Kamis, 24 Desember 2009 Cara Penentuan Potensi Antimikroba
Tinjauan
Tentang
Cara
Penentuan
Potensi
Antimikroba
Penentuan aktivitas antimikroba suatu ekstrak tanaman dapat dilakukan bila terpenuhi tiga syarat, yaitu (1) ekstrak tanaman harus bisa kontak dengan dinding sel mikroorganisme, (2) Kondisi pengujian diatur sedemikian rupa sehingga mikroorganisme dapat tumbuh saat tidak ada bahan antimikroba, dan (3) Ada parameter ukur tingkat pertumbuhan mikroorganisme (Hostettmann, 1991).Banyak metode yang dapat diterapkan untuk menentukan aktivitas antimikroba dimana masing-masing metode memiliki kelebihan dan kekurangan. Metode-metode yang digunakan antara lain metode difusi, metode pengenceran, metode bioautografi, dan lain-lain. Namun, perlu diperhatikan dahulu cara preparasi bahan uji (ekstrak) agar terpenuhi syarat pertama dalam penentuan aktivitas antijamur seperti tersebut sebelumnya. Preparasi sampel uji (ekstrak) yang bersifat tidak larut air (lipofilik) seperti minyak atsiri atau ekstrak non-polar dapat dilakukan dengan menggunakan pelarut selain-air atau membuat dispersi air atau emulsi dengan bahan surfaktan. Pada prinsipnya tidak disyaratkan dispersi yang homogen pada metode difusi dan pengenceran agar, kecuali pada metode pengenceran cair (dalam tabung). Dispersi air yang mengandung pendispersi dengan berat molekul (BM) yang tinggi (>100.000) harus dihindari dalam metode difusi karena bahan tersebut tidak dapat berdifusi ke dalam media agar 1% (Hostettmann, 1991). Metode Penyebaran (Diffusion Methods) Metode difusi-agar cakram kertas merupakan teknik yang paling sering digunakan untuk menentukan kepekaan bahan antimikroba sampai senyawa kemoterapi (Lederberg, 1992). Secara umum, metode difusi (Kirby-Bauer Method) tidak bisa digunakan untuk mengukur derajat antimikroba suatu zat sehingga metode ini tidak menjamin diidentifikasinya bahan pembunuh antimikroba yang efektif untuk terapi (bakterisida atau fungisida). Hal ini disebabkan adanya perbedaan kecepatan difusi dari senyawa antimikroba yang dipengaruhi berat molekulnya (Jawetz et al., 1996; Black, 2004). Jawetz et al. (1996) menguraikan bahwa ukuran zona untuk suatu zat dapat dibandingkan dengan standar, asalkan perbenihan, ukuran inokulum, dan keadaan lain diatur secara seksama. Hal ini memungkinkan ditetapkannya suatu diameter zona penghambat minimum yang menunjukkan kepekaan dari suatu zat antimikroba. Pada pengukuran standar seperti diuraikan Jawetz et al. (1996), konsentrasi antimikroba berkorelasi dengan diameter zona hambat sehingga bisa digunakan untuk menentukan tingkat kepekaan, yaitu peka (sensitive, susceptible), cukup peka (moderately sensitive, intermediate), dan resisten (resistant) (Black, 2004). Nilai kadar hambat minimum (KHM) berbanding terbalik secara proporsional (linear) dengan diameter zona hambat (Bauer et al., 1974; Lederberg, 1992). Black (2004) mengemukakan adanya versi terbaru metode difusi yang disebut E-test (Epsilo Test). Pada E-test digunakan strip plastik yang mengandung gradien konsentrasi antibiotik. Pada strip tercetak nilai konsentrasi yang memungkinkan secara langsung membaca konsentrasi minimum yang dibutuhkan untuk menghambat pertumbuhan. Titik dimana mulai terjadi hambatan pertumbuhan menunjukkan KHM untuk antibiotik yang diujikan. Hostettmann (1991) menguraikan bahwa metode difusi dilakukan dengan cara menanam
mikroba dalam media agar padat yang sesuai, selanjutnya diletakkan dalam cakram atau silinder yang telah ditetesi dengan bahan uji atau bisa juga dengan memasukkan bahan uji ke dalam lubang atau cangkir agar yang telah dibuat pada media. Media yang berisi inokulum dan bahan uji diinkubasi pada suhu 36-37oC selama 18-24 jam. Aktivitas antimikroba dilihat dengan mengukur daerah di sekitar cakram, lubang, atau cangkir agar yang tidak ditumbuhi miroba. Makin besar diameter hambatan pertumbuhan tersebut berarti aktivitas bahan yang diuji terhadap mikroba makin baik. Jamur yang bertipe koloni ragi atau tidak berfilamen (yeast-like growth, non-mycelial growth) biasanya ditanam