteria Estafilococo
Áureo en muestras una en alimentos
(queso y carne). Los sistemas más importantes para la identificación de microrganismos es observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en los laboratorios. Al gram se evidencia como una cocácea gram positiva de 1um dispuesta en racimos, aunque también se le puede evidenciar en cadenas cortas o diplococos. Es inmóvil y no forma esporas. Se
menci encio onan tamb tambié ién n
ais aislami lamien ento to y microbiológicos.
algu alguna nass
car caracte acterí ríst stic icas as princ rincip ipal ales es para ara
el estu estud dio del pató patóg geno eno,
el
utili tiliza zan ndo pro proced cedimie imien ntos tos
INTRODUCCIÓN En el pres presen ente te trab trabajo ajo inve invest stig igat ativ ivo o cons consis iste te en la impl implem emen entac tació ión n de pruebas microbiológicas para el análisis, afirmación y confirmación de la presencia de la bacteria Estafilococo
Áureo en muestras una en alimentos
(queso y carne). Los sistemas más importantes para la identificación de microrganismos es observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en los laboratorios. Al gram se evidencia como una cocácea gram positiva de 1um dispuesta en racimos, aunque también se le puede evidenciar en cadenas cortas o diplococos. Es inmóvil y no forma esporas. Se
menci encio onan tamb tambié ién n
ais aislami lamien ento to y microbiológicos.
algu alguna nass
car caracte acterí ríst stic icas as princ rincip ipal ales es para ara
el estu estud dio del pató patóg geno eno,
el
utili tiliza zan ndo pro proced cedimie imien ntos tos
OBJETIVOS •
Aislar
la
Staphy Staphyloc lococc occus us
OBJETIVO GENERAL
bacteria
Aureus Aureus
en muestr muestras as específ específica icass utiliz lizand ando medios ios de cultivo cultivoss para para identif identifica icar r el género y especie, aplicando pruebas bioquímicas.
•
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
•
•
Reconocer las propiedades morfológicas, físicas y patógenas de la Staphylococcuss Aureus Aureus para bacteria Staphylococcu poder realizar las prácticas respectivas. Emplear el medio de cultivo adecuado para la identificación de la bacteria Staphylococc Staphylococcus us Aureus. Aureus. Anal nalizar izar las las respe espect ctiivas vas prue prueba bass bioquímicas necesarias correctamente para obtener los resultados resultados requeridos.
MARCO TEÓRICO
ESTAF I L OCOCOS
CARACTERÍSTICAS GENERALES
• Staphylococcus (del griego staphylḗ, "racimo de uvas" y kókkos, "gránulo") es un género de bacterias estafilococáceas de la clase Cocos. • Comprende microorganismos que están presentes en la mucosa y en la piel de los humanos y de otros mamíferos y aves.
Morfológicamente los Staphylococcus son cocos Gram-Positivos, cuyo diámetro oscila entre 0.5 y 1.5 micras.
ESTAFILOCOCOSAUREUS Este microorganismo fue descrito por primera vez en el año 1880, concretamente en la ciudad escocesa de Aberdeen, por el cirujano Alexander Ogston en el pus que drenaba un absceso infectado En 1884, Friederich Julius Rosenbach acuñó el nombre binominal de esta especie. En 1961, Jevons hizo el primer reporte de la existencia de un Staphyloccocus aureus resistente a meticilina; cuando esta era una causa importante de infección nosocomial en Europa.
CONCEPTO El nombre binominal de esta bacteria proviene de la raíz griega, que se compone de staphylé, que significa racimo y coccus, que significa grano, baya o uva; y del latín aureus que significa dorado.
CLASIFICACIÓN CIENTÍFICA MORFOLOGÍA Reino: Bacteria Filo: Firmicutes Clase: Bacilli Orden: Bacillales Familia: Staphylococcaceae Género: Staphylococcus Especie: S. aureus (ROSENBACH 1884)
S. aureus es un coco inmóvil, de 0,5 a 1 μm de diámetro, que se divide en tres planos para formar grupos de células irregulares semejantes a racimos de uvas. En extendidos de pus los cocos aparecen solos, en pares, en racimos o en cadenas cortas.
