Presencia, propiedades de la enzima catalasa y cinética enzimática de los alimentos. Presence catalase properties and food enzyme kinetics. Sebastián Ramos, Alejandra Fonseca, Marisol Gómez. Resumen : Se le adiciona Peróxido de hidrogeno a las muestras de tomate, papa, y espinaca, para observar la
existencia de la enzima catalasa. La cinética enzimática se realizó con la muestra de hígado y se observa la actividad específica de la catalasa a diferentes concentraciones de H 2O2, manteniendo constante la concentración de la enzima. Se realiza las representaciones de Michaeles y Menten y de Lineweaver-Burk para determinar la Vmax y la Km, siendo muy diferentes los valores obtenidos por cada método.
A b s t r a c t : Is added to hydrogen peroxide samples tomatoes, potatoes, and spinach, to observe the existence of the
enzyme catalase. The enzyme kinetics were performed with the sample and the specific activity of liver catalase is observed at different concentrations of H2O2, keeping constant the concentration of the enzyme. Michaeles representations Menten and Lineweaver-Burk and is performed to determine the Vmax and Km, with very different values obtained by each method. Fecha de entrega del informe:
24 de junio de 2014
desnaturalización, acción enzimática. Palabras clave: Catalasa, desnaturalización,
Introducción
Muchos organismos pueden descomponer el peróxido de hidrógeno (H2O2) por la acción de las enzimas. Las enzimas son proteínas globulares responsables de la mayor parte de la actividad química de los organismos vivos. Actúan como catalizadores, que son sustancias que aceleran las reacciones químicas sin ser destruidas o alteradas durante el proceso. Las enzimas son extremadamente eficientes y se pueden utilizar una y otra vez repetidamente. Una enzima puede catalizar miles de reacciones en cada segundo. Tanto los valores de pH como de la temperatura a los que trabaja la enzima son extraordinariamente importantes. La mayoría de los organismos tienen un intervalo de temperatura preferente en el cual sobreviven y sus enzimas funcionan mejor dentro de dicho intervalo de temperatura. Si el ambiente donde se encuentra la enzima es demasiado ácido o demasiado básico, la enzima puede desnaturalizarse de forma irreversible o transformarse de modo que su forma no le permita más realizar su funcionamiento apropiado. La catalasa es una enzima que se encuentra en las células de los tejidos animales y vegetales. La función de esta enzima en los tejidos es necesaria porque durante el metabolismo celular, se forma una molécula tóxica que es el peróxido de hidrógeno, H2O2 (agua oxigenada). Esta enzima, la catalasa, lo descompone en agua y oxígeno, por lo que se soluciona el problema. La reacción de la catalasa sobre el H2O2, es la siguiente: Reacción 1 catalasa
2 H2O2
2 H2O + O2
La existencia de catalasa en los tejidos animales, se aprovecha para utilizar el agua oxigenada como desinfectante cuando se echa sobre una herida. Como muchas de las bacterias patógenas son anaerobias (no pueden vivir con oxígeno), mueren con el desprendimiento de oxígeno que se produce cuando la catalasa de los tejidos actúa sobre el agua oxigenada. La desnaturalización de una proteína se refiere a la ruptura de los enlaces que mantenían sus estructuras cuaternaria, terciaria y secundaria, conservándose solamente la primaria. En estos casos las proteínas se transforman en filamentos lineales y delgados que se entrelazan hasta formar compuestos fibrosos e insolubles en agua. Los agentes que pueden desnaturalizar a una proteína pueden ser: calor excesivo; sustancias que modifican el pH; alteraciones en la concentración; alta salinidad; agitación molecular; etc... El efecto más visible de éste fenómeno es que las proteínas se hacen menos solubles o insolubles y que pierden su actividad biológica. Ya que la catalasa químicamente es una proteína, podemos desnaturalizarla al someterla a altas temperaturas. Al perder la estructura terciaria, perderá también la función y como consecuencia su función catalítica, por lo que no podrá descomponer el agua oxigenada y no se observará ningún tipo de reacción cuando hagamos la experiencia anterior con muestras de tejidos hervidos. Determinando la presencia de enzima, se puede efectuar la cinética de reacción enzimática con relación a la concentración del sustrato. Una forma de calcular la velocidad de una reacción enzimática es determinando la cantidad de sustrato transformado por 1 ml de enzima en un minuto; esta es una forma de indicar la actividad específica de la enzima en donde
además es posible conocer el comportamiento Micheliano de la reacción y los valores de Km y Vmax. Resultados y discu sión de resultados 1.
