Método para la determinación de Staphylococcus aureus en alimentos. OBJETIVOS Realizar adecuadamente la cuantificación de Staphylococcus aureus en alimentos, mediante la técnica descrita en la Norma Oficial Mexicana. Explicar el fundamento de todas las etapas del método de detección de Staphylococcus aureus en alimentos. GENERALIDADES Los estafilococos son cocos anaerobios facultativos, son Gram positivos y se presentan solos, en pares o racimos, no son móviles, ni esporulados; algunos biotipos son capaces de producir una toxina altamente termoestable, así por ejemplo, Staphylococcus aureus produce 5 toxinas, que pueden provocar severas intoxicaciones en el hombre. Su metabolismo es oxidativo/fermentativo, es catalasa-positivo y puede metabolizar una gran variedad de carbohidratos en condiciones aeróbicas, con la subsecuente liberación de ácido, principalmente ácido acético con pequeñas cantidades de bióxido de carbono; en condiciones anaerobias, el producto principal de la fermentación es el ácido láctico. Las tres condiciones necesarias para su óptimo desarrollo son: pH cercano a la neutralidad, temperatura alrededor de 30ºC y ausencia de microorganismos competitivos. Este último punto es importante, ya que Staphylococcus aureus no es competitivo en presencia de otros microorganismos. Staphylococcus se puede encontrar en a) medio ambiente como puede ser: aire, polvo,
superficies en donde se manejan alimentos, agua, agua residual, b) en alimentos: por ejemplo los que presentan un alto contenido proteico, como puede ser la leche y derivados lácteos, también se desarrolla en aquellos alimentos que presentan altas concentraciones de sal, uno de ellos sería el jamón; otro factor importante en los alimentos es el pH, así tenemos en el caso de la mayonesa, ésta tiene un pH lo suficientemente bajo para inhibir el desarrollo de S. aureus , sin embargo, al diluirse y neutralizarse en una ensalada por ejemplo, el pH asciende lo suficiente como para permitir el desarrollo de este microorganismo enterotoxigénico y finalmente c) también se puede localizar en personas y animales. Estos últimos, los animales y las personas son los principales reservorios de estos microorganismos. Con respecto a las condiciones ambientales, los alimentos son susceptibles a una contaminación postproceso con tipos enterotoxigénicos de Staphylococcus aureus , por ejemplo, si son sometidos a un inadecuado manejo o bien a temperaturas de
conservación inapropiadas; este problema se acentúa por la ausencia de flora competitiva, que normalmente restringe el desarrollo de este microorganismo El crecimiento de Staphylococcus aureus en alimentos, tiene gran importancia por tratarse de un microorganismo capaz de producir una poderosa enterotoxina, que al ingerirse causa intoxicaciones severas al hombre. Como se mencionó con anterioridad son 5 enterotoxinas: A, B, C, D y E, siendo la “A” la más nociva
La cantidad de Staphylococcus aureus necesaria para producir suficiente toxina (1.0 microgramo), para causar intoxicación, es de 106 UFC/g de alimento, de acuerdo con la Norma Oficial Mexicana, sin embargo Jablonski et al, comentan que el FDA, establece que una cantidad de Staphylococcus aureus patógeno, en el que se encuentren 105 UFC/g de alimento, provoca intoxicaciones y que un nivel basal de aproximadamente un nanogramo de toxina estafilocóccica por gramo de alimento, es suficiente para causar síntomas asociados con la intoxicación antes mencionada. También es importante observar, que en la mayoría de los brotes de intoxicación causados por este microorganismo, se han detectado niveles de uno a cinco microgramos de toxina ingerida, aunque en algunos casos las concentraciones de toxina han sido aún más bajas, del orden de 0.01 