9. Staphylococcus

PRÁCTICA # 9 “STAPHYLOCOCCUS” OBJETIVOS: Determinar el tipo de microorganismo sembrado de diferentes fuentes a través de su crecimiento en diferentes medios de cultivo y comprobado a través de diversas pruebas bioquímicas.  Describir las características microscópicas, culturales que permiten efectuar el aislamiento y la diferenciación entre Staphylococcus aureus y los estafilococos coagulasa negativa (ECN) Seleccionar los medios de cultivo adecuados para llevar a cabo la detección de los estafilococos  Elegir, Elegir, leer e interpretar las pruebas que permiten identificar a los estafilococos  

INTRODUCCIÓN STAPHYLOCOCCUS. Los cocos gram positivos aerobios y anaerobios facultativos, según su forma de división y agrupación, se integran en dos dos fami famililias as (Micrococcace Micrococcaceae ae y Deicrococcace Deicrococcaceae ae)) y otro otross géne género ross con con perso persona nalilida dad d prop propia ia como como el géne género ro Streptococcus. Streptococcus. La familia Micrococcaceae que tiene interés médico incluye aquellos que se agrupan de forma irregular o en tetradas, y está constituida por los géneros Staphylococcus, Staphylococcus, Micrococcus, Micrococcus, Planococcus y Stomatococcus. Los cocos gram positivos aerobios y anaerobios facultativos de interés médico están en los géneros Staphylococcus y Streptococcus, que a su vez comprende el neumococo (S. (S. pneumoniae). CONCEPTO Y CLASIFICACIÓN. Concepto Los estafilococos son cocos gram positivos de 0.5-1 μm de diámetro, inmóviles, aerobios y anaerobios facultativos, caracterizados en que se agrupan de forma irregular en racimos, producen catalasa y descomponen los azúcares por  fermen fermentac tación ión.. Son bacter bacterias ias poco poco exigen exigentes tes,, que se cultiv cultivan an fácilm fácilment ente e en medios medios comune comuness y presen presentan tan cierta cierta resistencia a los agentes externos, por cuyo motivo motivo se pueden encontrar en la naturaleza, especialmente en el medio ambiente que rodea al hombre, formando parte de la flora normal de la piel y mucosas e interviniendo en procesos patógenos diversos, sobre todo en infecciones supuradas e intoxicaciones alimentarias. Clasificación Se pueden distinguir las siguientes especies:

1. S. aureus, prototipo de los estafilococos patógenos. Es el agente causal de la mayoría de las infecciones; se

caracteriza por producir coagulasa o fermentar el manitol, elaborar diversas toxinas, en especial la toxina α, y sintetizar en su mayoría un pigmento amarillo dorado, no difusible, que colorea a las colonias. saprophyticus, prototipos de los estafilococos oportunistas. Son gérmenes comensales de la piel 2. S. epidermidis y S. saprophyticus, o libres en el medio ambiente, que en ocasiones pueden intervenir en procesos patógenos. Se caracterizan por no producir coagulasa ni toxina α, no fermentan el manitol y elaboran en su mayoría un pigmento blanco aporcelanado. La importancia de los estafilococos deriva de su aumento progresivo de resistencia a los antibióticos, sobre todo en el medio hospitalario, que junto con su resistencia a los agentes externos les permite difundir y producir infecciones y brotes epidémicos (infecciones hospitalarias), que plantean serios problemas epidemiológicos y terapéuticos. STAPHYLOCOCCUS AUREUS Estructura antigénica y clasificación en tipos La estructura antigénica de S. aureus es compleja y mal conocida. En la pared celular se han demostrado cerca de 30 antígenos, y los más importantes son:

1. El polisacárido A, específico de especie, constituido por ácidos teicoicos, polímeros de fosfato de ribitol, que están unidos al peptidoglicano por enlaces covalentes. Son antigénicos e inducen la aparición de anticuerpos, y se ha demostrado un aumento de anticuerpos antirrubitol en los casos de endocarditis estafilocócica. En S. epidermidis, los ácidos teicoicos son polímeros de fosfato glicerol y en S. saprophyticus, polímeros de fosfato de ribitol. Los bacteriófagos se fijan en esta capa.

2. La proteína A, específica de especie, se encuentra en la pared celular y puede liberarse en el medio. Presenta la

propiedad de unirse a la extremidad Fc de las IgG normales y a la extremidad F(ab) 2 de las IgG específicas, específicas, así como de activar el complemento. Existen, Existen, además, además, en la pared celular celular un número indetermin indeterminado ado de proteínas proteínas responsables responsables de la tipoespeci tipoespecificid ficidad. ad. Tambié ambién n se han aislad aislado o cierto cierto número número de cepas mucoides mucoides capsulad capsuladas, as, especial especialmen mente te en los animal animales, es, cuya composición e importancia no se conocen.

3. 4.

La especies S. aureus se caracteriza por la presencia de ácidos teicoicos, polímeros de fosfato de ribitol y proteína A. Pero, además por sus antígenos tipoespecíficos se ha podido subdividir en tipos siguiendo dos criterios: a) En serotipos, mediante el empleo de sueros tipoespecíficos, y se ha clasificado en 18 serotipos. b) En fagotitos o lisotipos, por el estudios de la sensibilidad de la cepa frente a un grupo de fagos seleccionados. Se conocen más de 100 fagotipos que por necesidades prácticas se han reunido en 4 grupos y un grupo no clasificado. Los serotipos 1, 2 y 3 se corresponden en líneas generales con los fagogrupos I, II y III. Es interesante señalar que en los tres primeros fagogrupos fagogrupos se encuentran encuentran la mayoría de las cepas patógenas para el hombre: hombre: en el grupo II, cepas extrahospitalarias y productoras de toxinas exfoliativa y, en el grupo III, la mayoría de cepas multirresistentes a los antibióticos pertenecientes a determinados serotipos o fagotipos.  Acción patógena Es debida fundamentalmente a la acción de antígenos de superficie, toxinas y fermentos1 STAPHYLOCOCCUS AUREUS SUBESPECIE AUREUS. Staphylococcus aureus subespecie aureus es sin duda el patógeno humano más importante entre los estafilococos. Se lo encuentra en el ambiente externo y en las narinas anteriores del 20 al 40% de los adultos. Otros sitios de colonización son los pliegues cutáneos, el periné, las axilas y la vagina. Aunque este microorganismo suele formar parte de la microflora humana normal, puede producir infecciones oportunistas importantes en las condiciones apropiadas. Los factores que pueden predisponer a un individuo a infecciones graves por S. por S. aureus incluyen los siguientes: Defectos

quimiotácticos de los leucocitos, sean congénitos o adquiridos. en la opsonización por anticuerpos. Defectos en la destrucción intracelular de las bacterias después de la fagocitosis. Lesiones cutáneas. Presencia de cuerpos extraños. Infecciones por otros agentes, particularmente virus. Enfermedades crónicas de base, como tumores malignos, alcoholismo, y cardiopatías. Administración profiláctica o terapéutica de agentes antimicrobianos. Defectos

En estas circunstancias S. aureus puede producir una variedad de procesos infecciosos que van desde infecciones cutáneas relativamente benignas hasta enfermedades sistémicas potencialmente fatales. Las infecciones cutáneas incluyen la foliculitis simple (infección superficial que rodea los folículos pilosos) y el impétigo (infección superficial de la piel observada frecuentemente en los niños). Así como furúnculos y carbuncos que afectan el tejido subcutáneo y producen síntomas sistémicos como fiebre. S. aureus se aísla con frecuencia de heridas quirúrgicas infectadas, las que pueden funcionar como focos para el desarrollo de infecciones sistémicas. La bronconeumonía estafilocócica adquirida en la comunidad se observa habitualmente en ancianos y se asocia con una neumonía viral como factor predisponiente. La neumonía nosocomial producida por S. por  S. aureus se observa en cuadros clínicos de enfermedad pulmonar obstructiva crónica, con intubación y aspiración. Las enfermedades malignas subyacentes se reconocen como factores de riesgo importantes para el desarrollo de una bacteriemia por S. por  S. aureus. aureus. La bacteriemia también puede “sembrar” localizaciones distantes distantes del organismo organismo y dar origen a una endocarditis, endocarditis, una osteomieli osteomielitis, tis, una pioartriti pioartritiss y la formación formación de abscesos abscesos metastáticos, particularmente en la piel, los tejidos subcutáneos, los pulmones, el hígado, los riñones y el cerebro. La meningiti meningitiss estafilocóc estafilocócica ica aparece aparece en pacientes pacientes con anormalida anormalidades des del sistema sistema nervioso nervioso central central relacionadas relacionadas con traumatismos, cirugía, tumores malignos e hidrocefalia y Staphylococcus aureus es la segunda causa más frecuente de meningitis asociada con derivaciones ventriculoperitoneales. También También es uno de los muchos microorganismos asociados con peritonitis en pacientes sometidos a diálisis peritoneal ambulatoria continua. Las toxinas estafilocócicas también son responsables de la necrólisis epidémica tóxica (síndrome estafilocócico de la piel escaldada) y del síndrome de shock tóxico. También hay cepas de S. aureus que pueden producir producir intoxicaci intoxicaciones ones alimentarias alimentarias debido a la elaboración elaboración de exotoxinas durante su desarrollo en alimentos contaminados. S. aureus posee varias propiedades que se supone que contribuyen a su capacidad de producir enfermedad. Sin embargo, estos factores de virulencia no se encuentran en todas las cepas de S. aureus y este microorganismo sigue 1

A. Fumarola, et al. Microbiología y parasitología medica. Segunda edición. Editorial Masson.

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siendo fuente de sorpresas constantes a medida que se descubren propiedades patogénicas nuevas y diferentes. Estas propiedades incluyen las siguientes. Formación de la cápsula Algunas cepas de S. aureus producen un exopolisacárido que puede evitar la fagocitosis del microorganismo por parte de los leucocitos polimorfonucleares. Estos exopolisacáridos han sido observados por microscopia electrónica en derivacione derivacioness de marcapasos, marcapasos, catéteres peritoneales peritoneales y guías intravenosas intravenosas infectadas infectadas por  S. aureus y han han sido sido demostrados inmunológicamente in Vitro. Este material puede facilitar la adherencia de los microorganismos a las células del huésped y a los dispositivos protésicos. Los aislamientos clínicos de S. aureus se han clasificado en ocho tipos de acuerdo con la inmunotipificación del polisacárido capsular y entre el 70 y el 80% de los aislamientos clínicos importantes pertenecen a los serotipos capsulares 5 u 8. Estos dos tipos capsulares, particularmente el tipo 8, también están asociados con otros factores de virulencias de S. aureus, aureus, como por ejemplo, la producción de la toxina del síndrome de shock tóxico. Además, una gran cantidad de cepas de S. aureus que son resistentes a la oxacilina, la penicilina antiestafilocócica utilizada con mayor frecuencia, expresan el serotipo 5 de polisacárido capsular. Los tipos capsulares 5 y 8 también se han encontrado en aislamientos animales de S. aureus. Proteína A La pared celular de S. aureus contiene esta peculiar proteína que tiene la capacidad de unirse a la región Fc de la molécula de inmunoglobulina G (IgG). La proteína A se encuentra unida al peptidoglucano de la pared celular y también puede ser segregada al medio durante el desarrollo. La proteína A funciona como un factor de virulencia al interferir en la opsonización y la ingestión de los microorganismos por parte de los leucocitos polimorfonucleares, activan al complemento y estimulan reacciones de hipersensibilidad de tipo inmediato y retardado. La proteína A es inmunogénica y en los individuos con infecciones graves producidas por S. por  S. aureus se encuentran anticuerpos dirigidos contra ella. La presencia de la proteína A en S. aureus constituye la base de las pruebas de coaglutinación que se utilizan muchos laboratorios clínicos para la identificación de microorganismos y para la detección de antígenos bacterianos en líquidos corporales. Constituyentes de la pared celular  La pared celular de S. aureus contiene peptidoglucano (polímeros de N-acetilglucosamina y de ácido N-acetilmurámico ligados en forma cruzadas), que son similares a los encontrados en otras bacterias gram positivas, y ácidos teicoicos, que son polímeros peculiares de ribitol (monosacáridos de cinco carbonos) con fosfatos. Los ácidos teicoicos participan en la adherencia adherencia específica específica de las bacterias bacterias gram positiva positiva a las superficies superficies mucosas. Además Además de conferir conferir rigidez y la elasticidad a la pared celular de los estafilococos los peptidoglucanos y los ácidos teicoicos poseen varias propiedades biológicas que se supone que contribuyen a la virulencia. Estas propiedades incluyen la capacidad de activar el sistema del complemento, de inhibir la quimiotaxis de las células inflamatorias y de estimular la producción de anticuerpos. Las pruebas sexológicas para la detección de anticuerpos contra estas moléculas han sido investigadas en lo que respecta a su posible valor diagnóstico o pronóstico; los resultados han sido desalentadores debido a la considerable superposición de títulos de anticuerpos entre individuos infectados y no infectados, el amplio espectro de infecciones y enfermedades producidas producidas por  S. aureus y la variabilidad dependiente del huésped de la respuesta inmune según la edad, otras infecciones y la inmunocompetencia general. Enzimas S. aureus produce varias enzimas que pueden contribuir a su virulencia. La producción de catalasa por parte de estos microorgani microorganismos smos pueden actuar para inactivar inactivar el peróxido peróxido de hidrógeno hidrógeno y los radicales libres tóxicos formados formados por el sistema mieloperoxidasa dentro de las células fagocíticas después de la ingestión de estos microorganismos. Tanto la coagul coagulasa asa libre libre como como la unida unida pueden pueden recubr recubrir ir las célula célulass bacter bacterian ianas as con fibrin fibrina a y tornar tornarlas las resiste resistente ntess a la opsonización y la fagocitosis. Las fibrinolisinas pueden degradar coágulos de fibrina y permitir la diseminación de la infección a los tejidos contiguos. En forma similar, la hialuronidasa hidroliza la matriz intercelular de mucopolisacáridos en los tejidos tejidos y, por lo tanto, pueden actuar diseminando diseminando los microorganism microorganismos os a zonas adyacentes. adyacentes. Las cepas de S. aureus que provocan furunculosis crónica son productoras de potentes lipasas que pueden contribuir a la diseminación de los microorganismos en los tejidos cutáneos y subcutáneos. Se ha descrito una fosfolipasa C específica para el fosfatidi fosfatidilinos linositol itol asociada con cepas recuperadas recuperadas de pacientes pacientes con síndrome síndrome de distrés distrés respiratori respiratorio o del adulto y coagulación intravascular diseminada. Los tejidos afectados por esta enzima se vuelvan más susceptibles al daño y la destrucción por componentes bioactivos del complemento y los productos de la activación del complemento. Los estudios inmunológicos y de especificidad de sustrato indican que S. aureus produce por lo menos tres tipos diferentes de beta-lactamasas. La producción estas enzimas puede ser inducible o constitutiva y hace que estos microorganismos sean resistentes a la penicilina y a la ampicilina. Los genes que codifican estas enzimas habitualmente residen en plásmidos que también poseen genes para la resistencia a diversos antibióticos, como la eritromicina y la tetraciclina. Estos genes de resistencia pueden ser transferidos a otras bacterias por transformación y tranducción. Hemolisinas

