UNIVERSIDAD PEDAGÓGICA Y TECNOLÓGICA DE COLOMBIA FACULTAD DE CIENCIAS Escuela de Ciencias Químicas-Programa Químicas-Programa de Química de Alimentos Laboratorio de Bioquímica I Angélica María García T.
9. ACTIVIDAD CATALASA (en alimentos) Fecha: 10 de enero de 2012 Material a traer por parte del estudiante: trocitos de hígado fresco, trocitos de tomate y papa (ya pelada), cuchillo, guantes y tapabocas. TRAER EL MATERIAL BIOLÓGICO LISTO!!! OBJETIVOS
Identificar la presencia de la enzima catalasa en tejidos animales y vegetales. Determinar la desnaturalización de la catalasa y con ello la l a pérdida de su función catalítica. Analizar la cinética enzimática en función de la concentración concentración del sustrato.
INTRODUCCION De todas las funciones de las proteínas, la catálisis es tal vez la más importante. La catalasa es una enzima que se encuentra en las células de los tejidos animales y vegetales cuya función es la descomposición del peróxido de hidrógeno generado durante el metabolismo metabolismo celular.
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Químicamente, la catalasa es una proteína y por lo tanto puede sufrir desnaturalización por diversos factores (analizados experimentalmente en Propiedades de las Proteínas ), ), entre ellos, la temperatura. La catalasa al ser sometida a altas temperaturas pierde su estructura terciaria y por lo tanto, su función biológica, es decir, la catálisis. Por otra parte, una forma de calcular la velocidad de una reacción enzimática es determinando la cantidad de sustrato transformado transformado por 1 mL de enzima por 1 minuto; esta es una de las formas de indicar la actividad específica de la enzima en donde además se puede determinar el comportamiento michaeleano de la reacción enzimática y con ello los valores de Km (constante de michaeles-menten) michaeles-menten) y Vmax (velocidad máxima de la reacción catalizada) Consulta previa a la práctica (preinforme con bibliografía incluída) 1. Cuáles son los factores que afectan la actividad catalítica de las enzimas? 2. La Unión Internacional de Bioquímica y Biología Molecular ha desarrollado una nomenclatura para identificar a las enzimas basada en los denominados Números EC. EC. De este modo, cada enzima queda registrada por una secuencia de cuatro números precedidos por las letras "EC". Cual es la clasificación y nomenclatura de la catalasa? 3. Cuáles son los efectos adversos en la deficiencia o ausencia de la enzima catalasa en el organismo? 4. A qué se refiere el concepto: cinética de Michaeles-Menten?, realice un gráfico que indique sus principales constantes numéricas. 5. A qué se refiere el concepto: diagrama cinético de Lineweaver-Burk?, realice un gráfico que indique sus principales constantes numéricas. Nota: las anteriores preguntas serán formuladas y evaluadas por escrito como requisito previo a la práctica
MATERIALES Y REACTIVOS Gradilla, 5 tubos de ensayo, 3 pipetas de 5 mL, 3 erlenmeyer o vasos de precipitados de 200 mL, 1 vaso de precipitados de 500 mL, mortero con mango, bureta, embudo de vidrio para bureta, pinzas para bureta, estufa o plancha de calentamiento, agua oxigenada 0,1M, soluciones de almidón y lugol, solución de Fehling, ácido sulfúrico 6N, permanganato de potasio 0,01M, agua destilada.