METABOLISMO • Staphylococcus aureus se
GENOMA • S. aureus tiene un cromosoma
desarrolla rápidamente en todos los medios, fermentan lentamente en carbohidratos, como el manitol, pero no produce gas. • S. aureus produce pigmentos que varían desde un color blanco hasta un amarillo intenso.
circular de aproximadamente 2800 kilopares de bases, sin contar el material genético de prófagos, plásmidos y transposones. • Los factores de virulencia de la bacteria están contenidos en todos estos vehículos
EPIDEMIOLOGÍA
PATOGENIA
• Es un agente patogénico
• La patogenicidad de las
ubicuo que es considerado como parte de la microbiota normal. • Los seres humanos son un reservorio natural de S. aureus. Entre el 30 y el 50% de los adultos sanos están colonizados, y entre el 10 y el 20% se mantienen colonizados
infecciones por Staphylococcus aureus se relaciona con diversos componentes de la superficie • Es una de las principales bacterias implicadas en enfermedades transmitidas por alimentos (ETA).
SÍNTOMAS QUE HA SIDO AFECTADA POR UNA INTOXICACIÓN ALIMENTARIA ESTAFILOCÓCICA • Para saber si somos víctimas de una intoxicación alimentaria enterotoxigénica, es necesario saber cuáles son los síntomas que cada microorganismo produce en el organismo humano. Así, se encuentra una relación de estos con los que el paciente ha consumido. Los síntomas que presenta una persona que ha sido afectada por una Intoxicación Alimentaria Estafilocócica son muy particulares Tales manifestaciones clínicas abarcan: Vómitos intensos, diarrea y cólicos que inician entre 2 y 6 horas después de la ingesta. La resolución es rápida (menos de 24 h).
PROFILAXIS
• Prevenir la transmisión horizontal de estafilococos de una persona a otra es sumamente difícil, no obstante, seguir medidas como una buena técnica aséptica, difundir el correcto lavado de manos (no solo a nivel hospitalario) y la cobertura de las superficies de piel expuestas son buenas medidas para prevenir infecciones por este (y otros) microorganismos.
MICROSCOPÍA En frotis teñidos con gram, los estafilococos aparecen como cocos grampositivos con diámetros de 0,5 hasta casi 1,5 μm. Los estafilococos al microscopio son cocos gram-positivos con forma de racimos cuando crecen en medio agar y aparecen solos, en pares, en cadenas cortas, en pequeños grupos.
MORFOLOGÍA COLONIAL La morfología colonial es útil para distinguir entre especies de Staphylococcus y Micrococcus ya que la mayoría de las especies de Staphylococcus (incluido S. aureus) crecen más rápido y son más grandes en un cultivo a 24 h. Las colonias de S. aureus son grandes, lisas, enteras, presentan consistencia cremosa.
CULTIVO Los estafilococos crecen rápidamente en casi todos los medios bacteriológicos bajo condiciones aerobias o microaerofílicas. Los Medios diferenciales para S.aureus son el medio manitol-salino o Chapman, el medio Baird-Parker, agar estafilococos N° 110, agar DNAsa.
PRUEBAS BIOQUÍMICAS Coagulasa La prueba de la coagulasa es sencilla y tiene una especificidad muy alta. La prueba se puede realizar con un cultivo o en tubo y consiste en la búsqueda del factor de aglutinación.
Desoxirribonucleasa (DNasa) Como se mencionó, S. aureus produce DNasa termoestable que es detectable en el medio de prueba del mismo nombre. Su uso es principalmente como confirmación diagnóstica.
Catalasa Los estafilococos y los micrococos se diferencian de los estreptococos y los enterococos por esta prueba.
Sensibilidad a la lisostafina Esta prueba mide la facilidad con la que los microorganismos estafilocócicos se lisan en presencia de lisostafina. Lisostafina es una endopeptidasa que rompe los puentes de entrecruzamiento de glicina en el peptidoglucano.