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Las hemolisinas de S. aureus poseen varias actividades biológicas. La alfa-hemolisina tiene efectos letales sobre una amplia amplia variedad variedad de tipos celulares, celulares, entre ellos los leucocitos leucocitos polimorfonucl polimorfonucleares eares humanos, y lisa eritrocitos eritrocitos de varias varias especies animales. La toxina es dermonecrótica por inoculación subcutánea y es letal para los animales cuando se le inyecta por vía intravenosa. También es una potente neurotoxina. Esta toxina es responsable del halo de eritrocitos bemolizados que se observa alrededor de las colonias de algunas cepas de S. aureus que se desarrollan en agar  sangre de carnero. La beta-hemolisina es una esfingomielinasa que tiene actividad contra una variedad de células. Es una hemolisina “caliente-fría” (es decir, sus propiedades hemolíticas son incrementadas por la exposición posterior de los eritrocitos a bajas temperaturas). La beta-hemolisina, junto con el factor CAMP producido por los estreptococos del grupo B. Toxinas La leuc leucoc ocid idin ina a es una una exot exotox oxin ina a que que ejer ejerce ce un efec efecto to tóxi tóxico co dire direct cto o sobre sobre la memb membra rana na de los los leuc leucoc ocititos os polimorfonucleares humanos que provoca desgranulación del citoplasma, edema celular y lisis. La toxina tiene dos componentes que interactúan en forma sinérgica para producir una granulocitopenia profunda. La forma de acción de esta toxina involucra la formación de poros que alteran la permeabilidad celular al potasio y otros cationes. Las exfoliatinas o toxinas epidermolíticas son producidas por ciertas cepas de estafilococos y consisten en dos proteínas, denominadas ET-A y ET-B, de 24.000 Da de peso molecular relativo de cada una. Las dos moléculas son diferentes desde el punto de vista bioquímico e inmunológico pero tienen actividades biológicas similares. La ET-A es una proteína termoestable cuyo gen estructural es cromosómico, en tanto ET-B es termolábil y de origen plásmido. Estas proteínas poseen actividad proteolítica y disuelven la matriz mucopolisacárida de la epidermis, lo que da como resultado la separación intraepitelial de las uniones celulares del estrado granuloso. Las cepas que producen una de estas toxinas o ambas son responsables del ”síndrome estafilocócico de la piel escaldada”. En este cuadro clínico se observa la formación formación de bullas bullas grandes grandes áreas del cuerpo, con la posterior posterior formación formación de escaras escaras en las capas superficiale superficialess de la piel. Esto da como resultado grandes áreas de piel denudada y en carne viva. La enfermedad se ve habitualmente en recién nacidos y lactantes. Ambas toxinas son antigénicas y los anticuerpos dirigidos contra ellas son protectores. Las enterotoxi enterotoxinas nas A a E son moléculas moléculas termoestables termoestables,, responsable responsabless de la característi características cas clínicas clínicas de la intoxicaci intoxicación ón alimentaria estafilocócica. El mecanismo exacto de acción de estas enterotoxinas se desconoce pero aumentan el peristaltismo intestinal. ESTAFILOCOCOS COAGULASA-NEGATIVOS Antiguamente los estafilococos coagulasa-negativos por lo general se consideraban contaminantes de poca importancia clínica. Sin embargo, en las últimas décadas estos microorganismos se han reconocido como agentes importantes de enfermedades humanas. Aunque se han descrito varias especies diferentes de estafilococos coagulasa negativos, relativamente pocos de ellos producen infecciones en los seres humanos. Sin embargo, como una mayor cantidad de laboratorios han intentado identificar estafilococos coagulasa- negativos se están reconociendo infecciones producidas por otras especies cada vez con mayor frecuencia. Los tipos de infecciones asociadas con los estafilococos coagulasanegativos incluyen las siguientes: Infecciones

urinarias, nosocomiales y adquiridas en la comunidad. producidas por dispositivos permanentes. Bacteriemia en huéspedes comprometidos. Endocarditis de válvulas cardíacas naturales y protésicas. Osteomielitis. Endoftalmitis posquirúrgica. Infecciones

ESPECIES DE STAPHYLOCOCCUS DE ORÍGEN HUMANO, ANIMAL Y AMBIENTAL Estafilococos encontrados en el hombre y en primates no humanos Especie S. haemolyticus S. warneri  S. hominis S. simulans

Comentarios. Integrante de la flora normal humana de la piel . Se encuentra también en primates no humanos. Esta especie, que representa aproximadamente el 1% de los estafilococos encontrados normalmente en la piel humana, en la actualidad es una causa bien reconocida de bacteriemia relacionada con catéteres, de endocarditis de válvulas naturales. Esta especie se encuentra en la piel humana y ha sido aislada como causa de bacteriemia en pacientes cancerosos. Encontrado en la piel y en la uretra de mujeres sanas. Ha sido identificado como causa de septicemia, osteomielitis y artritis séptica posterior a la reducción a cielo abierto de una fractura de peroné. Posee una cápsula que inhibe la fagocitosis in Vitro y contribuye a la virulencia in vivo.

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S. lugdunensis

S. capitis

S. schleiferi 

S. pasteuri  S. auricularis S. cohnii  S. xylosus S. saccharolyticus S. caprae S. pulvereri 

Se ha relacionado principalmente con endocarditis de válvulas naturales y protésicas, con celulitis de la piel y del tejido subcutáneo, con peritonitis, con prótesis de cadera infectadas y con abscesos mamarios. Integrante de la flora normal humano, se encuentra alrededor de las glándulas sebáceas del cuero cabelludo y de la frente. Recientemente la especie se ha dividido en dos subespecies, S. capitis subespecie capitis y S. capitis subespecie urealyticus. urealyticus. Esta última subespecie es ureasa-positiva. Ha sido aislada a partir de varias infecciones humanas, entre ellas empiema cerebral, infecciones de heridas, bacteriemia como complicación de una osteítis vertebral, infección de una prótesis de cadera. La especie ha sido dividida en dos subespecies; los aislamientos humanos se denominan S. schleiferi subespecie schleiferi subespecie schleiferi  schleiferi yy los aislamientos caninos reciben el nombre de S. schleiferi subespecie schleiferi subespecie coagulans. coagulans. Especie que se encuentra en muestras clínicas humanas y animales y en alimentos todavía no han sido asociada con procesos infecciosos y es fenotípicamente similar a S. warneri. Esta especie se encuentra en el conducto auditivo externo de los seres humanos y rara vez ha sido implicada en infecciones Esta especie se ha subdividido en dos subespecies denominadas S. cohnii subespecie cohnii subespecie cohnii y cohnii y S. cohnii subespecie cohnii subespecie urealytium. urealytium. Ambos microorganismos pertenecen a la flora normal de la piel. Este microorganismo se encuentra tanto en seres humanos como en primates no humanos y ha sido implicado como causa de infecciones de las vías urinarias superior e inferior. Esta especie anaerobia, se encuentra en las mucosas humanas. Originalmente aislado de cabras, recientemente se lo ha encontrado en la piel humana y en nuestras clínicas humanas. Especie coagulasa-negativa resistente a la novobiocina, se encuentra en seres humanos y en pollos.

Estafilococos encontrados en otros animales. Especie S. intermedius S. hyicus S. choromogenes S. sciuri  S. gallinarum S. lentus S. equorum S. delphini  S. felis S. muscae S. piscifermentans S. vitulus

Comentarios. Hallado como integrante de la flora de los perros, los hurones, los caballos y los gatos, pueden producir infecciones cutáneas, urinarias, óseas y del sistema nervioso central en varias especies animales Encontrado en cerdos, ganado vacuno y leche de vaca. Produce infecciones cutáneas en el ganado vacuno. Se encuentra normalmente en roedores y otros mamíferos pequeños, fundamentalmente ardillas. Esta especie se encuentra en aves de corral y no es patógena. Forma parte de la flora normal de las ovejas y las cabras. Una rara especie equina de importancia patógena indeterminada. Especie coagulasa-positiva que produce lesiones cutáneas purulentas en delfines. Produce otitis, cistitis, abscesos, heridas y otras infecciones cutáneas en gatos. Se encuentra como integrante de la flora transitoria de la superficie corporal de las moscas que viven en establos de vacas pero que no se ha encontrado en moscas que habitan en residencias humanas. Se encuentra en peces, en productos de pescados fermentados y en puré de soja. Se encuentra como parte de flora de los caballos, los ratones campestres y las ballenas piloto.

Otras especies de estafilococos (en su mayoría de origen animal). animal).2  Especie S. carnosus S. caseolyticus S. kloosii  S. arlettae

Comentarios Utilizado como cultivo iniciador en el procesamiento de productos cárneos como el salame y salchicha., Especie saprófita encontrada en la leche y otros productos lácteos y como parte de la flora del ganado vacuno y las ballenas. Encontrado en mamíferos, es de importancia clínica y ubicación taxonómica inciertas. Encontrado Encontrado en mamíferos mamíferos y aves, es de importancia importancia clínica clínica y ubicación ubicación taxonómica taxonómica inciertas.

INTOXICACIÓN ALIMENTARIA ESTAFILOCÓCINA. 2

Koneman, et al. Diagnóstco Microbiológico Texto Texto y atlas a color. Quinta edición. Editorial Medica Panamericana.

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La intoxicación alimentaria más común está causada por el coco Gram positivo Staphylococcus aureus. Este organismo produce varia enterotoxinas que secreta al medio circulante o alimento; si se come el alimento que contiene la toxina, en el plazo de 1-6 horas se observan severas reacciones que incluyen náuseas, con vómitos y diarreas. Se han identificado seis tipos de enterotoxinas de S. aureus: aureus: A, B, C1, C2, D y E. La enterotoxina A es la más frecuentemente está asociada a los brotes de intoxicación alimentaria estafilocócica. El mecanismo de acción de la enterotoxina A es el de un superantígeno e implica la estimulación sistémica de un gran número de células T. T. La enterotoxina A de S. aureus es un péptido pequeño, de peso molecular 30.000 Dalton, codificado por un gen cromosómico. La clonación y secuenciación de este gen, el gen entA, y de varios otros otros genes de enterotoxi enterotoxinas nas de S. aureus, aureus, muestra que esta familia de toxinas están relacionadas genéticamente. Las clases de alimentos más comúnmente implicadas en las intoxicaciones alimentarias son los productos cocidos al horno y rellenos de crema pastelera o de nata, las aves, la carne y los productos cárnicos, las salsas, las ensaladas con huevo y carne, los flanes y los aliños con nata para ensaladas. Si estos alimentos se mantienen en el frigorífico después de ser preparados, permanecen relativamente seguros ya que S. aureus es incapaz de crecer a bajas temperaturas. Sin embargo, con frecuencia esta clase de alimentos no se refrigeran y frecuentemente se mantienen en cocinas calientes o al aire libre, durante meriendas campestres. Bajo estas condiciones Staphylococcus, que pueden haber llegado al alimento desde un manipulador de alimentos, durante su preparación, crece y produce enterotoxina. Muchos de los otros alimentos alimentos implicados implicados en intoxicaciones intoxicaciones alimentarias alimentarias no se vuelven a cocinar cocinar de nuevo antes de comerlos, comerlos, pero incluso si se cocinan, la toxina es relativamente termoestable y puede permanecer activa. La intoxicación alimentaria estafilocócina puede evitarse con cuidados métodos higiénicos o almacenando los alimentos a bajas temperaturas para evitar el crecimiento microbiano, y eliminando todos los alimentos que hayan permanecido durante algunas horas a temperatura superior a 4 grados centígrados. 3

CURVA DEL CRECIMIENTO BACTERIANO La curva del crecimiento bacteriano resulta de la representación gráfica de la determinación periódica del número de células viables por mililitro que existen en un líquido inoculado con células microbianas provenientes de un cultivo que ha crecido previamente hasta la saturación. Dicha curva se divide en seis fases, mismas que se simbolizan con letras de la A a la F. A continuación se muestra un cuadro con las características principales de c ada fase y se desarrollan las más importantes. Parte de la Curva A B C D E F

Fase Rezago Aceleración Exponencial De retraso Estacionaria máxima Declinación

Tasa de Crecimiento Cero Creciente Constante Decreciente Cero Negativa (muerte)

 A: Fase de Rezago. Este periodo consiste en la adaptación de las células microbianas a su nuevo ambiente. En esta fase, las células microb microbian ianas as se encuen encuentra tran n empob empobrec recida idass en cuanto cuanto a metabo metabolit litos os y enzima enzimas, s, esto esto debido debido a las condic condicion iones es desfavorables que representaba el cultivo previo. Por lo anterior, en este lapso de tiempo se forman las enzimas y los metabolitos intermedios hasta alcanzar las concentraciones necesarias para reiniciar el crecimiento. Este periodo periodo se puede prolongar prolongar en el caso de que el medio de cultivo cultivo previo y las condiciones condiciones actuales resulten resulten tan diferentes que las células sean genéticamente incapaces de sobrevivir, por lo que sólo unas cuantas mutantes podrán subsistir, y obviamente se requerirá más tiempo para que éstas s e multipliquen lo suficiente y sea notorio el aumento de células. C: Fase Exponencial. Como el nombre lo indica, en esta fase las células se encuentran en un estado de crecimiento sostenido. Se sintetiza sintetiza nuevo material material celular a una tasa constante, pero éste material es en sí catalítico catalítico y la masa aumenta de manera exponencial. Lo anterior continua hasta que uno o más nutrimentos se agoten, o hasta que se acumule tal cantidad de metabolitos tóxicos que se inhiba el crecimiento. El nutrimento limitante para los organismos aerobios suele ser el oxígeno: cuando la concentración bacteriana es de aproximadamente 1 x 107/ml es necesario incrementar el ingreso de oxígeno mediante agitación o burbujeo; pero cuando la concentración alcanza 4 o 5 x 109 bacterias por ml, la tasa de difusión de oxígeno no puede satisfacer las demandas aun en un medio aireado, por lo que el crecimiento disminuye progresivamente. 3

Brock. Biología de los Microorganismos. Microorganismos. Octava edición. Editorial Prentice Hall.

