Pengujian antimikroba Kompetensi : mahasiswa mengetahui cara kerja pengujian oligodinamik dan zat antimikroba a. Pengertian dan jenis disinfektan b. Cara kerja pengujian disinfektan Ø Pengujian zat disinfektan dengan kertas cakram Ø Pengujian pengaruh daya oligodinamik c. Pengertian Antibiotik Ø Cara kerja pengujian antibiotik dengan metode Kirby-Bauer Pengertian dan Jenis Disinfektan Zat antimikroba adalah senyawa yang dapat membunuh atau menghambat pertumbuhan mikroorganisme. Zat antimikroba dapat bersifat membunuh mikroorganisme (microbicidal) atau menghambat pertumbuhan mikroorganisme (microbiostatic). Disinfektan yaitu suatu senyawa kimia yang dapat menekan pertumbuhan mikroorganisme pada permukaan benda mati seperti meja, lantai dan pisau bedah. Adapun antiseptik adalah senyawa kimia yang digunakan untuk menekan pertumbuhan mikroorganisme pada jaringan tubuh, misalnya kulit. Efisiensi dan efektivitas disinfektan dipengaruhi oleh beberapa faktor yaitu: § Konsentrasi § Waktu terpapar § Jenis mikroba § Kondisi lingkungan: temperatur, pH dan jenis tempat hidup
Pengujian zat disinfektan dengan kertas cakram Cara kerja : · Inokulasikan E. coli dan Bacillus sp. Pada NA cawan sengan streak kontinyu. · Kertas cakram steril dicelupkan ke dalam larutan disinfektan (alkohol 70%, LysoI 5%, betadin, dan hipoklorit 5%). Setelah diangkat, sisa tetes larutan yang berlebihan pada kertas cakram diulaskan pada dinding wadah karena dikhawatirkan larutan akan meluas di permukaan agar jika larutan terlalu banyak. · Kertas cakram diletakkan dipermukaan agar dengan pinset. Tekan dengan pinset supaya kertas cakram benar-benar menempel pada agar. · Inkubasi selama 48 jam pada 37 0C. · Zona hambat yang terbentuk diukur diameternya, bandingkan daya kerja berbagai disinfektan.
Pengujian pengaruh daya oligodinamik Logam-logam berat seperti Hg, Cu, Ag dan Pb bersifat racun terhadap sel meskipun hanya dalam kadar rendah. Logam mengalami ionisasi dan ion-ion tersebut bereaksi dengan bagian sulfihidril pada protein sel sehingga menyebabkan denaturasi. Daya hambat atau mematikan dari logam dengan konsentrasi yang rendah disebut daya oligodinamik. Cara Kerja : · Inokulasikan E.coli dan Bacillus sp. pada cawan NA dengan streak kontinyu · Letakan koin tembaga dan seng ke dalam cawan dengan pinset · Inkubasi 370C selama 48 jam
· Hitung zona hambat yang terbentuk dengan mengukur diameter daerah yang jernih atau tidak ada pertumbuhan
Pengertian dan Jenis Antibiotik Antibiotik adalah bahan yang dihasilkan oleh mikroorganisme atau sintetis yang dalam jumlah kecil mampu menekan menghambat atau membunuh mikroorganisme lainnya. Antibiotik memiliki spektrum aktivitas antibiosis yang beragam. Antibiotik dikelompokkan berdasarkan gugus aktifnya, misal antibiotik macrolide, antimikroba peptida. Adapun penamaannya biasanya berdasarkan gugus kimiawinya ataupun mikroorganisma produsernya, misalnya: Mekanisme kerja antibiotik antara lain : · Menghambat dsintesis dinding sel · Merusak permeabilitas membran sel. · Menghambat sintesis RNA (proses transkripsi) · Menghambat sintesis protein (proses translasi). · Menghambat replikasi DNA.