Oxidasa Esta prueba es rápida, se usan discos de papel filtro con tetrametil-pfenilendiamina como reactivo y DMSO para hacer permeables a las bacterias al reactivo. La prueba se basa en que evidenciar la reacción de óxido-reducción
Enzimoinmunoanálisis Estas pruebas buscan la presencia de proteínas específicas de S. aureus, la mayoría de ellas busca a la proteína A y la β-N-acetilglucosaminidasa. La sensibilidad y especificidad de este estudio, en cultivos no contaminados es cercana al 100%.
MEDIOS DE CULTIVOS Y PRUEBAS BIOQUÍMICAS APLICADAS EN EL LABORATORIO
AGAR ESTÁNDAR MÉTODOS
Se emplea para el recuento microbiano en leches, carnes, productos alimenticios en general, productos farmacéuticos, productos cosméticos y cualquier tipo de muestra.
Muestra # 1 (Carne)
La composición del medio basada en la peptona de caseína como aportación nutritiva, el extracto de levadura como sustrato vitamínico y la glucosa como fuente energética, favorece el crecimiento de la mayor parte de los microorganismos, sin precisar de otros aditivos
Muestra #2 (Queso)
AGAR SAL Y MANITOL
Se emplea para el aislamiento selectivo y recuento de Estafilococos patógenos en productos lácteos, cárnicos, marinos y otros productos alimenticios. También se emplea con el mismo fin en productos farmacéuticos y cosméticos.
El efecto inhibidor se debe a la alta concentración de Sodio Cloruro del medio. Con la fermentación de la D(-)-Manita se genera ácido que ocasiona el viraje del rojo de fenol al amarillo, permitiendo así una mayor claridad en el momento de establecer el diagnóstico, ya que la mayoría de los Estafilococos patógenos fermentan este azúcar.
ROJO DE METILO • Determina la habilidad del organismo de romper el Indol del aminoácido triptófano, esta división molecular es lograda por una serie de encimas intracelulares diferentes, un sistema que en conjunto se lo llama con frecuencia triptofanosa.
INDOL
• Encima catalasa, desdobla el • Evalúa la capacidad de la bacteria de utilizar la glucosa por la vía acido mixto • Las bacterias que utilizan la glucosa por la vía acida mixta genera como producto finales ácido acético, ácido fórmico, acido succínico y ácido láctico, los cuales provocan un fuerte descenso en el pH del medio,
peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno, despendiendo burbujas.
CATALASA
AGAR TSI • La reacción de la oxidasa se debe a la presencia de un sistema citocromo-oxidasa que activa la oxidación de citocromo que es reducido por el oxígeno molecular que produce agua y peróxido de hidrógeno según la especie bacteriana.
OXIDASA
• La tinción o coloración de Gram • Gracias a su composición es uno de los medios de cultivo más empleados. • Para la diferencia de anterobacterias según: • Fermente o no glucosa. • Fermenten o no lactosa o sacarosa. • Produzcan o no ácido sulfhídrico. • Produzcan o no gas.
es un tipo de tinción diferencial empleado en bacteriología para la visualización de bacterias. • Para observar al microscopio óptico es conveniente hacerlo a 100x con aceite de inmersión.
PRUEBA DE TINCIÓN DE GRAM
MATERIALES Y SUSTANCIAS EQUIPOS Y MATERIALES
Balanza analítica Autoclave Incubadora Calentador- agitador Cabina de flujo laminar Mechero Mortero Matraz Erlenmeyer Cajas Petri Cuchara metálica
Tubos de ensayo Gradilla Vidrio reloj Probeta
Pipetas Peras Porta y cubre objetos Asas (en punta y redonda) Pastilla agitadora Campana de Durham Algodón Gasa Papel kraft Piola nailón Cinta adhesiva de papel.
SUSTANCIAS Y REACTIVOS
Carne (Muestra #1) Queso macerado (Muestra#2) Agua destilada Agua peptonada Agar Métodos Estándar. (Muestra #1) Agar Sal y Manitol (Muestra # 2) Agar TSI Cristal violeta Reactivo de kovac Peróxido de Hidrógeno Lugol Alcohol Safranina.
PROCEDIMIENTO Se esterilizaron todos los materiales y equipos previos a la práctica, esto se lo realizó en la autoclave y en la estufa.
Etapa Nº1 Obtención de las muestras (5.22g
Etapa Nº 3 PreEnriquecimiento
Etapa Nº 4 Siembra en los medios de cultivo
en 47ml de agua peptona )
Etapa Nº2 Preparación de las soluciones.