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Durante el crecimiento exponencial, la tasa de crecimiento de las células (medida en gramos de biomasa producida por  hora), cuando el crecimiento no es limitado por los nutrimentos, se puede obtener multiplicando la constante de la tasa de crecimiento (k) por la concentración de biomasa. La constante de la tasa de crecimiento es la tasa a la cuál las células producen más células, y el valor que esta toma se interpreta como los gramos de biomasa producidos por cada gramo de biomasa preexistente creados en una hora. El crecimiento se denomina exponencial porque la biomasa se incrementa exponencialmente con respecto al tiempo. De lo anterior se deriva que, si graficamos el logaritmo de la concentración de la biomasa (o celular) en función del tiempo, como ocurre en la curva del crecimiento, obtendremos una línea recta como representación de esta fase. Esta fase puede prolongarse indefinidamente si las células se transfieren repetidamente a un medio nuevo (fresco) de composición idéntica al anterior, lo cual se logra de manera automática mediante dos aparatos: el quimiostato y el turbidostato. E: Fase Estacionaria Máxima. Como se explicó en la descripción de la fase anterior, ante el agotamiento de nutrimentos en el medio o la acumulación de metabolitos tóxicos el crecimiento cesa por completo después de un periodo de decrecimiento en la tasa de crecimiento, lo cual corresponde a la fase D o de retraso. No obstante, por lo general en esta fase se puede observar recambio celular, lo cual se debe a que, aunque existe una pérdida lenta de células por muerte, dicha pérdida se compensa exactamente por la formación de nuevas células a través de crecimiento y divisón. Así, la cifra de células viables se mantiene constante, aunque en realidad en el conteo aumente poco a poco el número de células, si se cuentan también las muertas. Para Para compre comprende nderr lo anteri anterior or debemo debemoss consid considera erarr que, que, para para una célula célula microb microbian iana, a, muerte muerte signif significa ica la pérdid pérdida a irreversible de la capacidad para reproducirse (crecer y dividirse), lo cuál se comprueba cuando una célula es incapaz de producir una colonia en cualquier medio. De lo anterior se deriva que designar a una célula microbiana como muerta no implica su destrucción física. La duración de esta fase depende de la naturaleza del microorganismo y de las condiciones del medio. F: Fase de Declinación. Esta fase, también conocida como fase de muerte, representa el decremento de células debido al aumento progresivo de la tasa de mortalidad, misma que tarde o temprano alcanza un valor sostenido. Por lo general, una vez que la mayoría de las células ha muerto, la tasa de mortalidad disminuye bruscamente, por lo que un número pequeño de sobrevivientes pueden persistir en cultivo por meses o años. Dicha persistencia puede deberse a que las células consiguen crecer gracias a los nutrimientos liberados por las células que mueren y se lisan, observándose recambio celular .4 MEDIOS DE CULTIVO Los medios de cultivo son una mezcla de nutrientes que en concentraciones adecuadas y en condiciones físicas óptim óptimas, as, permit permiten en el crecim crecimien iento to de los microo microorga rganis nismos mos.. Estos Estos medios medios son esenci esenciale aless en el Labora Laborator torio io de Microb Microbiol iologí ogía a por lo que un contro controll en su fabric fabricaci ación, ón, prepar preparaci ación, ón, conser conservac vación ión y uso, uso, asegur asegura a la exacti exactitud tud,, confiabilidad y reproducibilidad de los resultados obtenidos. Clasificación de los medios de cultivo En los laboratorios de microbiología se utilizan diferentes tipos de medios de cultivo que pueden ser preparados en forma líquida o en forma sólida. Usualmente para preparar un medio sólido se parte de un medio líquido al que se le añade un agente solidificante como el agar, la gelatina o la sílicagel. Los medios de cultivo se pueden clasificar de acuerdo a la naturaleza de sus constituyentes en:

naturales o complejos: complejos: constituidos por sustancias complejas de origen animal o vegetal, las que son ° Medios naturales usualmente complementadas por la adición de minerales y otras sustancias. En ellos no se conocen todos los componentes ni las cantidades exactas presentes de cada uno de ellos. definidos dos o sintét sintético icoss: son son los los medi medios os que que tien tienen en una una comp compos osic ició ión n quími química ca defi defini nida da cual cualititat ativ iva a y ° Medios defini cuantitat cuantitativam ivamente. ente. Generalmente Generalmente se usan en trabajos trabajos de investigac investigación. ión. (Para bacterias bacterias como: como: Echerichia coli y  Leuconostoc citrovorum) citrovorum) 4

Brooks, et. al., Microbiología Médica de Jawetz, Melnick y Adelberg, 16a ed.

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De acuerdo al uso del medio de cultivo, éstos se clasifican en:

° Medios de enriquecimiento: son medios líquidos que favorecen el crecimiento de un tipo de microorganismo en partic particula ular. r. Permit Permiten en aument aumentar ar el número número de microo microorga rganis nismos mos de ese tipo. tipo. Usualm Usualment ente e contie contienen nen una o más sustancias inhibidoras del crecimiento de los microorganismos con excepción de los que se quieren cultivar. Un medio de enriquecimiento se utiliza para aislar un tipo particular de microorganismo a partir de una población mixta de gran tamaño. Por ejemplo, las bacterias formadoras de endosporas pueden aislarse hirviendo una muestra de suelo y cultivando los supervivientes. Solamente las endosporas resistirán el tratamiento y podrán crecer. Las bacterias lijadoras de nitrógeno pueden seleccionarse cultivando el inóculo de suelo en un medio libre de nitrógeno, donde sólo ellas podrán crecer porque obtienen el nitrógeno de la atmósfera. Los ecólogos microbianos usan frecuentemente medios de enriquecimiento. Por ejemplo, para encontrar un microorganismo que degrade un determinado compuesto químico tóxico, se puede inocular la muestra de suelo en un medio en el cual la única fuente de carbono sea dicho compuesto. El microorganismo que prospere en él podrá ser utilizado en biorremediación. ° Medios selectivos: son parecidos a los de enriquecimiento, se diferencian por ser medios sólidos y están diseñados para para el aislam aislamien iento to de microo microorga rganis nismos mos especí específic ficos. os. Un medio medio select selectivo ivo favore favorece ce el crecim crecimien iento to de cierto ciertoss microorgan microorganismos ismos,, mientras mientras suprime suprime el crecimient crecimiento o de otros. otros. Los medios medios selectivos selectivos se utilizan utilizan para aislar especies especies particulares a partir de una mezcla compleja. Por ejemplo, se utiliza un medio selectivo, para aislar  Salmonella typhi, agente causal de la fiebre tifoidea, a partir de heces donde existen cientos de microorganismos diferentes. Algunos medios son selectivos porque contienen un producto químico, como la azida sódica, el telurito potásico o el cristal violeta, violeta, que inhiben inhiben el desarrollo de algunos algunos microorgan microorganismos ismos pero no de otros. otros. El agar SPS (denominado (denominado de esta forma forma porque porque contiene contiene sulfadiacina sulfadiacina y sulfato sulfato de polimixina) polimixina) se utiliza utiliza para identificar  identificar  Clostridium botulinum, botulinum, agente causal de una grave intoxicación alimentaría. El medio SPS permite el crecimiento de esta bacteria, pero inhibe el de otras especies de Clostridium. Clostridium. otros medios de cultivo selectivos utilizan un valor extremo de pH o una fuente de carbono poco común. ° Medios diferenciales: son medios que contienen indicadores de productos derivados de la actividad microbiana de los microorganismos. No contienen ningún tipo de sustancia con actividad antimicrobiana. Permiten revelar características fisiológicas de los microorganismos. Se utiliza un medio diferencial para identificar las colonias de un determinado microorganismo. Por ejemplo, para identificar  Streptococcus pyogenes, la bacteria que causa la escarlatina, se utiliza el medio de agar sangre es un agar que contiene hematíes. Las colonias de esta bacteria muestran a su alrededor  una zona transparente debido a que producen hemólisis (muerte y lisis de los hematíes). Escherichia coli  y las bacter bacterias ias relaci relaciona onadas das con ella ella se identi identific fican an en medios medios con un indica indicador dor de pH porque porque origin originan an produc productos tos metabólicos ácidos, que cambian el color del indicador y por tanto de sus colonias. ° Medios selectivos-diferenciales: Algunos medios son selectivos y diferenciales al mismo tiempo. El agar MacConkey es un ejempl ejemplo o de medio medio selectivo-diferencial, utilizado para detectar cepas de Salmonella y Shigella, bacterias entéricas (del intestino) que causan disenterías. Cualquier muestra de heces enviada al laboratorio esta plagada de bacterias pertenecientes a muchas especies. El agente selectivo del MacConkey actúa como una especie de tamiz grosero que disminuye el campo de identificación. El cristal violeta y las sales del medio inhiben el crecimiento de la mayoría de las bacterias Gram positivas (Salmonella y Shigella son Gram negativas). A partir de aquí, el componente diferencial del medio, en este caso la lactosa, comienza a ser importante. Salmonella y Shigella no fermentan la lactosa, pero la mayor parte de las enterobacterias sí lo hacen. Por tanto, las colonias de estas dos bacterias serán rojas, mientras que las restantes no lo serán. Por su composición los medios de cultivo se clasifican en:

Líquidos: conocidos como caldos, estos son especialmente útiles para hacer diluciones, para homogenizar mezclas de ° Líquidos: microorganismos, para enriquecer cultivos y para rehidratar cepas liofilizadas. ° Sólidos: Sólidos: Para separar microorganismos y favorecer el desarrollo de las colonias aisladas en las que es posible observar las características típicas de un solo tipo de microorganismo. Semisólidos: Son aquellos medios líquidos a los que se adiciona agar en concentraciones de 0.4 a 0.8%. Estos se ° Semisólidos: emplean para determinar la movilidad de los microorganismos microaerofílicos. Los medios de cultivo se pueden preparar en el laboratorio a partir de cada uno de sus constituyentes básicos o por  simple rehidratación de productos asequibles comercialmente (medios de cultivo deshidratados). Generalmente se prefiere el uso de los medios de cultivo deshidratados porque, además de simplificar el trabajo, con ellos se tiene mayor  probabilidad de obtener resultados reproducibles. Para su preparación se deben tener en cuenta los siguientes aspectos: ∼ Prepararlos sólo a partir de productos que provengan de fabricantes o proveedores que suministren productos de

calidad.

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∼ Utilizar agua destilada o desmineralizada con una calidad microbiológica y fisicoquímica adecuada.

∼Utilizar materiales de vidrio bien lavados y enjuagados con agua destilada o desmineralizada. ∼ Controlar el tiempo y la temperatura recomendada durante su esterilización. ∼ Nunca se deben exceder las condiciones señaladas por el fabricante.

 Almacenamiento de los medios de cultivo: Los medios de cultivo deshidratados se deben almacenar en envases sellados bajo las condiciones que señale el fabricante. Generalmente se almacenan en un lugar fresco (entre 15 y 25º), con poca humedad y protegidos de la luz solar di recta. Nunca se deben almacenar cerca de autoclaves, hornos, ni otra fuente de calor o vapor; Los medios de cultivo deshidratados se deben descartar cuando se hidraten o decoloren. Una vez que el medio de cultivo ha sido preparado y esterilizado se debe almacenar entre 2 y 8ºC, a menos que el medio medio requie requiera ra alguna alguna condic condición ión difere diferente nte.. Se deben deben manten mantener er en recipi recipient entes es bien bien cerrad cerrados os para para evitar evitar su deshidratación. Cuando se usa tapón de algodón se debe colocar por encima una envoltura de papel (Craft).5 MEDIOS DE CULTIVO UTILIZADOS: MAC CONKEY  Medio empleado ampliamente para aislar e identificar selectivamente a enterobacterias como Salmonellas, Shigella y coliformes a partir de heces fecales, orinas, aguas negras y diversos alimentos.  Formulación

aproximada en gramos por litro: Peptona de gelatina................ gelatina.......................... .................... ..............17.0 ....17.0 Mezcla de peptonas.................. peptonas........................... ................... ...............3.0 .....3.0 Lactosa............................................................10.0 Mezcla de sales biliares................. biliares.......................... ................... ............1.5 ..1.5 Cloruro de sodio................................................5.0 Agar..................................................................13.5 Rojo neutro.......................................................0.03 Cristal violeta....................................................0.001