Prosedur difusi-kertas cakram-agar yang distandardisasikan (metode Kirby-Bauer) merupakan cara untuk menentukan sensitivitas antibiotik untuk bakteri. Sensitivitas suatu bakteri terhadap antibiotik ditentukan oleh diameter zona hambat yang terbentuk. Semakin besar diameternya maka semakin terhambat pertumbuhannya, sehingga diperlukan standar acuan untuk menentukan apakah bakteri itu resisten atau peka terhadap suatu antibiotik. Faktor yang mempengaruhi metode Kirby-Bauer : - Konsentrasi
mikroba uji
- Konsentrasi
antibiotik yang terdapat dalam cakram
- Jenis antibiotik. - pH medium. Cara kerja pengujian antibiotik dengan metode Kirby-Bauer : · Celupkan cotton bud (cotton swab) dalam biakan bakteri kemudian tekan kapas ke sisi tabung agar air tiris · Ulaskan pada seluruh permukaan cawan Mueller-Hinton Agar secara merata · Biarkan cawan selama 5 menit · Kertas cakram dicelupkan dalam larutan antibiotik dengan konsentrasi tertentu. · Angkat, biarkan sejenak agar tiris, selanjutnya letakkan kertas cakram pada permukaan agar. · Kertas cakram ditekan menggunakan pinset supaya menempel sempurna di permukaan agar. · Inkubasi pada suhu 37 0C selama 24-48 jam.
· Ukur diameter zona hambat (mm) kemudian bandingkan dengan tabel. sensitivitas antibiotik.
Tabel Penentuan Sensitivitas Antibiotik (diameter zona hambat dalam mm)
Cara menginterpretasikan : Ukur diameter zona hambat (zona jernih) Misal didapatkan zona hambat suatu bakteri berdiameter 26 mm untuk Eryhtromycin.
Maka interpretasinya adalah bakteri tersebut peka terhadap antibiotik Eryhtromycin. Resistent : tahan Intermediate : medium Susceptible : peka
Judul Penelitian Uji Antiinfeksi pada Punggung Kelinci dan Telaah Fitokimia Ekstrak Etil Asetat dan Etanol Daun Ketimun dan Babadotan Peneliti Gunawan P. W. Elin Yulinah S. Iwang Soediro Abstrak Telah diteliti aktivitas antiinfeksi ekstrak etil asetat dan etanol daun ketimun (Cucumis sativus Linn., Cucurbitaceae) dan daun babadotan ( Ageratum conyzoides Linn., Asteraceae) dalam sediaan salep pada bagian dorsal punggung kelinci yang diinfeksi dengan Staphylococcus aureus. Senyawa antimikroba diidentifikasi secara autobiografi dan kimia. Data antimikroba salep ekstrak etanol lebih kuat daripada salep ekstrak etil asetat, untuk kedua jenis daun. Infeksi pada kulit punggung kelinci sembuh setelah 5 hari pemberian salep ekstrak etil asetat, setelah 3 hari pemberian salep ekstrak etanol dan setelah 9 hari pada kelompok kontrol. Diduga, salah satu senyawa antimikroba dalam ekstrak etil asetat adalah asam p-hidroksi benzoat, sedangkan dalam ekstrak etanol adalah asam p-hidroksi benzoat dan suatu senyawa golongan flavonoid. Keterangan Tesis Tahun 1999 Tempat Penelitian Sekolah Farmasi ITB Isolasi Simplisia daun ketimun dan babadotan dikumpulkan dari satu daerah dan waktu yang sama untuk seluruh penelitian. Kedua jenis daun dikeringkan dan dihaluskan sampai derajat kehalusan tertentu untuk mempermudah penarikan komponen senyawa aktif dalam proses ekstraksi.
