UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS E.A. P. INGENIERIA AGROINDUSTRIAL ASIGNATURA: BIOQUIMICA SEMESTRE 2014-I PRÁCTICA 4 EVALUACION DE LAS ENZIMAS OXIDO REDUCTASAS
I.
OBJETIVO Evaluar la acción catalítica de las oxido reductasas en diferentes muestras biológicas
II.
INTRODUCCIÓN En el organismo vivo el fenómeno de la oxidoreducción cumple uno de los papeles más importantes proveer energía. Las enzimas que catalizan estas reacciones se denominan oxidoreductasa; un grupo importante son las deshidrogenasas.y las reductasas. El sustrato sustrato que se oxida se considera considera como donador de H o electrones y aceptor pueden ser sustancias naturales (Coenzimas NAD, FAD, etc). En aquellos casos cuando el aceptor es el oxígeno se empleó el termino oxidasa y si el oxígeno en el curso de la reacción, se incluye en la composición del sustrato , el enzima se le denomnia oxigenasa. La peroxidasa cataliza el H2O2 en calidad de aceptor y catalasa, ---el enzima que cataliza las reacciones donde el par donador-aceptor lo constituyen dos moléculas de H2O2.
PRUEBA DE LA LACTOPEROXIDASA La enzima lactoperoxidasa es un componente natural del suero lácteo, se encuentra en la leche en cantidades variables entre 10-40 ug/mL, dependiendo de la especie de mamíferos y el estado fisiológico de la lactación . Las Lactoperoxidasas transfieren oxigeno desde peróxido de hidrogeno (H 2O2) a otras sustancias fácilmente oxidables. Esta enzima es inactivada si la leche es calentada a 80°C por unos pocos segundos, un hecho que puede ser usado para demostrar la presencia o la ausencia de peroxidasa en la leche y así comprobar si realmente una temperatura de pasteurización encima de 80 °C ha sido alcanzada
La peroxidasa es una enzima que cataliza la oxidación de ciertos compuestos dadores de hidrógeno, como fenoles (guayacol, pirogalol) y aminas aromáticas (o-fenilendiamina) por medio medio de de peró peróxid xidos os ( ). El El subst substrat rato o oxida oxidable ble más usado usado es el guayaco guayacol, l, que es oxid oxidado ado a un complejo coloreado de tetraguayacol en presencia de peroxidasa.
La peroxidasa puede ser inactivada por el calor, siendo una de las que precisa mayor temperatura y más tiempo para su inactivación. Se puede regenerar enzimática. Este fenómeno consiste en que al inactivarla por medio del calor recupera parcialmente su actividad después de un cierto tiempo. Esto ha sido explicado, aduciendo que la fracción proteica de la enzima sufre una desnaturalización sólo parcial, con pérdida de su estructura terciaria, si el calor se aplica un tiempo muy corto, produciéndose luego una reversión de la proteína a su estado normal.
PRUEBA DE LA ALDEHÍDO-REDUCTASA. FUNDAMENTO La enzima causante es la xantino-O-aldehído-deshidrogenasa, que cataliza la oxidación de xantina y de diversos aldehídos a ácido úrico y los respectivos ácidos carbónicos; se trata de una flavoproteína con molibdeno. La reacción se basa en que la deshidrogenasa, en presencia de HCHO, descolora al azul de metileno como aceptor de H. Se emplea el azul de metileno para evidenciar la actividad de la deshidrogenasa. Este colorante se recibe los protones y electrones provenientes de El cual pasa de su forma oxidada (azul) a la forma reducida (incoloro)
PRUEBA DE LA CATALASA Fundamento . La catalasa tiene como función la destrucción del H2O2, producto de varias oxidaciones biológicas, para ser convertido en H2O y O2. La deshidrogenasa láctica cataliza una reacción redox, en la que el piruvato es reducido a lactato gracias a la oxidación de NADH a NAD+. La reacción es reversible. El objetivo de esta práctica es observar la reacción de la catalasa y el efecto de algunos inhibidores como cianuro, nitrato de plomo o calentamiento a altas temperaturas, además de observar y conocer la reacción de la deshidrogenasa láctica.