Preparación: Suspender 50 gramos del medio en un litro de agua destilada o desionizada de buena calidad. Remojar bien entre 10 a 15 minutos y calentar a ebullición agitando continuamente. Hervir durante un minuto. Esterilizar en autoclave a 121ºC durante 15 minutos. Enfriar a 45-50 ºC y vaciar en cajas de Petri unos 20 ml por placa. Dejar solidificar y luego invertir  las cajas para evitar que se deposite un exceso de humedad en la superficie del medio. Usos: El espécimen puede sembrarse directamente en la placa por estría superficial, o bien inocularlo en medios líquidos d enriquecimiento, tales como caldo tetrationato, tetrationato, caldo selenito cistina o caldo GN. Incubar placas y caldos a 35ºC de 18 a 24 horas. Hacer resiembras de estas últimas en placas de Agar de Mac Conkey y volver a incubar. Se recomienda sembrar simultáneamente las muestras en otros medios mas selectivos tales como Eosina y Azul de metileno, metileno, Agar SS, Agar Tergito Tergitoll 7, Agar XLD, Agar Entérico Entérico Hektoen, Hektoen, Agar Sulfito Sulfito de Bismuto, Bismuto, Agar Verde Verde Brillante, Brillante, especial para Salmonellas. Los gérmenes Gram positivos son inhibidos por las sales biliares y el cristal violeta. Las enterobacterias fermentadoras de la lactosa bajan el pH del medio que es detectado por el indicador rojo neutro dando colonias rojas o rosadas. Las no fermentadoras de la lactosa dan colonias transparentes, incoloras o ambarinas. En el Agar MacConkey crecen también bacilos Gram negativos que no pertenecen a la familia Enterobacteriaceae, como Pseudomonas Pseudomonas y Aeromonas. Asimismo, Asimismo, pueden desarrollar desarrollarse se en número número reducido reducido colonias colonias puntiforme puntiformess de Streptococcus fecalis de color rojo y de algunos estafilococos cuyas colonias son pequeñas, opacas de color rosa pálido. Por último, este medio puede usarse en la diferenciación de especies de Mycobacterium. CARA CARACT CTER ERÍS ÍSTI TICA CAS S DE DE LAS LASA A COLO COLONI NIAS AS

MICR MICROO OORG RGAN ANIS ISM  M  O

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http://www.ucv http://www.ucv.ve/Farmacia/ .ve/Farmacia/Micro_web/Catedra Micro_web/Catedras02/metodesteril.p s02/metodesteril.pdf df : “Método estéril y Medios de cultivo” por la Prof. Sofía Gutiérrez de Gamboa

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Punt Puntif ifor orme mes, s, escasas

rosa rosa

páli pálido do,,

opac opacas as

y Estafilococos

MEDIO BASAL O/F (DE HUGH Y LEIFSON) Para identificar bacilos NO fermentadores de importancia médica y sanitaria, principalmente El medio Hugh y Leifson se emplea extensamente, junto con otros medios de diferenciación, para identificar al numeroso grupo de bacilos Gram negativos NO fermentadores de carbohidratos, por medio de las reacciones de oxidación y/o de fermentación de los mismos. Estos bacilos predominantemente oportunistas que pueden provocar  infecciones intrahospitalarias serias, por ejemplo las causadas por Pseudomonas. Sin duda alguna alguna,, una de las pruebas pruebas más importan importantes tes para el estudi estudio o de los bacilos bacilos NO fermen fermentad tadore oress de carbohidratos, fue introducida en 1953 por Hugh y Leifson cuyo medio permite conocer si el germen en cuestión oxida, fermenta o no al hidrato de carbono agregado al mismo. Se encontró que el al contenido de peptonas (1%) en los medios usuales utilizados en el estudio de las fermentaciones, producían al ser degradadas, la suficiente suficiente cantidad de aminas aminas alcalinas para neutralizar y enmascarar a la pequeña cantidad de ácidos formados por los microorganismo oxidativos. Bajando Bajando la concentració concentración n de peptona al 0.2% se podría podría determinar determinar si el carbohidrat carbohidrato o contenido en el medio era o no atacado por las bacterias en estudio. Los azucares que mas se emplean son la glucosa, lactosa, sacarosa, maltosa, manitol y xilosa.  Formula

aproximada en gramos por litro: Peptona de Caseína................... Caseína............................ ..............2.0 .....2.0 Cloruro de sodio........................................5.0 Fosfato Dipotásico.....................................0.30 Agar............................................................2.5 Azul de Bromotimol.............. Bromotimol....................... ................... ..............0.03 ....0.03

Preparación: Suspender 9.8g del polvo en un litro de agua destilada. Remojar de 10 a 15 minutos. Calentar agitando con frecuencia hasta disolución del material. Esterilizar en autoclave a 15 libras durante 15 minutos. Agregar 10 ml de solución de glucosa al 10% esterilizada por filtración por cada 100 ml del medio fluido. Mezclar y distribuir asépticamente a razón de 5 ml por tubo. Si prefiere, puede agregarse directamente 1.0 g del carbohidrato a cada 100 ml del medio 1.0g del carbohidrato a cada 100 ml del medio y esterilizar en autoclave a 118ºC durante 10 minutos, a fin de evitar la degradación del azúcar. El medio tiene un color verde. Usos: Inocular 2 tubos recientemente preparados, por punción profunda con el germen en estudio. Si el medio ya tiene cierto tiempo de preparación, fundirlo en baño María para eliminar los gases disueltos. Agregarle a un de los tubos una vez inoculado, una cepa de 4 a 5 mm de petrolato, aceite de parafina o vaspar estériles. No es recomendable el uso de aceite mineral. Incubar ambos tubos a 35% durante 48 horas o mas. Se puede observar  la producción de ácido por el cambio al color amarillo amarillo del medio, la formación formación de gas por la presencia de burbujas, y la la movilidad o inmovilidad del microorganismo. Los cambios se aprecian mejor comparando los tubos inoculados con uno que no lo hayas sido, que funcionará como control. Para facilitar la identificación del grupo de bacilos Gram negativos NO fermentadores, utilizar también el Agar Diferencial de Sellers y el Medio del indol Nitrito. Resultados:  Color amarillo en ambos tubos con o sin formación de gas: Carbohidrato fermentado. Degradación fermentativa.  Cambio únicamente en el tubo que no contiene aceite: Oxidación de azúcar. Degradación oxidativa.  Sin cambio en ninguno de los tubos: Microorganismos inertes. El carbohidrato no ha sido fermentado ni oxidado.  AGAR SAL Y MANITOL Aislamiento de estafilococos

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Es un medio selectivo muy empleado para aislar estafilococos patógenos de materiales clínicos diversos. También se utiliza en la industria alimenticia con los mismos fines, el aislamiento e identificación de Estafilococos que se encuentran en la leche y productos lácteos, carnes y derivados cárnicos incluyendo conservas de pescado.  Formula

aproximada en gramos por litro: Extracto de carne.................. carne........................... ................... ...........1.0 .1.0 Mezcla de peptonas.................. peptonas........................... .................10. ........10.0 0 Cloruro de sodio........................................75.0 D-Manitol...................................................10.0 Agar............................................................15.0 Rojo de fenol...............................................0.025

Preparación: Suspender 111g. del medio deshidratado en un litro de agua destilada y remojar unos 15 minutos. Mezclar bien y calentar a ebullición durante un minuto. Esterilizar en autoclave a 121ºC durante 15 minutos. Vaciar en cajas de petri. Usos: La degradación del manitol con producción de ácido cambia el color del medio, de rosado a amarillo. Debido a su alto contenido de cloruro de sodio, puede hacerse una siembra masiva del material en estudio. Generalmente se incuban las placas placas unas 36 hrs., apareciendo apareciendo las colonias de estafiloco estafilococos cos no patógenos patógenos de tamaño tamaño pequeño y rodeadas rodeadas de una zona roja; en cambio, las colonias de estafilococos patógenos fermentadores del manitol, dan colonias más grandes y rodeadas de una zona roja; en cambio, las colonias de estafilococos no patógenos de tamaño pequeño y rodeadas de una zona roja; en cambio, las colonias de estafilococos patógenos fermentadores del manitol, dan colonias más grandes y rodeadas de una zona amarilla. Si agregamos a cada litro del medio, una yema de huevo en condiciones de esterilidad, los estafilococos, que además de fermentar el manitol producen lipasa, darán un precipitado amarillento de ácidos grasos alrededor de la colonia. Este fenómeno concuerda bastante bien con la propiedad de coagular el plasma que presentan los estafilococos patógenos coagulasa positivos. BASE DE AGAR SANGRE  Aislamiento, cultivo y actividad hemolítica de gérmenes difíciles La base de Agar Sangre es adecuada adecuada para aislar aislar y cultivar cultivar diversos microorganismo microorganismoss de difícil difícil crecimient crecimiento. o. Al añadir  añadir  sangre es adecuada para aislar bacilos tuberculosis. Preparación: Suspender 40 g del medio deshidratado en un litro litro de agua destilada. Remojar entre 5 y 10 minutos. Hervir durante durante un minuto. Los matraces pueden taparse y colocarse directamente en autoclave. Esterilizar a 121ºC durante 15 minutos. Después de esto enfriar a 4 –50ºC y añadir de 5 a 10% de sangre desfibrinada estéril, homogenizar y vaciar en cajas de petri estériles. No es recomendable emplear sangre humana. De preferencia utilice sangre de cordero o de conejo. También es posible inocular el fondo de una caja petri estéril con un pequeño inóculo, y vaciar posteriormente el medio fundido a unos 50ºC; la caja s e hace girar suavemente para homogenizar la muestra. En algunos laboratorios se emplea el medio de cultivo preparado en tubos con tapón de rosca que se pueden inocular y posteriormente vaciar en cajas de petri estériles Usos: Para el aislamiento del Mycobacterium tuberculosis, la base de agar sangre con 0.1% de glicerol, 2.5% de sangre humana humana de banco de sangre y 100 unidades de penicilina penicilina por mililitro mililitro ha dado resultados resultados comparables comparables con los del medio de Lowenstein-Jensen. La base de agar Sangre también puede usarse para la preparación de antígenos. BASE DE CALDO ROJO FENOL Fermentación de carbohidratos; Medio usado para determinar las reacciones de fermentaciones.  Formula

aproximada en gramos por litro: Peptona de caseína................... caseína............................. ..............10g ....10g Cloruro de sodio........................................5g Rojo de fenol.............................................0.018g pH final 7.4+-0.2 Preparación:

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Disolver 15 g del medio deshidratado en un litro de agua destilada, agregar si se desea de 5 a 10 g de carbohidratos. Se puede agregar de 0.5 a 1.0 g de agar si el medio va a ser destinada al cultivo de organismos anaerobios. Si se desea investigar investigar la formación formación de gases, emplear emplear tubos Durham. Colocar los tubos en un recipiente recipiente adecuado y esterilizar de 116 a 118ºC durante 15 minutos. Usos: El base de caldo rojo de fenol puede usarse en los estudios de fermentación de muchas especies bacterianas. Los tubos de control sin carbohidratos deben inocularse e incubarse en paralelo con las pruebas de fermentación. Deben examinarse los cultivos frecuentemente ya que los diferentes carbohidratos pueden ser utilizados a velocidades variables. La aparición de color amarillo es indicio de fermentación. Para el cultivo de microorganismos anaerobios, el medio debe estar preparado recientemente o calentarse y enfriarse antes de su uso.  AGAR MUELLER HINTON  Pruebas de sensibilidad a antibióticos y cultivo de Neisseria En un medio muy rico en nutrientes que se recomienda para el aislamiento y desarrollo de gonococos y meningococos. También se emplea, sobre todo, en las pruebas de sensibilidad (antibiogramas)  Formula

aproximada en gramos por litro: Infusión de carne de res.................. res............................ .................... ...........300.0 .300.0 Peptona de caseína Ácida................ Ácida.......................... ................... ..........17.5 .17.5 Almidón.................................................................1.5 Agar.......................................................................17 pH final.................................................................. 7.4 +- 0.2 Preparación: Suspender 38 g del medio deshidratado en un litro de agua destilada. Remojar de 10 a 15 minutos. Mezclar bien agitando frecuentemente. Hervir durante un minuto, y esterilizar a 121ºC por un tiempo no mayor de 15 minutos. Enfriar a 40-45ºC y vaciar en cajas de petri. Si se desea, pueden prepararse placas o tubos de agar “chocolote”, previa adicción de sangre de carnero o humana, preferiblemente la primera, calentando en baño María a 80ºC 10 minutos. No sobrecalentar el medio en ningún momento. Usos: Es un medio útil para el desarrollo de bacterias del genero Neisseria. Se recomienda incubar las cajas a 35ºC, en atmósfera de CO2. El medio deberá mantenerse húmedo en su superficie; esto puede lograrse si dentro de la jarra, envases de hojalata, frasco de vidrio de boca ancha, etc., se coloca una esponja o algodón húmedo y una vela encendida, cerrando luego herméticamente. Para realizar las pruebas de sensibilidad con sulfonamidas, las cajas deben examinarse después de 12 a 18 horas de incuba incubació ción. n. Despué Despuéss de este este tiempo tiempo se tendrá tendrán n que revisa revisarr periód periódica icamen mente te las zonas zonas de inhibi inhibició ción n ya que el microorganismo puede desarrollar cuando la concentración del agente antimicrobiano comienza a disminuir. disminuir.