Sebelum simplisia diekstraksi dilakukan karakterisasi simplisia dan penapisan firokimia yang bertujuan untuk menstrandarisasi bahan penelitian. Metode ekstraksi yang dipilih adalah eksraksi sinambung dengan menggunakan alat Soxhlet. Ekstraksi dilakukan secara bertingkat dimulai dari pelarut non polar, semi polar sampai ke pelarut polar. Ekstrak yang diperoleh diuji aktivitas antimikrobanya secara in vitro. Pada uji tersebut ditentukan konsentrasi hambat minimum dan kesetaraan dengan antibiotik pembanding. Ekstrak yang menunjukkan aktivitas antimikroba dibuat dalam bentuk sediaan topikal dengan menggunakakn basis tertentu dan diuji daya antimikrobanya pada punggung kelinci yang diinfeksi dengan S. Aureus. Untuk meneliti golongan senyawa dari komponen aktif, dilakukan fraksinasi ekstrak aktif menggunakakn kromatografi kolom cair vakum (KCV) dengan sistem pelarut landaian. Masingmasing fraksi diuji aktivitas antimikrobanya. Dari fraksi aktif yang diperoleh dilakukan bioautografi sehingga diketahui komponen aktifnya. Untuk mengidentifikasi golongan senyawa dari komponen aktif tersebut dilakukan penelitian yang meliputi kromatografi dengan menggunakan zat pembanding, pengamatan fluoresensi di bawah sinar UV, penentuan harga Rf dan identifikasi dengan pereaksi penampak bercak.
Pembuatan ekstrak Sebanyak 80 g serbuk simplisia diekstraksi sinambung menggunakan alat Soxhlet. Ekstraksi dilakukan secara bertingkat dimulai dari n-heksana, etil setat dan etanol. Masing-masing ekstrak dikumpulkan, dipekatkan dan dikeringbekukan. Fraksinasi ekstrak aktif Sebanyak 2 g ekstrak etilaseta daun ketimun dikromatografi cair vakum dengan mengunakan sistem pelarut landaian dari pelerut poler n-heksana ke pelarut polar etanol. Identifikasi Fraksi aktif hasil bioautografi dikromatografi dengan cara yang sama ditotolkan pada kertas Whatman No.1, dikembangkan dengan pelarut asam asetat 20%. Deteksi bercak dilakukan dengan menggunakan sinar UV, pereaksi p-nitroanilin didiazotasi dan perekasi alumunium triklorida. Ekstrak dan fraksi etil asetat daun ketimun menunjukkan aktivitas sebagai antibakteri terutama terhadap Staphylococcus aureus. Aktivitas ini muncul karena adanya senyawa yang diduga sebagai asam p-hidroksi benzoat dan dua senyawa lain yang belum diketahui. Ekstrak dan fraksi etanol daun ketimun lebih aktif terhadap fungi daripada terhadap bakteri. Perbedaan aktivitas ekstrak etanol dengan ekstrak etil asetat dapat disebabkan karena perbedaan komponen yang terektraksi yaitu adanya senyawa flavonoid serta lebih rendahnya kandungan senyawa yang diduga sebagai asam p-hidroksi benzoat dalam ekstrak etanol. Fraksi etil asetat daun babadotan menunjukkan bahwa dari tiga bercak hanya dua bercak yang menunjukkan aktivitas antibakteri, salah satu bercak memiliki Rf yang sama dengan harga Rf asam p-hidroksi benzoat pembanding, bercak lain belum teridentifikasi. Sedangkan pada fraksil etanol daun babadotan diberikan oleh bercak yang diduga masih merupakan campuran dari beberapa senyawa. Uji Farmakologi Uji Aktivitas Antimikroba Ekstrak secara In Vitro Mikroba yang diuji meliputi bakteri Gram positif S. Aureus, bakteri Gram negatif E. Coli dan P. Aerugiinosa dan fungi C. Albicans, A. Niger dan M. Gypseum. Tiap ekstrak dibuat larutan dengan konsentrasi antara 2,0-0,5 % b/v. Ekstrak n-heksana dilarutkan dalam pelarut n-heksana, ekstrak etil asetat dan ekstrak etaol dilarutkan dalam pelaut etanol 5%. Uji antimikroba dilakukan dengan metode difusi