PRACTICA Nº 06 REVELACIÓN DE LOS ENZIMAS, QUE SE RELACIONAN A DIFERENTES CLASES Todos los enzimas, en dependencia del tipo de reacc iones químic as cataliza das se dividen en seis clases : oxidor educt asas, Transferas as, Hidrala sas, Liasas, Isomerasas, Ligase s (sintetasas). Al interior de cada clase los enzimas se subdividen en subclases y sub-subclases, que especifican la naturaleza de la reacción enzimtica. !ara la identificación de los enzimas de cada clase en el material bioló"ico se tienen sus particularidades, por eso es necesario determinar las condiciones del curso de la reacción enzimtica. #as reacciones cualitativas en los enzimas los utilizan en la prctica $i"i%nica en la disposición de las muestras sobre la presencia de enzimas en los productos alimenticios (lec$e, papa, etc.) &n el fraccionamiento de los enzimas por el m%todo de electroforesis su identificación tambi%n la realizan con la ayuda de reacciones cualitativas.
1. DETERMINACIÓN DE ÓXIDO-REDACTASES EN MATERIAL BIOLÓGICO &n las reacciones, catalizadas por las ó'idoreductasas, el substrato que se o'ida se considera como donador de $idró"eno o electrones, y aceptor pueden ser sustancias naturales (coenzimas A*, A*!, +, +A*, o, o'í"eno, compuestos or"nicos, citocromos, etc.) y 'enobióticos. !ara la mayoría de los enzimas de esta clase se recomiendan las denominacion es: deshidrogenasas y reductasas. &n aquellos casos, cua ndo el aceptor es el o'í"eno se emplea el t%rmino oxidasa, y si el o'í"eno, en el curso de la reacción, se incluye en la composición del substrato, el enzima se le denomina oxigenasa. Peroxidasa es el enzima que utiliz a / 010 en calidad de aceptor, y catalasa — el enzima que cataliza las reacciones, donde el p ar d onador-aceptor lo con stituyen dos mol%culas de / 0 10.
In st ru me nta l, rea ct ! "s . 2radillas con tubos de ensayo3 ba4o de a"ua3 termómetro3 pipetas de 5 y 6 m#3 formalde$ído, solución al 1,783 de metileno, al 1,158. Materal. 5. 9u"o de papa (papaazul fresca se ralla ensolución el rallador y la e'primen a trav%s de dos capas de "asa). 0. #ec$e fresca de vaca
a. Revelaci! "e al"e#$"%&i"a'a (al"e#$"%) %&$*e!%+%&i"%e"-ca'a/ EC .1.2.3 e! la lec#e. &l m%todo se basado en la observación visual de la decoloración del azul de metileno (A), que li"a el $idró"eno, que se desprende del sustrato por acción de alde$ído'idasa. &l enzima alde$ído'idasa cataliza la reacción de des$idro"enación de diferentes alde$ídos, por eemplo, el formalde$ído. &l $idró"eno se transporta a +A*, que es el coenzima del enzima dado, y lue"o sobre el aceptor final o'i"eno por la ecuación:
Al a"re"ar A aceptor artificial de $idró"eno en condiciones de ausencia de o'i"eno se ori"ina su forma reducida (forma leico) A /0.
;i la solución incolora de azul de metileno
se a"ita, entonces nuevamente adquiere
el color azul:
Curs" #e la #etermnac$n. &n dos tubos de ensayo colocan 6 m# de lec$e fresca y le a"re"an al primero 5 m# de a"ua, y al se"undo el mismo volumen de formalde$ído. A ambos tubos de ensayo le a4aden < m# de solución de azul de metileno, el contenido lo mezclan y le a"re"an =-7 "otas de aceite de vaselina (para prote"er a la mezcla líquida del contacto con el o'í"eno del aire). #os tubos los colocan en ba4o de a"ua, calentado $asta =>? . *espu%s de 6-51 min comparan el cambio de coloración en ambas muestras. #ue"o de a"itar fuertemente el tubo de ensayo, nuevamente obse rvar la variación del color.
4. Revelaci! "e la 5e%&i"a'a ("%!a"%) lec#e
1
O1 %&i"%e"-ca'a/ EC ...73 e! la 5a5a 8 e! la
&l fundamento del m%todo se encuentra en la reacción con benzidina, basado en la capacidad del enzima de catalizar la reacción de o'idación de la benzidina a difenoquinoidimina con peró'ido de $idró"eno. &l compuesto difen ilquinoidimina, se condensa con la mol%cula de la benzidina no o'idada con la formación de un compleo de color verde-azulado.
Pe%&i"a'a
Curs" #e la #etermnac$n. &n dos tubos de ensayo a"re"an, en uno 5 m# de lec$e cruda fresca y en el otro u"o de papa. A ambos tubos a4aden 6 "otas de la solución alco$ólica de benzidina y una "ota de peró'ido de $idró"eno. @bservar la coloración característica.
Presentación del trabajo. #os resultados anotarlos en la tabla y establecer la coloración característica del indicador de la reacción.
&n las concl usiones se debe indicar sobre la presencia, en el material bioló"i co, de los enzimas estudiados y el si"nificado prctico del trabao.
c. Revelaci! "e caala'a' e! la 5a5a
I!'-9e!al 8 eaciv%') Tubos de ensayo, probeta de 61 ml, vasos de 511 ml, man"uera, cuc$illo, mec$ero con trípode y reilla, tapón perforado con tubo en n"ulo recto, pipeta !asteur y pero'ido de $idro"eno de 01 vol. Maeial "e a4a:%)0 papas.
P%ce"i9ie!%) &n dos tubos en ensayo colocar 0m# de zumo de papa y en otros dos tubos de ensayo colocar 0 m# de zumo de zana$oria, dos de los tubos uno que contiene zumo de papa y otro que contiene zumo de zana$oria, calentarlos a ba4o maría a 1?, lue"o d%elos entibiar, una vez que est%n tibios verter a los cuatro tubos de ensayo <<< "otas de peró'ido de $idro"eno de 01 vol o una solución diluida 5:=1 y observe. Adems de visualizar la producción de burbuas que indican la "ran actividad de la catalasa se puede colectar el0 @ por desplazamiento de a"ua en una probeta "raduada como indica la +i"ura:
Di'5%'iiv% 5aa c%leca O1 "e'5e!"i"% "el 1O1 5% la caala'a. Re'-la"%') a. @bserve lo que ocurre en cada uno de los tubos y anótelo. 4. ompare ambos resultados y e'plique las diferencias.
". Dee9i!aci! "e la 5e%&i"a'a ("%!a"%) #101+%&i"%e"-ca'a/ ec ...73 e! la 5a5a I!'-9e!al 8 eaciv%') Ballador3 papa fresca3 piro"alol al 58, peró'ido de $idró"eno al 08. Ballan la papa en el rallador. Cna peque4a parte de ella sin e'primirla la colocan en un tubo de ensayo le a"re"an 5-0 ml, de la solución de piro"alol y 5-0 "otas de la solución de peró'ido $idrD"eno. *urante el reposo se forma un precipitado pardo-amarillento de la pErpuro"alina. #a formación de pErpuro"alina se e'presa por el si"uiente esquema:
#a des$idro"en ación reiterada (@'idación) del piro"alol y de una serie de productos intermedios en la vía $acia la formación de purpuro"alina se realiza con la participación de la pero'idasa, que cada vez transfiere al peró'ido de $idró"eno los tomos de $idró"eno separados.