microgramo, suficientes para provocar una intoxicación en el hombre. Los alimentos contaminados con esta cantidad de bacterias, no presentan ninguna diferencia perceptible en cuanto a su apariencia, sabor y olor, por lo que no se distinguen de los alimentos que no están contaminados con este microorganismo, por esta razón el peligro de ingerir alimentos contaminados con Staphylococcus aureus sin darse cuenta es alto. Los alimentos sometidos a intensa manipulación durante su preparación y que se mantienen a temperaturas de riesgo (por encima de 7.2° C y por debajo de 60° C) después de su preparación, son los alimentos más involucrados en la intoxicación estafilocóccica. Los alimentos perecederos tales como carnes crudas y procesadas, ensaladas, productos de pastelería, como pasteles rellenos con crema, pies de crema, coberturas de chocolate, leche y sus derivados, rellenos para sándwiches y papas, son los más comúnmente asociados con intoxicaciones estafilocóccicas. En los humanos, las cepas de Staphylococcus habitan en forma específica en el tracto nasofaríngeo, cabello y piel del 50% o más de los individuos, sin causar daño aparente (portadores asintomáticos), pudiendo transferirse de los dedos y manos a los alimentos y desarrollarse con rapidez en ellos. La especie aureus , es la considerada patógena dentro del género Staphylococcus y está comúnmente asociado a casos de artritis, osteomielitis, meningitis, neumonía y en algunos casos puede llegar a ocasionar pérdida del conocimiento. Las cepas de este microorganismo que producen enzimas extracelulares y toxinas, son las más importantes por ser causante de intoxicaciones alimentarias.
El establecimiento de los síntomas de la intoxicación, por lo general se presentan rápidamente y en muchos casos de forma aguda, aunque depende de: la susceptibilidad de la persona hacia la toxina, la cantidad consumida del alimento contaminado, la cantidad de toxina en el mismo y en general la salud del individuo. Los síntomas más comunes de intoxicación consisten en náusea, vómito, dolor o espasmos abdominales y postración. Sin embargo, existen algunos individuos que pueden no manifestar todos estos síntomas asociados a la enfermedad. En casos más severos, se puede presentar dolor de cabeza, calambres musculares así como cambios intermitentes en la presión sanguínea y pulso. La recuperación parcial se alcanza a los 2 días, sin embargo la recuperación completa puede durar más días en casos muy severos. El término Staphylococcus coagulasa-positivo se utiliza para describir aquellas cepas que secretan una enzima que provoca coagulación del fibrinógeno sanguíneo, utilizando el microorganismo esta capacidad contra la fagocitosis y otros mecanismos de defensa del huésped. Esta reacción se utiliza in vitro para la identificación de cepas de Staphylococcus productoras de toxinas, mediante el uso de plasma. Algunas razones para determinar Staphylococcus aureus son: Confirmar la presencia de este microorganismo como agente causal de intoxicaciones. Determinar si un alimento o ingrediente de los mismos, es fuente potencial de este microorganismo enterotoxigénico. Demostrar la contaminación postproceso, la cual es usualmente debida a contacto humano o con superficies inadecuadamente sanitizadas. FUNDAMENTO La presente técnica para la detección de Staphylococcus aureus , consiste en los siguientes pasos: 1. Aislamiento selectivo, se utiliza un medio selectivo sólido, el cual inhibe el desarrollo de géneros diferentes al Staphylococcus , pero además permite reconocer el desarrollo característico del microorganismo buscado. 2. Recuperación de la cepa, este paso permite restaurar las células dañadas de Staphylococcus aureus . 3. Identificación bioquímica, en este punto se identifica el género y especie de Staphylococcus aureus enterotoxigénico. Estas pruebas bioquímicas (de acuerdo a la Norma Oficial) son: presencia de la enzima coagulasa y presencia de la enzima termonucleasa. La caracterización bioquímica de Staphylococcus aureus toxigénico en estas pruebas es la siguiente: Presencia de coagulasa positiva Presencia de termonucleasa positiva