secara usapan atau gores-coret (agar surface streak) (Hostettmann, 1991). Penanaman jamur berfilamen yang tumbuh tidak merata pada media menggunakan teknik gores silang (Anonim, 1993). Metode Pengenceran (Dilution Methods) Metode pengenceran dapat digunakan untuk menguji beberapa zat antimikroba secara simultan, tetapi memakan waktu dan mahal. Metode ini memungkinkan dilakukannya uji kedua untuk menilai daya antimikroba suatu zat (Black, 2004). Uji ini mampu dengan tepat mengukur konsentrasi antimikroba yang diperlukan untuk menghambat pertumbuhan suatu inokulum terstandarisasi di bawah kondisi yang ditentukan (Jawetz et al., 1996). Hostettmann (1991) menjelaskan bahwa metode pengenceran dapat dilakukan dengan pengenceran dalam tabung maupun pengenceran agar. Cara pengenceran dalam tabung dilakukan dengan mengencerkan bahan uji dengan media cair menjadi kelipatan dua secara bertahap sehingga didapatkan konsentrasi dengan kelipatan setengahnya. Sedangkan pada pengenceran agar digunakan satu seri lempeng agar dengan konsentrasi bahan uji yang berbeda. Selanjutnya diinokulasi dengan suspensi bakteri dan diinkubasi selama 24 jam pada temperatur 36-37oC dan kemudian diamati hambatan pertumbuhan mikroba dengan membandingkan kekeruhan atau pertumbuhannya dengan kontrol yang mengandung media. KHM didapatkan pada tabung yang jernih pada pengenceran tertinggi. Paxton dalam Hostettmann (1991) mengemukakan bahwa pengujian terhadap jamur menggunakan media cair kurang bagus karena sebagian besar besar jamur tidak tumbuh dan terdispersi dengan baik kecuali beberapa jamur dengan pertumbuhan seperti ragi (yeast-like growth). Jamur yang tumbuh seperti ragi antara lain Candida spp. (Bauer et al., 1974). Metode Bioautografi (Bioautography Methods) (Hostettmann, 1991) Metode ini sangat berguna untuk mengetahui senyawa baru atau senyawa yang belum diketahui aktivitas antimikrobanya. Bioautografi kontak menggunakan prinsip difusi senyawa yang terpisah dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT) atau Kromatografi Kertas (KK). Lempeng kromatografi ditempatkan pada permukaan agar yang telah diinokulasi dengan mikroba. Setelah kira-kira 30 menit, lempeng dipindahkan, diinkubasi dan diamati, senyawa antimikroba akan berdifusi ke dalam lapisan agar dan menghambat pertumbuhan mikroba. Pada bioautografi langsung, zona hambatan diamati secara langsung pada lempeng kromatografi yang sebelumnya telah disemprot dengan suatu suspensi mikroba dalam media agar cair dan diinkubasi pada temperatur dan waktu yang sesuai. Sedangkan metode bioautografi pencelupan dilakukan dengan mencelupkan lempeng kromatografi ke dalam media dan media dibiarkan mengeras. Lempeng kromatografi kemudian diinkubasi dan daerah hambatannya diamati. Metode-Metode Lain (Black, 2004) Metode-metode lain yang dapat digunakan terutama untuk menentukan efektivitas senyawa
kemoterapi yaitu metode daya bunuh serum (serum killing power method) dan metode otomatis (automated method). Pada metode daya bunuh serum digunakan sampel darah pasien yang sedang menerima terapi antibiotik. Suspensi mikroba (bakteri) kemudian ditambahkan pada serum pasien. Pertumbuhan (turbiditas) dalam serum setelah inkubasi mengartikan bahwa antibiotik yang diberikan tidak efektif. Sedangkan pada metode otomatis menggunakan sistem otomatis (instrumen) yang dapat mengidentifikasi mikroorganisme dan menentukan kepekaannya terhadap berbagai senyawa antimikroba. Tinjauan Tentang Metode Gores Silang (Uji Antifungi) Metode gores silang (Cross Scratching Method) merupakan metode baku untuk menguji aktivitas penghambatan suatu bahan uji terhadap jamur T. Mentagrophytes (Anonim, 1993). Metode ini dilakukan dengan mencelupkan kertas saring ke dalam larutan yang diuji lalu diletakkan di atas lempeng agar yang telah digores dengan inokulum jamur. Media agar kemudian diinkubasi selama 3-7 hari pada 24-25 oC. Pertumbuhan jamur diamati, jarak yang tidak ditumbuhi jamur diukur sebagai zona hambat. Cara yang sama juga dilakukan pada waktu yang bersamaan untuk antijamur pembanding.