Se obtiene mejores resultados resultados para aislar Neisserias Neisserias patógenas patógenas preparando preparando un agar chocolate con el Mueller Hinton adic adicio ioná nánd ndol ole e a cada cada 100 100 ml del del medi medio o term termin inad ado o y flui fluido do 1.0 1.0 ml de la susp suspen ensi sión ón VCN, VCN, mas mas 1.0 1.0 ml del del polienriquecimiento.   AGAR TCBS Para cultivar Vibirios selectivamente; Para el aislamiento selectivo de vibrios patógenos a partir de materiales clínicos, aguas y alimentos.  Formula

aproximada en gramos por litros: Extracto de levadura................. levadura........................... ................... ...........5.0 ..5.0 Mezcla de peptonas.................. peptonas........................... ................... ...........10.0 .10.0 Citrato de sodio.............................................10.0 Tiosulfato de sodio........................................10.0 Bilis de buey..................................................5.0 Colato de sodio..............................................3.0 Sacarosa........................................................20.0

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Cloruro de sodio............................................10.0 Citrato de hierro.............................................. 1.0 Azul de timol....................................................0.04 Azul de bromotimol........................................0.04 Agar................................................................14.0 Preparación Suspender 86 g del polvo en un litro de agua destilada. Remojar de 10 a 15 minutos. Calentar agitando con frecuencia y hervir durante un minuto. Enfriar entre 45-50ºC y vaciar en cajas de petri. No esterilizar en autoclave. Usos: Se emplea ampliamente ampliamente para aislar y cultivar diversas especies del género Vibrio que pueden provocar cólera, diarreas coliformes e intoxicaciones por alimentos contaminados. Las 2 últimas afecciones provocadas sobre todo, a partir de dive divers rsos os pesc pescad ados os y mari marisc scos os que que se ingi ingier eren en crud crudos os o semi semicu cudo doss y que que pued pueden en ser ser caus causad adas as por  por  Vibrio  parahemolyticus.  parahemolyticus. El agar TCBS, es altamente inhibitorio para las Enterobacterias, incluyendo coliformes y proteus. Los Enterococos son también inhibidos en gran parte, de tal manera que se favorece grandemente la proliferación de los Vibrios, como el antes mencionado, el V. Cholerae y el V. Alginolyticus. El agar TCBS, es altamente inhibitorio para las enterobacterias, incluyendo coliformes y Proteus. Los enterococos son también inhibidos en gran parte, de tal manera que se favorece grandemente la proliferación de los vibrios, como el antes mencionado, el V. Cholerae y el V. Alginolyticus. El material sospechoso, se siembra masivamente por estría superficial y se incuba a 35ºC, de 18 a 24 horas. Casi todos los vibrios fermentan la sacarosa y dan colonias amarillentas por la producción de acido. Algunas cepas de Proteus fermentadores de la sacarosa pueden formar colonias amarillentas similares a las de los vibrios. vibrios.6 AGAR Su composición composición es en base de polímero polímero de galactosa galactosa y acido acido poligalact poligalacturónico urónico;; su fuente fuente es es algas marinas marinas (Rodófitas), su enzima catabólica es agarasa. El agar nutritivo es usado como medio de cultivo para el crecimiento de bacterias y hongos, pero no para virus (aunque los virus bacteriófagos crecen frecuentemente en bacterias cultivadas en agar). agar).7 MEDIO DE STUART Está Está descri descrito to como como un medio medio de transp transport orte e eficaz eficaz para para la recupe recuperac ración ión y viabil viabilida idad d de microo microorga rganis nismos mos como como Pneumococo, Strep.pyogenes , N. Gonnorrhoeae,Haemophilus sp. Y otros microorganismos lábiles. Se utiliza también para el transporte de muestras muestras de secreciones oculares, óticas, heridas y abscesos. Los microorganismos microorganismos permanecen viables de 6 días a 8 semanas. Se recomienda para la toma de muestras en sitios estériles. MEDIO DE CARY-BLAIR Se utiliza para el transporte de muestras fecales o raspados réctales para Coprocultivo. Se recomienda este medio, ya que permite el desarrollo de Salmonellas y Shigellas aún después de 49 días a 28ºC, Vibriones y campylobacter  permanecen viables hasta por 22 días a 28ºC. 28ºC.8 PRUEBAS BIOQUÍMICAS Prueba de Coagulasa: La coagulasa es una proteína de composición química desconocida y que resulta relativamente termoestable, ya que resiste temperaturas de hasta 60ºC durante 30 minutos; es muy sensible a la acción de enzimas proteoliicas y, como posee una actividad similar a la de la protrombina (que la capacita para convertir el fibrinógeno en fibrina, aún cuando en el medio de reacción se encuentren ciertas sustancias anticoagulantes), permiten que el infectólogo lo detecte mediante reacciones simples.

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Manual Bioxon, p.p 26, 28, 29, 33, 39, 41, 52 www.wikipedia.org http://www.lablinsan.cl/p http://www.lablinsan.cl/productos/page8.htm roductos/page8.htmll

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En cuanto a su función in vivo, vivo, ésta consiste principalmente en interferir la fagocitosis, debido a que genera la producción de redes de fibrina alrededor de los microorganismos, impidiendo que el fagocito entre en contacto con ellos para englobarlos; sin embargo, al parecer también neutralizar la actividad antimicrobiana que el suero normal manifiesta contra los agentes infectantes. Tocante a su mecanismo de acción, existen evidencias de que la coagulasa puede inducir la activación de un mecanismo mecanismo alterno de coagulación coagulación,, habilitand habilitando o a un componente componente del plasma, plasma, denominad denominado o factor factor reactivo reactivo de la coagulasa o FRC, para convertir el fibrinógeno en fibrina. De hecho, se sugiere que la coagulasa es una sustancia muy parecida a la protrombina que, al reaccionar con el FRC, forma un compuesto muy parecido a la trombina. Este paso es el decisivo por que, como es sabido, es la trombina la que activa al fibrinógeno para formar fibrina en el proceso normal de la coagulación. De acuerdo a lo anterior, la coagulasa origina la coagulación del plasma en dos pasos: inicialmente se verifica una reacción entre la enzima producida por el microorganismo y el FRC y posteriormente, las redes de fibrina son producidas por efecto del complejo formado en el paso anterior. Recordando el proceso que se efectúa en la última etapa de la coagulación sanguínea en el organismo, es posible relacionar el mecanismo asociado a la enzima estafilococcica Otro aspecto importante en la realización de la prueba, radica en la elección del plasma que se va a emplear; debe considerarse principalmente su origen, ya que se ha encontrado que algunas cepas presentan resultados positivos con el humano y el de conejo, pero negativos con el bovino. La reacción se considerará positiva si ocurre cualquier grado de coagulación visible dentro del tubo. Las bacterias coagulasa fuertemente positiva pueden producir el coagulo dentro de las primeras cuatro horas, razón por la que es recomendable leer el resultado en intervalos intervalos de 30 minutos, ya que S. aureus también produce fibrinolisinas, y la acción acción de éstas puede destruir el coágulo, coágulo, provocando la obtención obtención de resultados resultados falsos negativos cuando se toman toman lapsos mayores. Otras cepas de S.aureus sólo son capaces de producir suficiente cantidad de coagulasa hasta que transcurren cerca de 18 h. Por tal motivo, es conveniente revisar nuevamente a las 24 h los cultivos que en los primeros tiempos se observen como coagulasa negativa. Es importante importante hacer notar que, a mayor virulencia virulencia de la cepa analizada, analizada, menor será el tiempo tiempo en que la prueba prueba será positiva. En el laboratorio, la prueba de coagulasa se utiliza más comúnmente para diferenciar al Staphylococcus aureus (coagulasa positivo) de otros Staphylococcus. Principio La coagulasa se halla presente en dos formas, “libre” y “fija”, cada una de las cuales posee diferentes propiedades que requieren el uso de técnicas de determinación diferentes: Coagulasa fija (prueba en portaobjetos): la coagulasa fija está unida a la pared celular bacteriana. Los hilos de fibrina formados entre las células suspendidas en plasma (que contiene fibrinógeno) provocan su aglutinación, indicada por la presencia de agregados visibles en el portaobjetos. Coagulasa libre (prueba en tubo): la coagulasa libre es una enzima extracelular que se halla presente en los filtrados de cultivos. Cuando una suspensión de bacterias productoras de coagulasa se mezcla en partes iguales con plasma en un tubo de ensayo, se forma un coágulo visible como consecuencia de la utilización de los factores de coagulación del plasma de manera similar a cuando se añade trombina. Medios y reactivos  Plasma coagulasa (Difco, o BBL)  Cultivo

de Staphylococcus de 24 horas en un agar nutriente o caldo nutriente.

Procedimiento Prueba en portaobjetos Colocar una gota de agua destilada sobre un portaobjetos Emulsionar suavemente el organismo en estudio en la gota de agua de manera de obtener una suspensión cargada homogénea. Agregar una gota de plasma reconstituido junto a la gota de la suspensión del m.o. Mezclar bien con el asa. Inclinar el portaobjetos hacia uno y otro lado, observando la formación inmediata de un precipitado granular o de grumos blancos. Prueba en tubo Colocar asépticamente 0,5 ml de plasma reconstituido en el fondo de un tubo estéril. Añadir 0,5 ml de cultivo de 24 horas (o suspensión en suero fisiológico de un cultivo en placa).

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Mezclar por rotación el tubo, evitando remover o agitar el contenido. Colocar en baño de agua a 37°C y observar cada hora hasta 4 horas y luego a las 24 horas, la formación de un coágulo visible.

Interpretación Prueba en portaobjetos: una reacción positiva se detecta usualmente en 15 a 20 segundos por la aparición de un precipitado granular. La prueba se considera negativa si no se observa aglutinación en 2 a 3 minutos. Esta prueba es solo presuntiva y todos los cultivos que den resultados negativos o positivos tardíos deben verificarse mediante la prueba en tubos ya que algunas cepas de Staphylococcus aureus no producen coagulasa fija. Prueba en tubos: 1+: pequeños coágulos no organizados. 2+: pequeños coágulos organizados. 3+: gran coágulo organizado. 4+: todo el contenido aparece coagulado y s e mantiene cuando se invierte el tubo.  Se consideran positivos los grados 3+ y 4+ Controles Positivo: S.aureus S.epidermidis: Negativo: S.epidermidis: Prueba de catalasa La catalasa es una enzima que descompone al peroxido de hidrógeno (H 2O2) en oxigeno y agua. Químicamente es una hemoproteina bastante similar a la hemoglobina lo están en estado reducido (Fe++). Exceptuando a los estreptococos y a gardnerella vaginalis, las bacterias aerobias y facultativas poseen esta enzima, no así la mayoría de las anaerobias que, con el objetivo de llevar a cabo la degradación del mismo sustrato, producen la peroxidasa. Dentro del laboratorio de Bacteriología, la prueba de la catalasa se utiliza generalmente para diferenciar al género Streptococcus (-) del Staphylococcus (+) y, con menor frecuencia, para hacerlo entre las especies de bacilos Gram positivos y entre las micobacterias. Para llevarla acabo es necesario disponer, por un lado, de una solución de peróxido de hidrógeno al 30 % y por otro, de un cultivo puro de 18-24 h del microorganismo por probar, contenido en una caja de Petri o bien en tubos de ensa yo exentos de sangre, toda vez que los eritrocitos poseen esta actividad enzimática. El procedimiento más sencillo y rápido incluye el uso de un portaobjetos, en el cual se colocan, primeramente, una asada del microorganismo y posteriormente, se vierten sobre ésta una o dos gotas de la solución que está en contacto con las células, se empiecen a notar burbujas ocasionadas por el O2 que se desprende. 9 Prueba de oxidasa Esta prueba sirve para determinar la presencia de enzimas oxidasas. La reacción de la oxidasa se debe a la presencia de un sistema citocromooxidasa que activa la oxidación del citocromo que es reducido por el oxígeno molecular que produce agua o peróxido de hidrógeno según la especie bacteriana. El oxígeno actúa por tanto como aceptor final de electrones en la cadena transportadora de electrones. Por lo general, el sistema citocromooxidasa sólo se encuentra en los organismos aerobios, algunos anaerobios facultativos y, excepcionalmente, en algún microaerófilo (Vibrio ( Vibrio fetus), fetus), pero los anaerobios estrictos carecen de actividad oxidasa. Asimismo, la presencia de oxidasa va ligada a la producción de catalasa, ya que ésta degrada el peróxido de hidrógeno que se produce como consecuencia de la reducción del oxígeno y cuya acumulación es tóxica. La prueba de la oxidasa se usa sobre todo para Identificar todas las especies de Neisseria (+) Diferenciar Pseudomonas de los miembros oxidasa negativos de las enterobacterias. Diferenciar Pseudomonas

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Manual de practicas Bacteriología; Q.F.B. R. Garza Velasco; departamento de Biología; facultad de Química, UNAM. p.p 7-21

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El reactivo de la oxidasa más recomendado es la solución acuosa al 1% de diclorhidrato de tetrametil- p tetrametil- p-fenilendiamina -fenilendiamina (reactivo de Kovacs). Es menos tóxico y mucho más sensible que el correspondiente compuesto dimetilo (reactivo de Gordon y McLeod), pero es más caro. Este reactivo tiñe las colonias oxidasa positivas de color lavanda que vira gradualmente a púrpura-negruzco intenso. Realización de la prueba:

1. Método en placa directa Agregar directamente 2-3 gotas de reactivo a algunas

colonias. No inundar toda la placa y no invertirla. los cambios cambios de color. color. Con el reactivo de Kovacs la reacción reacción se produce produce en unos 10-15 segundos, segundos, mientras que con el de Gordon y McLeod es dentro de los 10-30 minutos. 1. Método indirecto sobre papel  Colocar un trozo de papel de filtro de 3x3cm aproximadamente en una placa de Petri. Agregar 2-3 gotas del reactivo de Kovacs en el centro del papel. siembra iembra una colonia sobre el papel impregnado. Extender con el asa de s La reacción de color positiva se produce a los 5-10 segundos. 10 Observar Observar