III. PARTE EXPERIMENTAL III.1. MATERIALES Tubos de prueba. 2 pipetas de 1 mL y de 5 mL, bombilla succionadora Gradilla o Matraz aforado,
REACTIVOS
Azul de metileno, formaldehido, agua destilada, guayacol, solución de peróxido de hidrógeno. Hígado de pollo. Papa, leche de establo, leche pasteurizada ,
III.2. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTO 1: PRUEBA DE LA LACTOPEROXIDASA . 1. 2. 3.
Muestra con leche Medir 3 mL de leche, luego agregar 2 mL de guayacol líquido al 1% en mezcla de agua y etanol (1+1) Añadir 3 gotas de agua oxigenada y mezclar. Dejar en reposo 5 minutos Interpretación: Observar color rojizo o salmón en leche cruda o si el color es reducida indica deficiente pasteurización
EXPERIMENTO 2 PRUEBA DE LA PEROXIDASA Muestra. Homogenizado de papa o de rábano 1. En dos tubos de ensayo agregar 2. En el primero 1 ml de homogenizado de papa y en el segundo la muestra de rábano 3. Ambos tubos añadir 5 gotas de solución de guayacol y una gota de peróxido de hidrógeno. Observar las coloraciones características
EXPERIMENTO 3: PRUEBA DE LA ALDEHÍDO-REDUCTASA. 1. 2. 3. 4. 5.
En 2 tubos de ensayo, rotular tubo A y tubo B, ambos colocar 5 ml de leche Al tubo A añadir 1 ml de agua y al tubo B 1 ml de formaldehido A ambos tubos agregar 0.5 ml de Azul de metileno Cubrir con papel parafilm (proteger la mezcla del contacto con el oxígeno del aire) Colocar los tubos en baño de agua a 37 °C. Después de 5 a 10 min comparar el cambio de coloración en ambas muestras. Luego de agitar fuertemente el tubo de ensayo, nuevamente observar la variación de color Esta enzima se encuentra sólo en la leche de vaca.
EXPERIMENTO 4: PRUEBA DE LA CATALASA 1. 2.
Colocar en un tubo de ensayo 0.3 g de homogenizado de hígado de pollo fresco Añada 2 mL de agua oxigenada al tubo. Tome el tiempo inicial al añadir el agua oxigenada y el tiempo cuando empiece a producirse las burbujas.
IV. REPORTE DE RESULTADOS V. CUESTIONARIO 1. 2. 3. 4.
Explique la especificidad de las enzimas Defina que son aceptores y donadores en las reacciones enzimáticas Mencione el pI de seis proteínas de alimentos Realice un tabla estableciendo las propiedades bioquímicas de las enzimas En estudio: catalasa, lactoperoxidasa, aldehído reductasa (Km. Estructura de la enzimas, peso molecular, etc)
VI. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS 1. 2. 3.
Coultate T.P Química y Bioquímica de los alimentos. 3° edición Edit Acribia Zaragoza-España.2000 Cheftel J.C y Cheftel H. Introducción a la bioquímica y tecnología de los alimentos, Vol I, Editorial Acribia, edición 1era, España 2000, p.43 Montgomery R. Bioquimica. Casos y textos, EditorialHarcourt Brace, edición 6ta, Madrid. 2008.
REPORTE DE RESULTADOS
PRÁCTICA 4 EVALUACION DE LAS ENZIMAS OXIDO REDUCTASAS EN MATERIAL BIOLOGICO Apellidos y Nombres:
……………………………………
Fecha: ………………………..
1. Los resultados anótelos en la siguiente tabla Material
2.
Enzima analizada
Sustrato
Dador
Aceptor
Esquematice sus resultados
Experimento 1
Experimento 3
Experimento 2
Experimento 4
productos
Observación de la presencia de la enzima
