Preparaciones microbiológicas y tinciones Domínguez Martínez Ricardo Orduña Amado Giuliana Carolina Equipo 8
Resumen Se observaron diversas bacterias en un microscopio de campo claro mediante preparaciones húmedas y fijas, tinciones como la simple, las diferenciales como lo son las de Gram y Ziehl Neelsen que son para teñir bacterias acido-alcohol resistente; y por ultimo tinciones selectivas tales como endoespora y negativa (cápsula). Lográndose apreciar las diferencias morfológicas entre las bacterias. Por lo tanto, dependiendo del microorganismo que se tenga, se debe utilizar la tinción apropiada para observarlo.
Tinción Gram positiva Micrococcus leutus: Al teñirse de azul es bacteria Gram positiva con morfología en cocos tétradas. Streptomyces sp. : Se tiñe de color azul, se ven las bacterias largas y amontonadas entre sí por lo tanto son filamentosas. Bacillus cereus: Se observan bacilos de color azul, principalmente tienen una agrupación en duplas o en cadenas de más de 4 bacilos juntos. Tinción Gram negativa
Resultados Preparación Húmeda: Observamos a los protozoarios que son translucidos en forma circular u ovalada en su ambiente natural y como se dificulta verlos debido a que andan en constante movimiento. Se pueden diferenciar fácilmente de las bacterias debido a que son 10 veces más grandes en promedio que estas.
Serratia marcescens: Generalmente podemos observar bacilos de tamaño muy pequeño, su agrupación es en pares y triadas, coloreadas de color rosa. Maraxella sp. : Cocos, agrupados en parejas (diplococos) se encuentran teñidos color rosa por lo tanto su Gram es positivo
Tinción simple
Tinción de Ziehl-Neelsen (BAAR)
Saccharomyces cerevisiae: De color azul (por el colorante que aplicamos), y estaba en forma de dos circunferencias juntas.
Mycobacterium sp. : Es un bacilo no tiene agrupación alguna, presenta una coloración roja ya que es un microorganismo el cual tiene una ácidoalcohol resistencia (BAAR).
Rhodotorula sp. : Varios microorganismos circulares dispersos.
Mycobacterium sp. y Micrococcus leutus: Observan claramente los dos microorganismo ya que Mycobacterium sp. al ser BAAR se tiñe de rojo y M. leutus es una bacteria Gram positiva azul en forma de cocos Tinción selectiva (Endospora) Bacillus cereus: Bacilos de color rosado, en el centro en los extremos del bacilo se puede observar la endoespora coloreada de color verde, principalmente tienen una agrupación en duplas o en cadenas de más de 4 bacilos. Tinción Negativa (cápsula) Muestra pulque: se observó un bacilo sin agrupación, con la capsula color morado ya que es la que se resalta por el color primario que le agregamos en este casi cristal violeta, a su alrededor se observa un halo. Análisis En la preparación húmeda se observan los microorganismos moviéndose. Con una pipeta Pasteur se coloca una gota de la muestra en el centro del portaobjetos y luego ésta se cubre con un cubreobjetos para así poder verlo en el microscopio. No debe pasar mucho tiempo pues la preparación se seca. Las preparaciones fijas se hacen para poder teñir los microorganismos posteriormente. En condiciones asépticas y con el asa estéril, se toma una pequeña cantidad de cultivo y se pone en el centro del portaobjetos (si el cultivo tomado es sólido se debe mezclar con una gota de
agua en el portaobjetos). Se deja secar y después, para fijar, se pasa 3 veces por la flama del mechero. Las tinciones pueden ser: -SIMPLES. Utilizan un solo colorante. Se basan en el hecho de que las células tienen una composición química diferente a la de su entorno. - DIFERENCIALES. Se basan en el hecho de que distintos tipos de células tienen distinta composición química. Realizamos 2 tinciones de este tipo: 1) tinción de Gram: Primero se agregó un colorante con carga positiva (cristal violeta) que se enlaza a carga negativa de partes internas de los microorganismos, observándose totalmente teñidos. Posteriormente se añade lugol, que actúa como agente mordente (I°/KI) y forma un complejo con el cristal violeta( refuerza la unión entre el colorante y el sustrato).Después se añade un agente decolorante (alcohol/acetona), siendo éste el punto crítico de la tinción: si las bacterias son Gram positivas no se decoloran debido a que tienen una pared gruesa de peptidoglucano que sólo se deshidrata, impidiendo la salida del complejo; si las bacterias son Gram negativas se decoloran porque tienen una capa lipídica y lipopolisacáridos que se eliminan con el solvente no polar, por lo que el complejo puede salir de la célula. Finalmente se añade un colorante de contraste (safranina) que tiñe a las bacterias Gram negativas que estaban incoloras. 2) Tinción de ácido-alcohol resistencia (de Ziehl-Neelsen).
El colorante primario es fuscina fenicada. Si las células son ácido alcohol resistentes (contienen ácidos micólicos) no permitirán el paso del colorante, por lo que se calienta la muestra para reblandecer las ceras y así, permitir el paso del colorante. Las bacterias que son no ácido alcohol resistente también se tiñen con el colorante. Posteriormente se añade un agente decolorante (alcohol ácido) que arrastrará el colorante fuera de las bacterias no ácido alcohol resistentes(carecen de los ácidos micólicos en su pared celular). En cambio, en las bacterias ácido alcohol resistente, la fuscina fenicada, que es no polar, es muy soluble en los lípidos de su membrana, por lo que se quedarán teñidas. Las bacterias no ácido-alcohol resistentes tomarán el color del colorante de contraste. - SELECTIVAS. Se basan en el hecho de que distintas estructuras celulares tienen distinta composición química. Realizamos 2 tinciones de este tipo:
Finalmente se agrega safranina para resaltar a la célula vegetativa. 2) Tinción Negativa (cápsula) La cápsula está constituida principalmente por agua y polisacáridos como dextranas y alginato. Por su composición química no es fácil teñirla, por lo que se tiene que oscurecer el fondo de la preparación para observarla y se utiliza un colorante para teñir a las células. El fondo se oscurece con tinta china, la cual es un coloide por lo que no penetra las células y posteriormente se agrega safranina para poder visualizar las bacterias. La cápsula se observa como una zona transparente alrededor de la célula. Conclusiones Es importante conocer las diferentes características morfológicas de los microorganismos, así como la composición química de las estructuras que los conforman para saber el tipo de tinción que se debe realizar.
1) Tinción Selectiva (endospora) Las endosporas son refráctiles, por lo que pueden observarse haciendo una tinción simple, sin embargo no todas las estructuras refráctiles son endosporas, por ello se lleva a cabo la tinción selectiva. En esta tinción el colorante primario es el verde de malaquita, que servirá para teñir la endospora, pero está es impermeable al colorante pues contiene dipicolinato de calcio, por lo que debe calentarse.
De igual forma, es importante saber realizar adecuadamente las técnicas de preparación y tinción para tener éxito en la observación al microscopio de los microorganismos. Bibliografía Montoya V. Hugo H. Microbiología básica para el área de la salud y afines. 2da edición, editorial Universidad de Antioquia, Colombia 2008. pp. 20