TINCIÓN DE GRAM La tinción de Gram es usada para clasificar bacterias sobre la base de sus formas, tamaños, morfologías celulares y reacción Gram (color). A nivel del laboratorio es útil como test para un rápido diagnóstico presuntivo de agentes infecciosos, tanto en muestras como en cultivos en crecimiento, y adicionalmente sirve para valorar la calidad de la muestra clínica. Las bacterias se tiñen gram positivas (+), gram negativas (–) o no se tiñen debido a sus diferencias en la composición de su pared y arquitectura celular. Las bacterias gram (+) tienen una gruesa capa de péptidoglucano y gran cantidad de ácidos teicóicos que no son afect afectado adoss por la decolo decolorac ración ión con alcoho alcoholl y/o aceton acetona, a, reteni reteniend endo o el colora colorante nte inicia iniciall acompl acompleja ejado do con iodo iodo y visualizándose en distintos grados de tonos desde el violeta al azul claro, dependiendo de si la naturaleza de su pared celular está intacta o dañada (por tratamientos antibióticos, edad celular…). Las bacterias gram (–) tienen en su pared celular una delgada capa de peptidoglucano ligada a una membrana externa por moléculas de lipopolisacáridos. Esta membrana externa es dañada por el alcohol y/o acetona de la decoloración, permitiendo que el primer colorante acomplejado con iodo escape y sea reemplazado por el contracolorante. Clásicamente los reactivos utilizados para la realización de la tinción de Gram han sido el cristal violeta como colorante inicial, la solución de lugol para acomplejar a éste, el alcohol y/o acetona para la decoloración y la safranina o fucsina básica como contracolorante. Existen una serie de puntos con respecto a un buen control de calidad de las tinciones de Gram, y que deben ser  tenidas en cuenta antes de su realiz ación, a saber: · Diariamente se debe comprobar que no existen precipitados ni cristales en la solución de cristal violeta. Si los hay, filtrar antes de su uso. · La estabilidad de la solución de cristal violeta, alcohol y/o acetona, safranina o fucsina básica es de 1 año y la de la solución de lugol de 6 meses, todas ellas conservadas en frascos cerrados (la evaporación puede alterar su efectividad) a temperatura ambiente. · Cada nuevo lote, aunque lo recomendable sería diariamente, preparar tinciones con cepas de colección de E.coli , S.aureus o S.epidermidis para comprobar los resultados esperados. · Ciertos procedimientos de laboratorio pueden dificultar la interpretación microscópica de la tinción, como son la prepar preparaci ación ón de extens extension iones es demasi demasiado ado gruesa gruesas, s, uso de portas portas que no han sido sido prelav prelavado adoss o deseng desengras rasado ados, s, sobrecalentamiento en la fijación y excesivos lavados durante la tinción. Todos los anteriores son causas comunes de pobres resultados en la tinción de Gram. · Debe tenerse en cuenta que no todos los microorganismos observados en una tinción pueden ser cultivados, y al contrario, algunos no observados pero presentes c onsiguen ser recuperados en el c ultivo. · Supervisión diaria de unas cuantas tinciones elegidas al azar por personal especializado, para confirmación de coincidencias y posibles discrepancias. Otras consideraciones importantes que deben ser revisadas e inspeccionadas por microscopía tras la realización de la tinción son:

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http://www.j http://www.joseacortes.com/m oseacortes.com/microbiologia/prueba icrobiologia/pruebasbioq/oxidasa.htm sbioq/oxidasa.htm

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 Como regla para evidenciar una buena decoloración, y teniendo en cuenta la fuente de la muestra, el fondo de la

tinción tinción deberá ser claro o ligeramente ligeramente gram (-). Si hay leucocitos se observarán completame completamente nte gram (-), y si hay levaduras tipo Candida completamente gram (+).  Para una buena interpretación de la tinción, el grosor de la extensión no debe permitir que aparezcan más de 2 células solapadas unas encima de otras. Examinar la tinción tinción en busca de evidencias evidencias de inflamaci inflamación ón (células (células polimorfon polimorfonuclead ucleadas, as, células células mononuclea mononucleadas das y/o  Examinar hematíes). La presencia de células epiteliales, bacterias de la flora, restos alimenticios…, según el producto patológico que estemos observando, pueden indicar una mala obtención de éste.  Inspeccionar distintas áreas de la tinción en busca de microorganismos. Prestar más atención en aquellas tinciones con signos de inflamación de pacientes inmunocompetentes, que en aquellas en donde no se observen éstos. Si no se detectan se indicará como “No se observan microorganismos”. Si se observan, se informará su número relativo, el tipo de microorganismo y su reacción gram. Se debe ser cuidadoso al informar si solo se observa 1 ó muy pocos (especialmente si no existen signos de inflamación), ya que los recipientes de recogida de muestras, los portas y algunos cultivos pueden contener bacterias no viables ni significativas pero contaminantes que nos aparecerán en la tinción. En cuanto a la reacción gram y características morfológicas de los microorganismos visualizados, estas son:  Gram:

 Positivo: de violeta fuerte a azul claro.  Negativo: rosa o rojo (en el caso de carbol-fucsina el rojo será intenso).  Variable: microorganismos parcialmente positivos y negativos. Puede ser debido a una mala extensión, fijación

o tinción, tinción, presencia presencia de células viejas, daño en la pared celular celular o por particularidad particularidades es especiales de la pared celular de ciertos microorganismos. generalmente el fondo alrededor alrededor de ellos de un ligero gram (-). Los  Neutro: no toman ningún color, siendo generalmente microorganismos pueden ser intracelulares. Esta reacción gram ha sido vista en tinciones de muestras clínicas en donde están presentes elementos fúngicos o algunas especies de micobacterias.  Otras características: a examinar en el gram son si la tinción de los microorganismos es homogénea, bipolar, en cuentas o gotas, punteada, en barras o irregular. Formas:

cocos, cocoid cocoides, es, cocoba cocobacil cilare ares, s, bacilo bacilos, s, filame filamento ntosos sos (ramif (ramifica icados dos o no) y levadu levadurif riform ormes. es.  Totales: cocos, Extremos: redondeados, afilados, romos, en forma de palo de tambor o inflado (por vacuolas, esporas, acúmulos de cualquier naturaleza…) y cóncavos.  Lados: paralelos, ovoides, cóncavos e irregulares.  Eje mayor: recto, curvado o en espiral. Pleomorfismos: variación en la forma de un mismo conjunto de microorganismos. Ocurre en algunas especies  Pleomorfismos: de difteromo difteromorfos, rfos, Bacteroide Bacteroidess spp., filame filamento ntosos sos ramifi ramificad cados os (  Actinomyc Actinomyces es spp,…), por tratam tratamien ientos tos antibióticos. Tamaños: teniendo en cuenta que el tamaño medio de un hematíe es de 7 mm y el de los gránulos citoplasmáticos de

los leucocitos polimnorfonucleares son de 0,2-0,3 mm:

mm), pequeño (0,3-0,5 mm), medio medio y grande.  Totales: minúsculo (< 0,3 mm),  Longitud: corto (0,5-1 mm), medio, largo y filamentoso (10-30 mm).   Anchura: delgado, medio y grueso.  Pleomórficos: variación en el tamaño de un mismo conjunto de bacterias. Características agrupacionales: microorganismos aislados, en pares, en cadenas, tétradas, en grupo o arracimados,

en empalizada, en letras chinas, empaquetados, en formas angulares tipo V o L .11

TOMA DE MUESTRA

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http://www.a14.san.gva.es/labm/gram.htm

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Consideraciones generales para la toma de muestra: 1. Debemos saber QUE vamos a tomar como muestra (esputo, sangre, etc.) 2. PORQUE vamos a tomar la muestra (con fines de diagnostico, investigación) 3. COMO vamos a tomar la muestra (punción, raspado, etc.) 4. DONDE vamos a tomar la muestra (piel, faringe, etc.) 5. CUANDO vamos a tomar la muestra (ayuno, etc.) Características de una muestra:          

Ser obtenida del lugar donde asiente la patología. Generalmente tomada de los bordes de la lesión. Ser cualitativamente optima para su estudio. Alcanzar cuantitativamente un volumen razonable En la mayoría de los casos ser de emisión reciente. En algunos casos haber sido obtenida cuando el paciente esta atravesando determinadas instancias evolutivas de su patología. Obtenida siguiendo criterios anatómicos y funcionales. Perfectamente envasada, evitando recipientes que potencialmente puedan producir contaminaciones accidentales. Enviada inmediatamente al laboratorio para su estudio o si tiene que transcurrir algún tiempo será enviada en recipientes especiales o en medios de cultivo de transporte. Obtenida con material esterilizado y en condiciones de asepsia.

Procedimiento para la toma de muestras: Instrucciones generales y específicas a seguir para lograr una buena toma de muestras.       

La toma de muestras debe realizarse antes de iniciar el tratamiento con antimicrobianos, ya que este interfiere en la observación directa del germen, así como en posterior aislamiento del mismo en los medios de cultivo. La toma de muestras debe realizarse en los lugares donde sea más probable es encontrar el microorganismo con la menor contaminación externa posible. Recoger la muestra en el estadio de la enfermedad más apropiado. Las muestras deben recoger es cantidades suficientes para permitir un examen completo; deben colocarse en recipientes estériles y remitirse lo más pronto posible el laboratorio. Es un requisito indispensable que el laboratorio recibe la suficiente o técnicas adecuas. El personal debe rechazar las muestras que no se han recogido de forma adecuada y los especialistas deben apoyar esta actitud. Recordando: La toma de muestras debe realizarse antes de iniciar el tratamiento antimicrobiano. Es muy importante seguir las normas necesarias para evitar la contaminación externa. La cantidad debe ser suficiente y es fundamental que se utilice un recipiente.

Clasificación de la toma de muestras: Se clasifican en: MUESTRAS SUPERFICIALES MUESTRAS DE CAVIDADES MUESTRAS ESPECIALES. 4. MUESTRAS ESPECÍFICAS 1. 2. 3.

1) MUESTRA SUPERFICIALES: SUPERFICIALES: Aquí Aquí consignamos a las muestras de la piel, pelo, uñas. ℘ PIEL: Tenemos dos posibilidades de obtener la muestra, ya sea procediendo a alzar a los gérmenes con el asa bacteriología, por simple raspado ligero o con la ayuda de bisturí proceder a raspar algo energéticamente los bordes de la lesión, de manera no solo obtendremos los microorganismos sino también las capas superficiales de la piel, esto es provechoso en el caso de ciertas determinaciones. Finalmente puede ser que en determinados casos se pretenden nódulos los cuales están por debajo de la piel, siendo más palpable que visibles; en este caso procedemos también a raspar con el bisturí el lugar de la lesión llegando hasta el nódulo de manera que una vez obtenida la pulpa, esta puede ser procesada y así llegar a observar al microbio. ℘ PELO: También hay dos posibilidades, la primera cuando los gérmenes se hallan localizados en el folículo piloso, en este caso será suficiente proceder a raspar la región con el asa bacteríol6gíca previo de la zona con agua destilada, también se podrá arrancar el pelo a fin de aislar al germen a partir del folículo piloso.

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La segunda posibilidad posibilidad se vera cuando el tallo del pelo este atacado (micosis) (micosis) en esta situación situación procederá acortar el pelo para su observación o posterior procesamiento en cultivo. ℘ UÑAS: Se utilizan dos técnicas, de acuerdo al sitio atacado. La primera se utiliza cuando la lesión asienta en el lecho ungueal, en esta técnica desplazamos el asa bacteriológica, previo lavado de la región con agua destilada por el lecho ungueal con un solo trazo firme y seguro. Si la uña se halla atacada por microorganismos (hongos) entonces procedemos a cortar ayudados de un bisturí a fin de continuar luego con el cultivo y el diagnostico a través de la microscopia.

1) MUESTRA DE CAVIDADES: Consignamos las muestras de mucosas, conducto auditivo externo, esputo, orina, heces fecales.

℘ MUCOSAS.- El instrumento que sirve de como denominador en la obtención de estas muestras es el hisopo, es decir un aplicada de madera que posee es uno de sus extremos un engrosamiento de algodón y que obviamente debe ser esterilizado. Si vamos describiendo las mucosas de arriba hacia abajo, encontramos lo siguiente: ℘ MUCOSAS CONJUNTIVAL.CONJUNTIVAL.- Usamos Usamos un hiposo hiposo estéri estérill aunque aunque alguna algunass escuel escuelas as prefie prefieren ren utiliz utilizar ar el asa bacteriológica, luego ubicamos la conjuntiva infectada o aquella que presente mayor exudado si la muestra a nivel del ángulo interno del ojo afectado. El hisopado debe s er cuidadoso y suave para rió producir mayor traumatismo. ℘ MUCOSA NASAL.- De igual forma utilizamos un hisopo si la lesión es visible a simple vista procedemos entonces a obtener la muestra, si la lesión es mucho más interna. Entonces será necesario que un especialista la obtenga con instrumental que nosotros ya no poseemos. Hay otras oportunidades en que es preciso utilizar un cincel delgado y largo que podemos fabricar a partir de un sujetador de papel (clip) el cual es convertido en alambre rectilíneo y posteriormente aplastando uno de los extremos obtendremos un pequeño cincel, con el cual y una vez esterilizado procedemos a raspar lesiones sospechosas. ℘ MUCOSA ORAL.- En esta cavidad es sencillo tomar cualquier nuestra pues tenemos gran visibilidad Allí podemos observar donde se localizan una lesión y posteriormente utilizando el hisopo llevar a cabo la toma de muestra. Por  otra parte para fines de investigación podemos escoger cualquier segmento de la mucosa oral puesto, que esta posee una flora variada de microorganismos. ℘ MUCOSA GENITAL FEMENINA.- Aun debemos considerar dos posibilidades más y son aquellas que se presentan en el caso de una mujer con himen intacto y otra que haya tenido contacto sexual. En la mujer con himen intacto tan solo debemos esperar que las secreciones se viabilicen al exterior para así ser obtenidas. En la mujer desflorada utilizaremos el especulo es decir dos valvas que una vez introducidas en el canal vaginal pueden ser separadas a voluntad, brindándonos de esta forma un campo de acción y observación ideales luego procederemos a hisopar las regiones escogidas, haciendo hincapié en las vecindades del orificio cervical externo, pues allí se acumularan las secreciones.