Etapa Nº 5 Pruebas Bioquímicas
CÁLCULOS
RESULTADOS Estándar Métodos Agar MICROORGANISMO Staphylococcus Aureus
DESARROLLO
COLOR DE COLONIA
CONFIRMACIÓN
Satisfactorio
Medianas-Crema
Positivo
PRUEBA BIOQUÍMICA
TSI STAPHYLOCOCCUS AUREUS Aislamiento en Estándar Métodos Agar 1era Muestra 10-1
Replica
10-2
10-3
10-4
10-5
10-1
10-2
10-3
10-4
Fermentación de Glucosa
+
+
+
+
*
+
+
*
*
Fermentación de Lactosa
+
+
+
+
*
+
+
*
*
Fermentación de Sacarosa
+
-
+
+
*
+
+
*
*
Producción de SH2
+
+
-
-
*
+
-
*
*
1era Muestra
PRUEBAS BIOQUÍMICAS
Replica
10-1
10-2
10-3
10-4
10-5
10-1
10-2
10-3
10-4
Catalasa Oxidasa Indol Rojo de Metilo
+
+
+
*
*
+
*
*
-
-
-
*
*
*
-
-
*
*
+
+
+
*
*
+
-
*
*
+
+
+
*
*
+
+
*
*
Prueba de Gram
+
*
*
*
*
+
*
*
*
Rojo de Metilo
Catalasa
Prueba de Gram
Oxidasa
Sal y Manitol Agar MICROORGANISMO Staphylococcus Aureus
DESARROLLO
COLOR DE COLONIA
CONFIRMACIÓN
Satisfactorio
Amarillo
Negativo
CONCLUSIONES GENERALES
De los resultados obtenidos el Agar Estándar Métodos y Sal Manitol siendo este el medio de cultivo adecuado para la identificación de la Staphylococcus Aureus como satisfactorio.
La característica que se presentaron de las colonias Staphylococcus Aureus en el agar Estándar Métodos con la muestra (Carne) fueron videntes desde su estructura, tamaño, color, apariencia hasta su forma de agrupación; en cambio con el agar Sal Manitol con la muestra (queso) hubo ausencia de Staphylococcus Aureus.
Aplicando varias prueba bioquímica permitieron su análisis e interpretación; de manera que la pruebas de indol, rojo de metilo, catalasa, TSI y Tinción de Gram dieron valores positivo en su resultado a excepción d e la prueba oxidasa que fue la única que arroja un valor negativo cómo resultado. Todo eso se debe a que como ya se había mencionado antes la Staphylococcus Aureus es una bacteria catalasa-positivo.
En el microscopio se pudo evidenciar como una cocácea gram positiva, dispuesta en racimos, aunque también se le puede evidenciar en cadenas cortas o diplococos, también se observó que es inmóvil y no forma esporas.
RECOMENDACIONES GENERALES
Se recomienda tomar las debidas precauciones de las reglas del laboratorio mandil, guantes y mascarilla por la atmosfera no tan estéril que se presenta durante la realización del proyecto. Esterilizar muy bien los materiales. Al realizar las disoluciones con la mayor exactitud. Utilizar la debida protección y asepsia en los equipos del laboratorio de Microbiología. Emplea los reactivos reveladores en orden y en buen estado. Tenemos que tomar las precauciones adecuadas en cada práctica sin importar el grado de peligrosidad que se presenten. En el momento de preparar el agar y todas las soluciones de la práctica leer las instrucciones que vienen marcadas en el envase del agar. Ya que hubo muchos problemas al momento de preparar el agar y no dejar que el medio de cultivo hierva demasiado ya que se puede subir y ensuciar los equipos lo que puede causar el daño de los mismos. Para que nuestra siembra sea de mayor eficacia realizarla dentro de la cabina de flujo laminar así se evita la contaminación de las muestras como del medio de cultivo. Al momento de terminar la práctica se deben dejar todos los materiales y equipos limpios y en su debido lugar para su posterior uso. Avisar cuando se desea la entrada al laboratorio, para que haya la debida supervisión.