agar. Setiap ekstrak ditentukan diameter hambatannya. Dari hasil uji ditentukan nilai KHM dan kesetaraan dengan antibiiotik tetrasiklin HCl. Uji Aktivitas Antiinfeksi Ekstrak pada Kelinci Sebelum pengujian dilakukan aklimatisasi kelinci di laboratorium selama 1 minggu. Bulu pada bagian punggung kelinci dicukur keumdian dipilih tiga lokasi penyuntikan di badian kanan dan tiga lokasi di bagian kiri, dengan jarak masing-masing lokasi lebih kurang 5 cm. Suspensi Staphylococcus aureus berusia 18-24 jam dengan tra nsmitan 25%T, disuntikkan secara intrakutan sebanyak 0,5 ml pada masing-masing lokasi pada punggung kelinci yang telah disiapkan. Pemberian salep dilakukan setelah munculnya eritema pada daerah suntikan. Tiga daerah eritema diberi slep yang mengandung ekstrak uji 20% b/b (ekstrak etil asetat daun ketimun, ekstrak
etanol daun ketimun, ekstrak etil asetat babadotan, ekstrak etanol babadotan), sedang tiga daerah lainnya dijadikan kontrol. Untuk mencegah terjadinya kontaminasi bakteri semua lokasi penyuntikan ditutup dengan verban steril. Pemberian salep dilakukan setiap hari sampai nanah dan eriteme hilang. Pengamatan terhadap perkembangan eritemea dan kesembuhan luka dilakukan selama 9 hari. Uji Aktivitas Antimikroba Fraksi Secara In Vitro Fraksi yang telah dikeringkan segera dilarutkan dalam pelarut 95%. Pengujian aktivitas antimikroba hanya dilakukan terhadap bakteri yang peka, sesuai dengan hasil uji aktivitas antimikroba ekstrak. Bioautografi Fraksi yang menunjukkan aktivitas antimikroba paling kuat dikromatografi kertas. Fraksi tersebut ditotolkan pada kertas Whatman No.1, dikembangkan dengan pelarut asam asetat 20%. Sesudah diangkat dan dikeringkan, kertas dilihat di bawah sinar UV, ditandai bercaknya dan diuji aktivitas antimikrobanya. Untuk melakukan bioautografi, kromatogram kertas yang mengandung beberapa komponen senyawa aktif, ditempelkan pada medium NA yang telah dicampur dengan biakan mikroba, selama ± 1 jam. Hal ini bertujuan agar senyawa tersebut berdifusi ke dalam medium. Sebelum kertas diangkat, ditandai dulu bercaknya pada bagian luar. Selanjutnya media biakan diinkubasi. Ekstrak dan fraksi etil asetat daun ketimun menunjukkan aktivitas sebagai antibakteri terutama terhadap Staphylococcus aureus. Aktivitas ini muncul karena adanya senyawa yang diduga sebagai asam p-hidroksi benzoat dan dua senyawa lain yang belum diketahui. Ekstrak dan fraksi etanol daun ketimun lebih aktif terhadap fungi daripada terhadap bakteri. Perbedaan aktivitas ekstrak etanol dengan ekstrak etil asetat dapat disebabkan karena perbedaan komponen yang terektraksi yaitu adanya senyawa flavonoid serta lebih rendahnya kandungan senyawa yang diduga sebagai asam p-hidroksi benzoat dalam ekstrak etanol. Ekstrak dan feaksi etil asetat daun babadotan menunjukkan aktivitas antimikroba terhadap S. Aureus, P. Aeruginosa dan Candida albicans. Sedangkan ekstrak dan fraksi etanol aktif terhadap C. Albicans, M. Gypseum dan A. Niger. Sediaan salep yang mengandung ekstrak etil asetat menunjukkan aktivitas antimikroba yang lebih rendah dibandingkan dengan salep yang mengandung ekstrak etanol.Hasil uji aktivitas antiinfeksi ekstrak pada punggung kelinci menunjukkan bahwa daerah infeksi yang diberi sediaan salep sembuh dalam waktu 3-5 hari sedangkan kelompok kontrol yang tidak diobati sembuh dalam waktu 9 hari.
Bagi mereka yang mengutip hasil penelitian ini wajib menuliskan sumbernya Sekolah Farmasi ITB http://bahan-alam.fa.itb.ac.id