3) MUESTRAS ESPECIALES. ℘ ESPUTO.- El esputo es la colección de secreciones patológicas provenientes del árbol traqueo-bronquial. La muestra podemos obtenerla a través de diferentes técnicas, entre las cuales citaremos las más importantes: es la técnica técnica más más utilizada, utilizada, se aplica aplica a pacientes pacientes que pueden pueden Forma natural de eliminación del esputo: Esta es entender y aplicar las instrucciones que se les dé.  Entregamos al paciente un recipiente especial para esta muestra y le indicamos que al despertara proceda a realizar  un enjuague bucal con un antiséptico, luego debe proceder a expectorar directamente dentro de recipiente, llegando a acumular por lo menos tres esputos (flemas).  Posteriormente se sierra herméticamente el envase y deberá ser enviado a laboratorio debidamente rotulado (nombre completo, edad y sexo) además de la numeración correspondiente y fecha. Lavado gástrico: Esta técnica se práctica en pacientes que no van ha poder realizar lo anterior, los niños (por que degluten el esputo), ancianos, enfermos mentales finalmente mujeres (por que también degluten el esputo. Lavado traqueal: Esta técnica consiste en instalar suero fisiológico tibia hacia el árbol traqueo- bronquial de manera que provoquemos el acceso de tos al despertar o excitar ese reflejo, en esa circunstancia debemos estar bien protegidos con barbijo, gorro, mandil y guantes. Forma postural: Este método también es útil en pacientes que no pueden eliminar en forma espontánea la muestra.  Procedemos a colocar al paciente en decúbito ventral sobre una camilla (o cualquier superficial que cumpla la misma función) con una almohada debajo de ala región abdominal finalmente la cabeza queda colgado en una de los extremos la camilla al igual que los brazos lateralmente: de esta forma por simple acción de la gravedad la secreciones se viabilizaran al exterior, directamente al recipiente ℘ RECOGIDA DE ORINA. - La toma de muestras se realizará en un frasco estéril que no deberá abrirse antes de la recogida. La recogida de orina puede realizarse de tres formas: Recogida de la porción media de la micción: Es aconsejable que la orina recogida sea de la primera hora de la mañana. El paciente debe lavarse meticulosamente los genitales externos con agua y jabón enjugándose finalmente con agua limpia. Iniciará la micción despreciándose la primera parte. A continuación, y sin detener la micción, debe

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recogerse la segunda mitad de la misma en un frasco estéril de unos 20, 35 m1 evitando tocara el interior o borde de 1 frasco. Sondaje vesical o punción de sonda: El sondaje vesical debe utilizárselo menos posible ya que con lleva el riesgo de provocar una infección por introducir microorganismos del exterior. Se efectuara en condiciones de rigurosa asepsia y por personal cualificado. El enfermo portadores de sonda permanente debe recogerse la muestra a trabes de la sonda y nunca directamente de la bolsa. Punción suprapúvica: Esta técnica permite extraer la orina directamente de la vejiga mediante una jeringa con aguja asegurando una muestra libre de contaminaciones. Este método puede realizarse con muy poco riesgo en lactantes, niños y adultos con vejiga llena.  Dado que la orina es un excelente medio de cultivo para la mayor parte de las bacterias, la muestra debe refrigerarse inmediatamente después de la extracción. A 40º C el recuadro de bacterias permanece constante durante 24 horas. Técnica de recolección en 24 horas: Se usa cuando la patología esta situada en los riñones. Consiste en recolectar  durante 24 horas toda la orina eliminada de manera que aumentemos las posibilidades de coleccionar el agente etiológico. Características del recipiente para recolectar orina. a. La capacidad mínima es de 250 cc. b. Debe poseer boca ancha. c. Debe poseer sistema de rosca y tapa tapa que asegure con este sistema. d. Debe ser estéril. e. Debe ser construido de material susceptible de esterilización. f. De preferencia será transparente a fin de observar ciertas características macroscópicas. macroscópicas. g. Tiene Tiene que consignar el nombre, edad, sexo del paciente, paciente, además de la fecha y el correspondien correspondiente te número de registro. ℘ HECES FECALES.- Tenemos dos posibilidades: heces diarreicas y heces sólidas. Heces diarreicas: En este caso obtenemos un volumen similar al de una cuchara sopera lo que más o menos viene a ser una cantidad de 10 cc. Estas muestras deben procesarse dentro de un margen de tiempo prudencial pues al acidificarse muchos gérmenes patógenos se lisan. Heces sólidas: Se toma un volumen similar al de una semilla de durazno.

Características del recipiente para recolectar heces fecales. a. La capacidad mínima es de 30 ml b. Debe poseer sistema de rosca y tapa que asegure con este sistema, o en su defecto un tapón que asegure herméticamente. c. En lo posible debe ser estéril, estéril, aunque se puede utilizar un envase bien lavado. d. Podrá ser construido de material susceptible de esterilización, (polipropileno, policarbonato, vidrio) e. No debe ser fabricado de cartón pues deshidrata la muestra. En último caso se podrá utilizar recipientes de cartón parafinado. f. Tiene que consignar el nombre, edad, sexo del paciente, además de la fecha y el correspondiente número de registro. 4) MUESTRAS ESPECÍFICAS

℘ EXTRACCIÓN DE SANGRE PARA CULTIVOS: La técnica de extracción consta de una serie de pasos que deben rigurosamente, con objeto de reducir al máximo el riesgo de contaminación. Colocar una ligadura en el antebrazo. Escoger la vena tocando la piel antes de la desinfección. Limpiar la piel con alcohol (70%) sobre el sitio de la venopuntura en un área se unos 5 cm. frotando vigorosamente. Aplicar yodo-povi dona (2 %) desde el centro hacia afuera, hasta haber saturado todo el círculo. Se dejara que el yodo se seque, durante un minuto como mínimo, Este tiempo es fundamental y se debe cronometrar. Si después de desinfectada, el flebotomista flebotomista debe tocar la piel, deberá desinfectarse desinfectarse los dedos que va a usar para la palpación o bien utilizar guantes estériles. Se insertara la aguja en la vena a y se realizara la extracción. Se cambiaran las agujas antes de inyectar la sangre en las botellas de cultivo. Después e retirar la aguja, la piel del paciente se desinfectara otra ves con alcohol al 70%, ya que muchos enfermos son sensibles al yodo. Una vez inoculadas, las botellas de hemocultivos deben remitirse inmediatamente al laboratorio para iniciar lo más pronto posible su procesamiento.

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No es aconsejable extraer sangre a través de una derivación 0 catéter, ya que estos dispositivos pueden estará colonizados por bacterias que no están presentes en la sangre el paciente por lo tanto, estos hemocultivos podrían dar resultados falsos positivos. También se aconseja realizar la toma por debajo de las tubuladuras intravenosas ya que la sangre tomada por  encima e ella estará diluida por el l íquido transfundido. Se recomienda 3 muestras en 24 h con un intervalo entre ellas superior a 1 h. Sin embargo se acepta 2 o 3 extracciones separadas 30 min. Cada 24h, para cada hemocultivo, se extraerán lO ml de sangre y se inoculará a partes iguales en dos frascos (5ml en cada uno) uno para aislamiento de gérmenes aerobios y otro para anaerobios. ℘ LÍQUIDO CEFALORRAQUÍDEO CEFALORRAQUÍDEO:: Esta muestra se obtiene a partir de una punción lumbar que se practica entre el 3er. Y 4to. Espacio intervertebral lumbar.  Esta es una técnica práctica operatoria y se la debe realizar con todos los cuidados necesarios teniendo en cuenta las contraindicaciones. necesaria es de 3 - 5ml. y siempre se debe realizar realizar un estudio estudio microscópico microscópico antes de entrar al estudio La cantidad necesaria microbiológico. La presión más importante es de procesar el liquido cefalorraquídeo dentro de un margen de tiempo mínimo desde la toma de muestra, pues muchos gérmenes se lisan transcurrido cierto tiempo; dándonos de esta manera un resultado negativo. ℘ MUESTRA CAPILAR: técnicas. Realizar la antisepsia del lugar elegido (lóbulo de la oreja, pulpejo del dedo anular, planta del pie en lactantes. Funcionar con rapidez y firmeza de tal manera que ingrese toda la punta de la lanceta. Descartar la primera gota. Recoger la sangre que fluye libremente llenando las tres cuartas partes del capilar. Presionar suavemente el lugar de punción con un algodón empapado en alcohol. La punción cutánea o capilar se emplea para: ∼ Frotis ∼ Micro hematocrito ∼ Grupo sanguíneo ∼ Recuento de lóbulos blancos ∼Y otros.12 ANTIBIÓTICO Sustancia Sustancia quími química ca producida producida por por ciertos ciertos microorgani microorganismos, smos, que mata mata o inhibe inhibe el crecimi crecimiento ento de otro. otro. Inhibe Inhibe el crecim crecimien iento to o matan matan a otros otros microorg microorgani anismo smoss .Los .Los antibi antibióti óticos cos consti constituy tuyen en una clase clase especial especial de agente agentess quimioterapeuticos , que se distinguen de los análogos de factores de crecimiento crecimiento por que son productos naturales (productos de la actividad microbiana microbiana ) ,son sustancias producidas en los procesos microbianos a gran escala . ANTIBIOGRAMA El medio de cultivo es sólido. Este sistema permite probar la eficacia de varios antibióticos al mismo tiempo.; Sobre la superficie de una placa de agar se realiza la siembra de una suspensión bacteriana calibrada y a continuación se depositan sobre ella discos de papel de filtro impregnados de antimicrobianos (discos para antibi antibiogr ograma ama dispon disponibl ibles es en el comerci comercio). o). Tan pronto pronto como como el disco disco toma toma contacto con la superficie húmeda del agar, el agua es absorbida por el papel de filt filtro ro y el anti antibi biót ótic ico o difu difund nde e haci hacia a el medi medio o circ circun unda dant nte e crea creand ndo o así así concentraciones progresivamente decrecientes. Se observa como a medida que la distancia al disco aumenta hay una reducción logarítmica de la concentración del antibiótico. Así, al cabo de 18 horas de incubación, en aquella zona donde el antibiótico es capaz de impedir el crecimiento de la bacteria aparece un halo alrededor del disco: halo de inhibición. El tamaño de la zona de inhibición inhibición depende de ciertas ciertas propiedades propiedades fisicoquímic fisicoquímicas as del antibiótico antibiótico que influyen influyen invitro sobre la velocidad de difusión en agar y no están necesariamente relacionadas con la actividad terapéutica (in vivo) del antibiótico.; La valoración de los halos se hacen por patrones obtenidos de forma que se hallan correlacionadas la CIM y la carga antimicrobiana del disco con el diámetro del halo. Para ello es necesario determinar previamente en forma individual la CIM y el halo de inhibición de un número amplio de cepas. Los resultados se representan en un sistema de coordenadas que nos permite establecer una correspondencia para un antibiótico determinado. De esta forma midiendo el diámetro del halo de inhibición de una cepa por el método del disco-placa, disco-placa, trasladamos este valor a la escala anterior  12

www.bvsops.org.uy/p www.bvsops.org.uy/pdf/laboratorio.pdf  df/laboratorio.pdf 

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y podemos conocer su CIM. Pese a las limitaciones limitaciones,, esta técnica técnica representa un avance ya que provee de resultados resultados estandarizados comparables entre los distintos laboratorios. 13 RESISTENCIA Es la capacidad adquirida por un organismo organismo para resistir los efectos de un antibiótico antibiótico ante el cual es normalmente normalmente susceptible ,esta ,esta resistencia se adquiere probablemente de los productores antibióticos antibióticos ,a través de un proceso de intercambio genético .Con el fin de protegerse a si mismo de los antibióticos que ellos producen , estos organismos han desarrollado desarrollado mecanismos mecanismos para para neutralizar o destruir destruir sus propios antibióticos . La existencia de estos genes significa significa que, bajo las condiciones adecuadas, adecuadas, es posible transferir transferir esta resistencia a otros organismos .Los mecanismos mecanismos de resistencia a los antibióticos antibióticos son por: 1) El organismo puede puede carecer de la estructura diana sobre la que actúa un antibiótico. 2) El organismo puede ser impermeable al antibiótico. 3) El El organismo organismo puede ser capaz de alterar en antibiótico antibiótico pasándolo a una forma inactiva. 4) El organismo puede puede modificar la diana de un antibiótico. antibiótico. 5) Por inter intercam cambio bio genét genético ico,, puede puede tener tener lugar lugar la altera alteració ción n de una vía vía metaból metabólica ica que bloqu bloque e al agente agente antimicrobiano. 6) El organismo puede ser capaz de bombear bombear hacia fuera el antibiótico antibiótico que va entrando en la célula (eflujo). (eflujo). La resistencia a los antibióticos puede estar codificada genéticamente por el microorganismo, microorganismo, bien en el cromosoma o en los plasmados, los llamados plasmados de resistencia, los diferentes tipos específicos de resistencia tiene su base genética en uno o en otros. SENSIBILIDAD Es la Administración Administración de un antígeno para inducir una respuesta inmunitaria exposición a un alergeno que da lugar a una reacción exagerada La bacterias Gram. Gram. + son generalmente mas sensibles a los antibióticos antibióticos que las bacterias Gram. Se puede medir fácilmente la sensibilidad de un cultivo por un método de difusión difusión en agar o utilizando utilizando una técnica técnica de dilución en tubo para determinar determinar la concentración inhibitoria mínima mínima (CIM ) de un agente que inhiba el crecimiento. El método de la CIM para el análisis análisis de sensibilidad sensibilidad a los antibióticos antibióticos conlleva un ensayo de dilución del antibiótico ya ya se en tubos de cultivo o bien en pocillos de una placa de micro titulación titulación .La prueba CIM ( método de Kirby-Bauer ). ).14 TABLAS DE IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS

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http://www.biologia.edu.ar/microgeneral/tp8.pdf  http://es.mimi.hu/medicina/antigeno.html

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MATERIAL  1 espátula 1 agitador de vidrio  30

tubos de ensaye chicos con tapa de rosca 7 matraz erlenmeyer 1L  Papel craft  Gradilla 1 pipeta 5ml 60 cajas petri estériles  Mechero  5 asas 5 portaobjetos 1 probeta 250ml 1 vaso de pp. de 250ml  Algodón Gasa  Papel filtro  Torundas con alcohol REACTIVOS Medio

Mac Conkey Basal O/F O/F (De Hugh y Leifson) Leifson) Agar Sal y manitol Base de Agar Sangre Base de Caldo Rojo Fenol Agar Mueller Hinton (Tiosulfato Sales Biliares Biliares Sacarosa) Agar TCBS (Tiosulfato Medio Stuart Vancomicina (en discos) Furacilidona (en discos) Peróxido de hidrógeno al 30% Manitol Reactivo de kovacs (oxidasa) Aceite mineral Cristal violeta Lugol Alcohol-acetona Safranina Alcohol Medio

MATERIAL BIOLÓGICO Microorganismos

desconocidos a identificar 

EQUIPO  Incubadora  Autoclave Refrigerador  Parrilla eléctrica Balanza semi-analítica  Microscopio

PROCEDIMIENTO Primera sesión 1. Se procede procede a preparar preparar los medios que que se van a utilizar utilizar para la identifica identificación ción de posibles posibles microorga microorganismos nismos.. Como son:

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MacConkey  Preparación: Suspender 50 gramos del medio en un litro de agua destilada o desionizada de buena calidad. Remojar bien entre 10 a 15 minutos y calentar a ebullición agitando continuamente. Hervir durante un minuto. Esterilizar en autoclave a 121ºC durante 15 minutos. Enfriar a 45-50 ºC y vaciar en cajas de Petri unos 20 ml por placa. Dejar solidificar y luego invertir  las cajas para evitar que se deposite un exceso de humedad en la superficie del medio. O/F (De Hugh y Leifson) Preparación: Suspender 9.8g del polvo en un litro de agua destilada. Remojar de 10 a 15 minutos. Calentar agitando con frecuencia hasta disolución del material. Esterilizar en autoclave a 15 libras durante 15 minutos. Agregar 10 ml de solución de glucosa al 10% esterilizada por filtración por cada 100 ml del medio fluido. Mezclar y distribuir asépticamente a razón de 5 ml por tubo. Si prefiere, puede agregarse directamente 1.0 g del carbohidratos a cada 100 ml del medio 1.0g del carbohidratos a cada 100 ml del medio y esterilizar en autoclave a 118ºC durante 10 minutos, a fin de evitar la degradación del azúcar. El medio tiene un color verde. Sal y manitol Preparación: Suspender 111g. del medio deshidratado en un litro de agua destilada y remojar unos 15 minutos. Mezclar bien y calentar a ebullición durante un minuto. Esterilizar en autoclave a 121ºC durante 15 minutos. Vaciar en cajas de petri. Base de Agar Sangre Preparación: Suspender 40 g del medio deshidratado en un litro litro de agua destilada. Remojar entre 5 y 10 minutos. Hervir durante durante un minuto. Los matraces pueden taparse y colocarse directamente en autoclave. Esterilizar a 121ºC durante 15 minutos. Después de esto enfriar a 4 –50ºC y añadir de 5 a 10% de sangre desfibrinada estéril, homogenizar y vaciar en cajas de petri estériles. No es recomendable emplear sangre humana. De preferencia utilice sangre de cordero o de conejo. También es posible inocular el fondo de una caja petri estéril con un pequeño inóculo, y vaciar posteriormente el medio fundido a unos 50ºC; la caja s e hace girar suavemente para homogenizar la muestra. En algunos laboratorios se emplea el medio de cultivo preparado en tubos con tapón de rosca que se pueden inocular y posteriormente vaciar en cajas de petri estériles Base de Caldo Rojo Fenol Preparación: Disolver 15 g del medio deshidratado en un litro de agua destilada, agregar si se desea de 5 a 10 g de carbohidratos. Se puede agregar de 0.5 a 1.0 g de agar si el medio va a ser destinada al cultivo de organismos anaerobios. Si se desea investigar investigar la formación formación de gases, emplear emplear tubos Durham. Colocar los tubos en un recipiente recipiente adecuado y esterilizar de 116 a 118ºC durante 15 minutos. Agar Mueller Hinton Preparación: Suspender 38 g del medio deshidratado en un litro de agua destilada. Remojar de 10 a 15 minutos. Mezclar bien agitando frecuentemente. Hervir durante un minuto, y esterilizar a 121ºC por un tiempo no mayor de 15 minutos. Enfriar a 40-45ºC y vaciar en cajas de petri. Si se desea, pueden prepararse placas o tubos de agar “chocolote”, previa adicción de sangre de carnero o humana, preferiblemente la primera, calentando en baño maria a 80ºC 10 minutos. No sobrecalentar el medio en ningún momento. Agar TCBS

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Preparación Suspender 86 g del polvo en un litro de agua destilada. Remojar de 10 a 15 minutos. Calentar agitando con frecuencia y hervir durante un minuto. Enfriar entre 45-50ºC y vaciar en cajas de petri. No esterilizar en autoclave. Segunda sesión 2. Toma oma de mues muestr tra: a: La toma de muestras que se hicieron para esta práctica fueron: exudados faringeos y nasofaringeos Faringeos:

Toma: Se pide al paciente que se siente y coloque su cabeza hacia atrás. Se ilumina bien la cavidad orofaríngea y con un abatelenguas se empuja la lengua hacia abajo para facilitar el acceso a la parte posterior de la faringe. Con un hisopo de algodón se hace un raspado de las áreas hiperémicas, purulentas o necróticas, así como de las membranas o manchas de Koplic, si es que las presenta. Nasofaringeos:

Toma: Se pide al paciente que se siente y coloque su cabeza hacia atrás. Se introduce un hisopo de alginato de calcio, dacrón o nylon (nunca de algodón en caso de sospechar Bordetella) por las fosas nasales hasta la nasofaringe, sin tocar  los cornetes y tratando de producir un acceso de tos. El hisopo se mantiene in situ de 10-15 segundos durante el acceso de tos, después de lo cual se retira rápidamente. Cutáneo

Toma: Con un hisopo de algodón se toma una porción del exudado, evitando que sea muy superficial. Inmediatamente se siembra en medios de cultivo adecuados (agar sangre, agar chocolate, PAI, etc) o se inocula en el medio de transporte de Stuart. 15 3. Una vez obteni obtenidas das las muestr muestras as se procede procede a la inoculación inoculación en en medios, medios, por estria estria cruzada. cruzada. 4. Incuba Incubació ción n de las las placas placas a 35ºC, 35ºC, dura durante nte 24 24 a 48 hrs. hrs. Tercera sesión: 5.

Observación Observación de las característ características icas macrosc macroscópicas ópicas en cada medio sembrado sembrado 6. Realización de frotis al Gram de 2 colonias. Observación a inmersión 7. Siembra Siembra de la la colonia colonia pura con con afinidad afinidad a posible posible estafi estafilococo lococo en caldo caldo rojo de de fenol 8. Siembra Siembra de esta misma misma colonia de forma forma masiva en agar agar sangre para realizar realizar prueba prueba de sensibilidad sensibilidad-resist -resistencia encia con antibióticos como son: Furazilidona y Penicilina (antibiograma) 9. Incuba Incubació ción n de estas estas ultima ultimass a 35ºC dura durante nte 24 24 horas. horas. Cuarta sesión 10. Observación de las características macroscópicas en el caldo manitol rojo de fenol y en la prueba de sensibilidad. 11. 11. Medir el halo de inhibición se presentó) con un regla y determinar posible tratamiento. 12. Realización de frotis de Gram del cultivo obtenido. Observación a inmersión. 13. Realización y lectura de la prueba de coagulasa, oxidasa y catalasa. 14. entificación de microorganismo a partir de los resultados obtenidos.

RESULTADOS MICROORGANISMO, PRUEBAS  Y MEDIOS DE CULTIVO

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CARACTERÍSTICAS

IMAGEN

http://www.salud.gob.mx/indre/mues.htm#M3.%20EXUDADO%20FARINGEO

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Colonias

transparentes (en S y M) Colonias amarillas y blancas, Circulares, poco crecimiento, Planos, hemólisis γ  (En GS)

BACTERIA PROBLEMA 1 Procedencia: Desconocido Sembrado en Sal y Manitol (con vire a rojo) Resiembra en Gelosa Sangre

Staphylococcus GRAMPOSITIVO

CATALASA OXIDASA -

Colonias blancas Hemólisis

BACTERIA PROBLEMA 2 Procedencia: Desconocido Sembrado en Gelosa Sangre Resembrado en GS

Staphylococcus GRAMPOSITIVO

CATALASA + OXIDASA COAGULASA + (Por lo tanto, altamente patógeno)

Resembrado en GS con antibiograma

Halo = 1cm Inhibición a Penicilina Resistencia a Furacilidona Hemólisis β Colonias blancas, redondas y lisas

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Rojo Fenol

Medio basal O/F

Positivo: fermentación de glucosa (Vire a pálido)

Con sello: negativo Sin sello: positivo sello: positivo Vire Azul (por lo tanto microorganismo aerobio)

BACTERIA PROBLEMA 3 Procedencia: Piel de la parte posterior  de la oreja Sembrado en Sal y manitol Y gelosa sangre

BACTERIA PROBLEMA 4 Procedencia: Exudado Faríngeo Siembra en GS

BACTERIA 5 S. Aureus

Colonias blancas, circulares, pequeñas (S y M) M) Colonias blancas, circulares, Pequeñas con elevación Concava y ligera hemólisis α (GS)

Flora normal Hemólisis α Crecimiento abundante Colonias circulares, cóncavas, Blanquecinas y puntillosa

Staphylococcus Gram + Rojo Fenol + Colonias circulares, pequeñas, De borde continuo y cremosas. Coagulasa + Anaerobio facultativo Fermentador de glucosa Catalasa + Oxidasa -

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DISCUSIÓN DE RESULTADOS Identificación:

Bacteria problema 1 Hubo hemólisis gama por que no presento halo, fue un crecimiento abundante de color blanquecino cremoso, fue oxidasa negativo por que no hubo presencia del sistema citocromo oxidasa que activa la oxidación del citocromo que es reducido por el oxigeno molecular que produce agua y dióxido de carbono, en la prueba de catalasa fue negativo, por  que no posee esta enzima que descompone al H 2O2 en oxigeno molecular y agua por lo que no hubo burbujeo. Se realizo una prueba de sensibilidad en la que con PE fue sensible con halo de inhibición de 1 cm. lo cual indica que se puede tratar con Penicilina y fue resistente en A indicándonos que el tratamiento con Furazilidona no es recomendable. No se determinaron mas pruebas ya que se encontraron Staphylococcus y Streptococcus GRAM positivo en la tinción por lo que las pruebas nos dieron catalasa negativo y oxidasa negativo. Nota: PE: Penicilina A: Furazilidona

Bacteria problema 2 En el cultivo de procedencia hubo hemólisis beta y colonias blancas cremosas. Se determino que era Staphylococcus GRAM positivo coagulasa positivo por lo que es altamente patógenopor que forma el coagulo visible como consecuencia de la utilización de los factores de coagulación del plasma de manera similar a cuando se añade ttrombina, en rojo fenol fue positiva, ya que fermento ligeramente la glucosa del medio, en O/F se observo que con sello fue neutro y sin sello fue acido, por lo que su metabolismo es oxidativo y también nos indica que la especie es aerobia o anaerobia facultativa. La prueba de catalasa fue positiva ya que si posee la enzima que descompone al H 2O2 en oxigeno molecular y agua por  lo que presento burbujeo y oxidasa negativa. De acuerdo a las pruebas realizadas se puede determinar que cumple con las características propias de Staphylococcus ya que la prueba de coagulasa es positiva y eso es característico de S. aureus, S. areus subespecie anaerobius y S. simulans pero ya que nos dio hemólisis beta podemos afirmar que es S. aureus. aureus. Bacteria problema 3 Exudado de piel (parte posterior de la oreja) No se le realizaron todas la pruebas necesarias para la identificación, sin embargo por el tipo de muestra y las características culturales se puede decir que es Staphylococcus de la flora normal que se encuentra en la piel la especie epidermidis. epidermidis. Bacteria problema 4 Exudado faringeo En esta ocasión no se pudieron realizar todas las pruebas necesarias para la identificación, sin embargo por el tipo de muestra y las características culturales se puede decir que es Staphylococcus de la flora normal que se encuentra en este tipo de cavidades. Bacteria 5 Fue una bacteria ya identificada como S. aureus a la que se le hicieron las pruebas para la comparación con nuestras muestras problema. CONCLUSIONES Se identificaron diferentes tipos de estafilococos en las diferentes muestras tomadas comparándolas con una muestra ya identificada como S. aureus lo cual nos ayudo un poco a la identificación de este en las otras muestras de exudados. Es importante importante siempre siempre tomar en cuenta el origen de la muestra ya que de esta se parte para la identificació identificación n y reconocimiento de este tipo de bacteria que forma parte de nuestra flora normal, pero causa daño (patogenicidad) en situaciones extremas como puede ser en heridas con falta de asepsia, higiene de la persona, si se encuentre la persona con su sistema deprimido, etc. Pudiendo producir: Impetigo, Forúnculo, Celulitis, Ántrax estafilocócico, Pénfigo del recién nacido, en otros aparatos y sistemas puede producir: sinusitis, otitis, faringitis, neumonitis y abscesos pulmonares o pleurales. Los estafilococos Gram positivos, crecen aislados, en parejas, en tétradas o en masas irregularmente agrupadas como racimos de uvas. La especie mas importante, Staphylococcus aureus, generalmente crece dando color amarillo a la naranja, aunque en ocasiones puede ser blanco. En Agar sangre, las colonias son redondas, de 1-3 mm de diámetro, convexas, de color blanco o ligeramente amarillento; generalmente las de tinte ligeramente amarillento se encuentran rodeadas de una zona de hemólisis que corresponde a Staphylococcus aureus. aureus. Necesita una fuente nitrogenada

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orgánica y en sus necesidades de oxígeno es facultativo. Muchas de las cepas beta-hemolíticas coagulosa – positivas son patógenas y algunas producen una enterotoxina que causa intoxicaciones. En esta practica estuvimos estudiando un caso desconocido, donde se le determino todo tipo de pruebas, para poder  identificar que tipo de microorganismo es lo que tiene, que al final se concluyo que era posible S. aureus por la prueba de coagulasa positiva que esto indica su alta patogenicidad. Sin embrago fue sensible a la Penicilina con halo de inhibición de 1 cm lo cual nos indica que este paciente puede ser tratado con penicilina. A diferencia de otros microorganismos esta se identifica por una gran gama de variantes que la caracterizan como son: su cápsul cápsula a y capa capa de polisa polisacár cárido ido extrac extracelu elular lar,, peptid peptidogl ogluca ucano, no, ácidos ácidos teicoi teicoicos cos,, su proteí proteína na A, las toxina toxinass estafilocócicas, enzimas estafilocócicas. Algo también muy importante es la identificación de la etapa en que se encuentra de su desarrollo, ya que aquí es donde se determina en que fase s e encuentra mas altamente patógena, o viceversa, cuando ya esta muerta o cuando a penas empieza a reconocer el medio o habitad en donde se encuentra y si los nutrientes que existen son los necesario y/o suficientes para poder crear algún nicho infeccioso. Esto nos ayuda a conocer mas sobre su metabolismo y la manera de atacarlo para su aplicación clinica posterior al paciente que presenta dicha enfermedad a causa de este.

REFERENCIAS

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