Demostración de la existencia de la enzima
La concentración de la catalasa en distintos tejidos y organismos es directamente proporcional a la rapidez e intensidad del burbujeo con peróxido de hidrógeno, por lo que se puede relacionar la cantidad de burbujeo producido con la concentración de catalasa presente en la muestra.
Figura 1: Muestras sin adicionar H2O2 2.
Cinética Enzimática
Para la obtención de la enzima catalasa tomamos la muestra que contiene una gran cantidad de esta. En este caso la muestra de hígado. Y la trituramos con 8 ml de solución buffer fosfato pH= 7,4, hasta que se homogenizo la pasta. Figura 3: Muestra a centrifugar.
Después de realizar la adecuación de las muestras, se adicionó 5 ml de peróxido de hidrógeno, formando un burbujeo y espuma permitiendo observar la presencia de la enzima catalasa. Figura 2: Muestras con H2O2.
Se realizó la centrifugación y se decantó para obtener la solución con la que se trabajó posteriormente. Se preparan 6 tubos con los siguientes reactivos para observar la actividad y la cinética enzimática. Tabla 2. Distribución de los reactivos en ml.
La interacción entre los trozos de tomate y el peróxido de hidrógeno produjo pequeñas cantidades de espuma, la reacción entre la papa y el peróxido de hidrógeno produjo cantidades medias de espuma y la interacción entre la espinaca y el peróxido de hidrógeno produjo una mayor cantidad de espuma respecto a los anteriores. El orden de actividad lo observamos de acuerdo al tiempo requerido en la reacción entre el peróxido de hidrógeno con la enzima catalasa. Tabla 1: Orden de actividad
Tejido Tomate Papa Espinaca
Orden de actividad Lento Medianamente lento Rápida
H2O2 0,1 M Agua destilada Enzima no hervida Enzima hervida
1
2
3
4
5
6
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
4,5
4,0
3,5
3,0
2,5
2,0
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
-
-
-
-
-
-
1,0
Posteriormente se realizó la titulación de las muestras con permanganato de potasio, en el tubo 6 no se obtuvo un cambio por la titulación. Tabla 3. Volumen de KMNO4 gastado en la titulación.
Tubo 1 2 3 4 5 6
ml KMNO4 gastados 1,4 1,7 2,1 2,7 3,2 11
Al titular con permanganato de potasio se está determinando la cantidad de H 2O2 que no ha sido descompuesto por la catalasa durante los 5 minutos de reacción, esto se ve en la siguiente ecuación: El tiempo de la reacción fue de 5 minutos. Al titular con permanganato de potasio se está determinando la cantidad de H2O2 que no ha sido descompuesto por la catalasa durante los 5 minutos de reacción, esto se ve en la siguiente ecuación:
Tubo
Concentración inicial sustrato (M)
1 2 3 4 5
0.01 0.02 0.03 0.04 0.05
Grafica 1. Representación de Michaeles y Menten
para ver la cinética enzimática.