PROCEDIMIENTO 1. DEMOSTRACIÓN DE LA PRESENCIA DE LA ENZIMA CATALASA Coloque en 3 tubos de ensayo los trocitos de hígado, tomate y papa. A cada tubo añadir 5 mL de agua oxigenada. Realice el respectivo análisis de resultados, indicando el aspecto final de cada tubo de ensayo así como el orden de actividad de la catalasa (de mayor a menor) en cada muestra. • • •
2. DESNATURALIZACIÓN DE LA CATALASA Coloque en 3 tubos de ensayo los trocitos de hígado, tomate y papa. A cada tubo añadir agua destilada y someta a ebullición las muestra durante 5 minutos. Retire el agua sobrante. A cada tubo añadir 5 mL de agua oxigenada. Realice el respectivo análisis de resultados en cada muestra. • • • • •
3. CINÉTICA ENZIMÁTICA 3.1. Obtención de una solución que contiene la enzima catalasa Triture una porción de hígado (2g) en un mortero hasta obtener una pasta fina. Adicione 8 mL de solución buffer fosfato pH:7,4 y continue moliendo hasta obtener una pasta homogénea. Diluir la pasta con otros 8 mL de buffer fosfato pH 7,4. Centrifugar a 2500 rpm durante 5 minutos. Decante el sobrenadante que contiene a la enzima en un tubo de ensayo e incúbelo durante 15 minutos a temperatura ambiente con el fin de eliminar los sustratos prexistentes. 3.2. Actividad y cinética enzimática Tome en un tubo de ensayo 4 mL de la solución de enzima y someta a ebullición durante 5 minutos. Rotule el tubo como solución enzimática hervida. Prepare el siguiente set de tubos: • •
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Tubos 1 2 3 4 5 6 Reactivos mL mL mL mL mL mL H2O2 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 2.5 0,1 M Agua 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.5 destilada Enzima sin 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 --hervir Enzima ----------1.0 hervida Nota: no olvidar controlar cuidadosamente el tiempo de reacción catalítico en cada tubo con el fin que la enzima actúe en iguales condiciones, por lo tanto, no adicione la enzima hasta no tener preparado y previamente agitados todos los tubos de ensayo. Adicionar al tubo 1 la solución de enzima y agite, mida el tiempo. Transcurridos 30 segundos añada enzima al tubo 2 y así sucesivamente hasta completar el tubo 6. Transcurridos exactamente 5 minutos de reacción en cada tubo, adicione a cada uno 2 mL de ácido sulfúrico 6N, agitar muy bien. Terminada la reacción, pase el contenido de cada tubo a vasos de precipitados y titule con permanganato de potasio 0,01M (el punto final es un color rosa pálido). El permanganato titula el peróxido que no fue descompuesto por la catalasa. •
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5 + 2 →5 •
La actividad específica de la catalasa es la cantidad de H 2O2 0,1M descompuesto por 1 mL de catalasa en un minuto.
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Con base en lo expuesto anteriormente, complete el siguiente cuadro a partir del volumen de titulante utilizado así como de la cantidad de enzima y tiempo empleados:
Reactivos
Tubos
1 mL
2 mL
3 mL
4 mL
5 mL
6 mL
H2O2 No descompuesto en 5 minutos H2O2 descompuesto por 1.0 mL de enzima en 5 minutos (µmoles) Actividad específica de la enzima catalasa Con base en los resultados anteriores, realice la respectiva representación gráfica de MichaelisMenten (velocidad de reacción en las ordenadas y concentraciones iniciales de sustrato en las abscisas). A partir del gráfico obtenido determinar la Vmax y Km. Realice la respectiva representación gráfica de Lineweaver-Burk (1/velocidad de reacción en las ordenadas y 1/concentraciones iniciales de sustrato en las abscisas). A partir del gráfico obtenido determinar la Vmax y Km. Qué diferencia encuentra entre los cálculos de Vmax y Km en los dos tipos de representaciones gráficas?. Cuál es más exacta? •
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BIBLIOGRAFIA MIYARES CALAS, MIGUEL . Cuaderno de Trabajos Prácticos de Bioquímica I. FUD. MIGUEZ OTALORA, José Bernardo. Prácticas de Bioquímica. Universidad Pedagógica y Tecnológica de Colombia. MORRISON AND BOYD. Química Orgánica. Editorial Fondo Educativo Internamericano. CERRETTI, Helena y Zalts, Anita. Experimentos en Contexto. Química . Manual de Laboratorio. Editorial Pearson. Argentina. 2000. BOHINSKI. Bioquímica . Editorial Pearson. México. 1998. CAMPBELL, Mary y FARREL, Shawn . Bioquímica. Editorial Thomson. México. 2004 PACHECO LEAL, Daniel. Bioquímica Medica. Editorial Limusa. México. 2005