La determinación del Staphylococcus aureus mediante extensión del inóculo en superficie, es adecuado para el análisis de alimentos en los que se espere encontrar más de 100 células de Staphylococcus aureus /g ó 10 células de Staphylococcus / mL de alimento. aureus El aspecto cuantitativo en la investigación de Staphylococcus aureus es de suma importancia, no sólo desde el punto de vista económico, sino en el de salud pública; la Norma establece un límite máximo de 10 6 UFC/g de alimento para que éste pueda ser consumido. Desde este punto de vista y de acuerdo con la técnica mencionada, la sensibilidad mínima de detección en el recuento en placa, utilizando el método de extensión de superficie es de: 100 UFC/g de alimento para muestras sólidas ó 10 UFC/mL para alimentos líquidos. NOTA La sensibilidad se podrá aumentar a 10 UFC/g ó 1 UFC/mL, solamente si se coloca 1.0 mL de la primer dilución del alimento, distribuido en tres placas de agar Baird Parker, esto representa una cantidad aproximada de inóculo de 0.33 mL por caja. MEDIOS DE CULTIVO Y DILUYENTES 4 cajas de Petri con 20.0 mL de agar Baird Parker a. 7 tubos de 13 x 100 mm con 3.0 mL de caldo infusión cerebro corazón (BHI) b. 1 caja de Petri con 20.0 mL de agar DNA c. 7 tubos de 13 x 100 mm con 3.0 mL cada uno de caldo manitol c. (opcional) 1 matraz Erlenmeyer de 250 mL de capacidad conteniendo 90.0 mL de agua peptonada al 0.1% o una solución amortiguadora de fosfatos 0.1 M de pH 7.2 a. 3 tubos 16 x 150 mm conteniendo 9.0 mL de agua peptonada al 0.1% o una solución amortiguadora de fosfatos 0.1 M de pH 7.2 a. SOLUCIONES, REACTIVOS E INDICADORES Colorantes para Tinción de Gram b Parafina o aceite mineral estéril c. (sólo si se siembra en caldo manitol) Colorante azul de orto-toluidina 0.1M, (solamente que el medio de cultivo no contenga este indicador) d. HCl 1N, en caso de no contar con la orto toluidina d. BIOLÓGICOS Plasma de conejo c.
MATERIAL Y EQUIPO Pipetas graduadas estériles de 1 mL con tapón de algodón a, c . (se debe utilizar una pipeta para cada dilución) Pipetas Pasteur estériles a, b. c. d . Pipetas graduadas estériles de 10 mL con tapón de algodón. a. (en caso que la muestra sea líquida. Propipeta. a, b, c, d Varillas de vidrio de 3.5 mm de diámetro aproximadamente y 20 cm. de largo, dobladas en ángulo recto (forma de “L”), estérile s (se debe utilizar una por dilución). a Utensilios estériles para manipular las muestras: cuchillos, cucharas, pinzas, tijeras, espátulas y separador de huevo. a Vaso de licuadora estéril o Bolsa para Stomacher a. Motor para licuadora o Stomacher a. Asa bacteriológicab. Portaobjetosb. Microscopio óptico b. Balanza granataria a. Horno para esterilizar material de vidrio. Autoclave Baño de agua a ebullición d Incubadora a 35 ± 2°Cd NOTAS a b c d
Material necesario al inicio de la práctica. Material necesario a las 48 h de iniciada la práctica. Material necesario a las 72 h de iniciada la práctica. Material necesario a las 96 h de iniciada la práctica.
DETERMINACIÓN DE Staphylococcus aureus EN ALIMENTOS Realizar diluciones decimales empleando tubos con 9.0 mL de solución diluyente
Homogenizar con 90.0 mL de diluyente
1.0 mL
Pesar 10.0 g de muestra en condiciones de asepsia
0.1 mL
10-2
10-1
1.0 mL
10-2
10-3
1.0 mL
10-3
10-4
10-4
10-5
Depositar por duplicado 0.1 mL de cada dilución en cajas petri con agar Baird Parker.