3 H2SO4 + 2 KMnO 4 + 5 H2O2 ------> K 2SO4 + 2 MnSO4 + 8 H2O + 5O2
Los cálculos de la columna 4 son realizados por medio de una regla de tres para obtener la cantidad de peróxido de hidrógeno descompuesto por 1 ml de enzima en 1 minuto:
Para convertir el volumen a μmoles se
realizo y hallar
la actividad enzimática:
( )( )
Tabla 4. Actividad específica de la enzima catalasa en
cada tubo Tub o
1 2 3 4 5
H2O2 no descompues ta en 5 minutos (ml)
H2O2 descompuesta por 1 ml de enzima en 5 minutos (mL)
H2O2 descompuest a por 1 ml de enzima en 1 minuto (mL)
Actividad específica de la catalasa (umol*10 4/min)
1,4 1,7 2,1 2,7 3,9
3,6 3,3 2,9 2,3 1,1
0,72 0,66 0,58 0,46 0.22
3,069 2,813 2,472 1,960 0,937
Para realizar el gráfico de Michaelis-Menten se hallaron las concentraciones iniciales de sustrato utilizando la ecuación de dilución: V1C1= V2C2 donde V1 y C1 : volumen y concentración de solución concentrada de sustrato respectivamente. El modelo de cálculo utilizado es:
Para el tubo 1 Tabla 5: Concentraciones de sustrato iniciales en
cada tubo
En la gráfica anterior se realizó sin tener en cuenta el tubo 6, debido a que en este la enzima estaba desnaturalizada, por lo tanto no se consumió peróxido de hidrogeno en esta reacción, todo reacciono con el permanganato de potasio. La constante Km se halla diviendo la velocidad máxima en 2 (50% de actividad enzimática):
= 1,5345 μmoles*104/min
Éste valor se interpoló y se obtuvo un valor proximado de Km correspondiente a 0.015 M. Para realizar una determinación un poco más precisa se usa la representación de Lineweaver-Burk, representa 1/v frente a 1/[s] y permite determinar a partir de medidas experimentales parámetros básicos de la cinética enzimática como la constante de Michaelis y la velocidad máxima de reacción. Tabla 6. Datos para la representación de Lineweaver-
Burk. 1/v 0,326 0,355 0,404 0,510 1,067
1/[s] 100,0 50,0 33,3 25,0 20,0
Grafica 2. Representación de Lineweaver-Burk
no ha sido descompuesto por la catalasa.Se observa que la actividad especifica aumenta conforme aumenta la concentracion de H2O2.
Gráfica Lineweaver-Burk y = 0.0094x + 0.104 R² = 0.9835
1.2
a s a l 1 a t ) a n c i 0.8 a m c / 0.6 i t 4 á 0 1 m 0.4 i * z s e n l e o 0.2 d m a μ d i ( 0 v i t c A
En el análisis de la cinética enzimática no se utilizó los datos del tubo No 6 ya que en este la catalasa esta desnaturalizada debido al aumento de la temperatura. Los datos de Vmax y de Km obtenidos de la representación de Michaeles-Menten presentaron grandes diferencias respecto a los obtenidos en la representación de Lineweaver-Burk. Bibliografía
0
50
100
150
Concentración del sustrato M -1
Según las ecuaciones de éste método:
El punto de corte con ordenada: b
Utilizando la ecuación de la recta b = 0,104
la pendiente de la recta m: Entonces:
M La ecuación de Michaeles- Menten da como resultado una gráfica hiperbólica la cual es una relación entre la velocidad de una reacción catalizada por una enzima frente a la concentración de sustrato disponible en el tiempo, mientras que la representación de Lineweaver-Burk es una ecuación lineal de la ecuación de la de Michaeles Menten. Esta tiene una serie de ventajas cuando se estudia la cinética enzimática, ya que la Vmax y Km pueden así determinarse con más facilidad. Los efectos inhibidores pueden analizarse con mayor exactitud. Conclusiones
De las muestras con las que se trabajo, la espinca fue la que contenia mayor cantidad de catalasa, ya que experimentalmente se observo una gran cantidad de espuma, debido a la reaccion del peroxido catalisado por la catalasa, la cual produce agua y oxigeno.El orden de actividad observado fue dado a la cantidad de catalasa contenida en la muestra. Para observar la cinetica enzimática se tomó la muestra de hígado debido a las altas concentraciones de la enzima catalasa que presentan los tejidos animales. Se tituló con permanganato de potasio ya que este descompone el peroxido de hidrogeno que
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