Incubar 24 - 48 h a 37°C Contar aquellas colonias negras con hidrólisis de lecitina
Distribuir la muestra con una varilla de vidrio estéril
Coagulasa Incubar 24 h 37°C
Fermentación del manitol
Plasma más desarrollo en BHI
DNAsa termoestable
Realizar pruebas bioquímicas a cada tubo
Siembra de colonias típicas en tubos con caldo BHI. Consultar
Cuadro 1
PROCEDIMIENTO 1. Aislamiento selectivo. 1. Pesar 10.0 g de muestra en una caja de Petri estéril. 2. Transferir la muestra pesada a una bolsa de Stomacher o vaso de licuadora estéril. 3. Adicionar 90.0 mL de agua peptonada estéril al 0.1% o solución amortiguadora de fosfatos 0.1M de pH 7.2. 4. Homogeneizar 30 segundos en Stomacher a velocidad media o 10 segundos en licuadora a velocidad mínima. 5. Realizar diluciones decimales hasta 10-4 (el número de diluciones está en función de la procedencia de la muestra) en tubos de 16 x 150 mm conteniendo cada tubo 9.0 mL del mismo diluyente. 6. Transferir 0.1 mL de las diluciones 10-1, 10-2, 10-3 y 10-4 a cajas de Petri con agar Baird Parker. 7. Extender el volumen inoculado a cada una de las cajas de Petri con una varilla de vidrio estéril, en forma de “L”, iniciando a partir de la mayor dilución (Método
de inoculación por extensión en superficie). 8. Mantener las placas en su posición hasta que el inóculo sea absorbido por el agar, entre 5 y 10 minutos aproximadamente. 9. Invertir las placas e incubar a 35 ± 1º C. durante 45 a 48 h. 10. Después de incubar, observar las colonias características de este microorganismo en el agar Baird Parker (BP). Éstas se presentan como: colonias negras, circulares, brillantes, convexas, lisas con diámetro de 1 a 2 mm, muestran una zona circular opaca y un halo claro alrededor de la colonia. 2. Recuperación de la cepa. 1. Seleccionar las placas que contengan entre 15 y 150 colonias típicas de S. aureus , si no es posible, seleccionar las placas que contienen concentraciones de la muestra más diluidas, no obstante que contengan más de 150 colonias. 2. Cuando las placas contengan menos de 15 colonias típicas, también pueden ser utilizadas y al reportar se deberá agregar la nota de “valor estimado”.
3. Con ayuda del cuadro 1, determinar el número de colonias a evaluar, tomando en cuenta el número de colonias típicas de S. aureus obtenidas en el agar Baird-Parker: Así mismo seleccionar las colonias para realizar las pruebas cuantitativas y cualitativas; dentro de estas últimas están comprendidas la coagulasa y la termonucleasa. 4. Reinocular cada una de las colonias aisladas y seleccionadas, que son características de este microorganismo, utilizando asa bacteriológica recta estéril, en caldo infusión cerebro corazón. 5. Incubar a 35 1 C durante 24 h.
6. Inocular e incubar en la misma forma, cepas tipo de S. aureus ATCC 6538 y S. epidermidis ATCC 12228, como controles positivo y negativo respectivamente de las pruebas bioquímicas. CUADRO 1. Número de colonias a evaluar de S. aureus . Cuenta total de colonias sospechosas Colonias sospechosas a caracterizar en una caja representativa bioquímicamente Menos de 50 UFC 3 51-100 UFC 5 101-150 UFC 7 3. Pruebas bioquímicas. 1. Realizar la confirmación bioquímica del microorganismo, haciendo las pruebas de presencia de las enzimas: coagulasa y termonucleasa. 3.1 Prueba de la presencia de la enzima coagulasa. 1. Con una pipeta estéril de 1 mL, tomar 0.2 mL de la suspensión del microorganismo que desarrolló en el caldo infusión cerebro corazón, adicionar 0.2 mL de plasma de conejo. Dicho plasma previamente diluido volumen a volumen con solución salina estéril. 2. Incubar en baño María o en incubadora, entre 35 y 37º C y observar durante 6 h. en intervalos de 1 hora; en caso de no presentarse formación de coágulo, prolongar el período de observación hasta por 24 h. 3. Para comprobar la coagulabilidad del plasma de conejo, tomar 0.5 mL de plasma reconstituido y depositarlo en un tubo de 13 X 100 mm, posteriormente añadir una gota de cloruro de calcio al 5%; se debe formar un coágulo entre 10 a 15 segundos. NOTA Analizar la consistencia del coágulo y registrar ésta, de acuerdo con los valores del cuadro 2. Considerar la prueba positiva solamente si hay formación de coágulo con un valor igual o superior a 2 cruces. CUADRO 2. Interpretación de las reacciones en la prueba de la coagulasa VALOR CARACTER STICA negativa No se observa formación de coágulo. Formación de coágulos pequeños 1+ (positiva) desorganizados. 2+ (positiva) Formación de coágulo pequeño organizado 3+ (positiva) Formación de un gran coágulo organizado
4+ (positiva)
Todo el contenido del tubo está coagulado. Al invertir el tubo este coágulo se mantiene en el fondo del mismo.
3.2 Prueba de la enzima termonucleasa. 1. Calentar 0.3 mL de la suspensión del microorganismo que creció en caldo infusión cerebro corazón durante 15 minutos en baño de agua hirviendo. 2. Hacer orificios circulares en el agar DNA y colocar una gota de la suspensión bacteriana, del punto anterior, con ayuda de una pipeta Pasteur estéril. Es recomendable incluir testigos tanto positivos ( S. aureus ATCC 6538), como negativos (S. epidermidis ATCC 12228). 3. Incubar a 35 2 C en cámara húmeda, durante 4 a 24 h. 4. Después de incubar, adicionar el colorante azul de orto-toluidina 0.1M a los orificios hechos en el agar DNA. (Existe un agar DNA que ya contiene el indicador de orto-toluidina). 5. La formación de un color rosa brillante extendido por lo menos un milímetro alrededor del orificio, en donde se inoculó, indicará que el microorganismo posee la enzima termonucleasa. 6. En el caso de no contar con orto toluidina, se puede utilizar HCl 1.0N como indicador. De encontrarse esta enzima, se observa un halo transparente alrededor de la colonia, seguido de un precipitado blanco. NOTA Si se utiliza el medio de cultivo comercial, generalmente ya tiene el indicador de orto toluidina, por lo que después de la incubación se podrá observar la coloración rosa en donde se inoculó, en caso de encontrarse dicha enzima. Opcionalmente se pueden realizar otras dos pruebas bioquímicas: la fermentación de manitol en anaerobiosis y la prueba para detectar la presencia de la enzima catalasa; cuando ambas pruebas son positivas, quiere decir que el microorganismo fermenta el manitol y produce ácido en condiciones anaeróbicas y además contiene la enzima catalasa. 3.3 Prueba de fermentación de manitol en anaerobiosis (opcional, no lo exige la norma). 1. Inocular 2 asadas en caldo manitol, de la suspensión del microorganismo que desarrollado en el medio infusión cerebro corazón. 2. Adicionar a cada tubo de caldo manitol que ha sido inoculado, entre 0.3 y 0.5 mL de parafina o aceite mineral estéril. 3. Incubar a 35C 2 C por 24 h. y observar los resultados.
4. Considerar la prueba como positiva, si se presenta desarrollo y vira el indicador. Si el medio contiene como indicador el rojo de fenol, el medio debe virar a color amarillo por la producción de acidez. 3.4 Prueba de la catalasa (opcional, no lo exige la norma). 1. Con una asa bacteriológica, tomar un inóculo del caldo infusión cerebro corazón después de su incubación, y colocarlo sobre un portaobjetos, 2. Adicionar una o dos gotas de peróxido de hidrógeno al 30%, mezclar perfectamente bien y observar los resultados. 3. Si se presenta formación de burbujas, se considera positiva la prueba, esto es que sí contiene la enzima catalasa. En caso de no formarse burbujas la prueba se interpretará como ausencia de esta enzima. CÁLCULOS Y EXPRESIÓN DE RESULTADOS Para determinar el número de S. aureus enterotoxigénico presentes en 1.0 g de alimento se deben de considerar: a) el número total de colonias sospechosas y caracterizadas en el agar Baird Parker y b) el número de colonias que resultaron positivas en las pruebas bioquímicas efectuadas. Ejemplo: Al analizar una torta de quesillo de acuerdo con esta metodología, se encontró que la caja Petri representativa estadísticamente, contenía 70 UFC sospechosas de S. aureus (negras, brillantes con halo y precipitado blanco). Éstas se localizaban en la caja Petri sembrada con la dilución 10-3 (0.001g/mL), como en este método se inoculan 0.1 mL el factor que hay que aplicar es 10 -4 (0.0001g) para este caso. Tomando en cuenta el cuadro número uno, se tomaron 5 colonias para caracterizarlas bioquímicamente. De estas 5 colonias analizadas, solamente 2 resultaron positivas para las pruebas de la enzima coagulasa y de la enzima termonucleasa. Para conocer ¿Cuántas UFC/g de S. auresus toxigénico, se encuentran en este alimento? y ¿se puede consumir el alimento?, el razonamiento es el siguiente: a) determinar el porcentaje de colonias de S. aureus toxigénico. Cinco colonias representan el 100% de UFC muestreadas, dos colonias positivas, ¿a qué porcentaje corresponden?, expresado en forma aritmética es: 5 UFC 2 UFC
X= 40%
100% X
El total de colonias sospechosas es 70 X 10 4 UFC/g puesto que se encontraron 70 UFC en la caja sembrada con 0.1 mL de dilución 10 -3:
70 UFC X
0.0001 g (10-4g) 1g X= 700,000 UFC/g de alimento.
De las 700,000 UFC/g de alimento, solamente el 40% son toxigénicas (tomando en cuenta el primer cálculo) entonces ¿cuántas UFC toxigénicas por gramo se encuentran en este alimento? 700,000 UFC/g X X=280,000 UFC/g
100% 40%
Tomando en cuenta solamente 2 dígitos y potencias de 10, la forma correcta de expresar el resultado es: Staphylococcus aureus enterotoxigénico= 28X104 UFC/g
Estas 280,000 UFC/g de alimento (28X104UFC/g), de acuerdo con lo que estupula la Norma Oficial Mexicana, el alimento se encuentra escasamente dentro de las especificaciones, sin embargo en la legislación estadounidense de acuerdo con lo que estipula la FDA (Jablonski, 2001) presentan riesgo para la salud pública; por lo que no se debe consumir. NOTA No olvidar que la metodología empleada es por extensión en superficie y que solamente números de unidades formadoras de colonias de S. aureus toxigénico superiores a 1x105 son potencialmente riesgosas y pueden causar intoxicación alimentaria. Sin embargo deben consultarse las especificaciones sanitarias concretas del alimento estudiado, para determinar la aceptabilidad o rechazo del alimento en función del número de UFC/g de alimento del microorganismo estudiado. No obstante debe hacerse notar que no existen especificaciones para todos los alimentos en forma específica, pero se deben desarrollar criterios a partir de las normas vigentes para otros alimentos similares que permitan aceptar o rechazar un alimento. Para elaborar un informe de resultados, se sugiere seguir las indicaciones que a continuación se expresan: Cuando las UFC encontradas en una caja Petri, están dentro del rango estadístico (de 15 a 150 UFC/caja), se reporta como en el ejemplo antes descrito. Si se está en el valor estimado, esto es que no existen colonias típicas, se debe reportar la sensibilidad del método, en este caso será de 100 UFC/g para muestras sólidas y 10 UFC/mL en caso de muestras líquidas.
Cuando todas las pruebas bioquímicas son negativas, se informará: < 10 UFC/mL en muestras líquidas de la dilución 1:10 < 100 UFC/g para muestras sólidas de la dilución 1:10 BIBLIOGRAFÍA. Jablonskin L.M. & Bohach G:A. 2001. “Staphylococcus aureus ” In:Doyle M. Beuchat. L:R. & Montville T:J. (Eds.) Food Microbiology Fundamentals & Frontiers. ASM. USA: 411-434. NOM-115-SSA1-1994. Bienes y servicios. Método para la determinación de Staphylococcus aureus en alimentos. Food and Drug Administration (2003) “Bacteriological Analytical Manual”.
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