PRACTICA No. 6 TINCIONES 1.-OBJETIVO Realizar Realizar el procedimient procedimiento o (tinción) (tinción) para identificar identificar microorganismo microorganismoss gram-posit gram-positivos ivos y gram-negativos con la ayuda del microscopio.
2.-INTRODUCCION Para la observación de los microorganismos es necesario la utilización del microscopio, debido a que estos son seres de d e tamaño microscópicos y no pueden pued en ser vistos a simple vista. Para que la observación de microorganismos sea lo meor posible se debe tomar en cuenta otros factores, como lo pueden ser la previa preparación de los microorganismos ya que es necesario que estos presenten cierto grado de contraste con el medio para poder ser visibles en el microscopio. !ste factor tiene una gran importancia debido a que los microorganismos no presentan color, es por ello que deben ser tratados con procesos de tinción los cuales les aportaran cierto como caracter"stico de cada bacteria y as" poder ser vistos. #inción simple$ se basa en la afinidad del colorante por los componentes celulares. %a tinción puede ser uniforme o presentar algunos gr&nulos en su interior. 'tiliza un solo colorante (violeta de genciana, azul demetileno, fuscina diluida).%a tinción simple se utiliza para destacar el microorganismo completo para que se vean las formas y las estructuras celulares b&sicas. !n las tinciones simples se usa un nico reactivo, que preferentemente es de tipo b&sico y contiene un cromógeno (compuesto que da color al tinte) con carga positiva, ya que la pared celular de las bacterias posee componentes con carga negativa que atraen atraen y enlazan enlazan el cromógeno. e utilizan utilizan solamente solamente para incrementar incrementar el contraste* contraste* todas las c+lulas absorber&n el colorante y quedar&n teñidas del mismo color. Por tanto, la tinción simple meora la observación de la c+lula c+ lula completa. #inción diferencial$ son aquellas tinciones que se utilizan para diferenciar de manera mas eplicita a los microorganismos. !n estas tinciones se utilizan los colorantes diferenciales, que se componen de una sustancia tintórea. lgunas de estas tinciones son la tinción de ram, y tinción de acido resistente.
#inción especifica$ utilizada para observar las estructuras y aumentar el contraste de las c+lulas microbianas, tales como$ flagelos, capsula y endosporas. !stos tipos de tinciones son utilizadas para la identificación de microorganismos, bas&ndose en el tipo de color que estos puedan presentar. %a preparación de microorganismos puede ser fia o teñida para colonias cultivadas, de donde son tomadas las muestras que se colocaran en el portaobetos y as" realizarse el procedimiento correspondiente. Para la observación de bacterias teñidas primeramente realizar un
es necesario
frotis, para esto se debe tomar en cuenta si el medio de cultivo es
l"quido o solido. !n medio liquido se toma una o varias cargas con el asa y se colocan en el portaobetos. !n caso de medio solido se debe poner previamente una gota de agua en el portaobetos, despues se toma con el asa una muestra de bacteria y se coloca en la gota de agua /aciendo con el asa cargada ondulaciones para dispersar. 0espu+s se debe
fijar, esto provoca cambio en la composición fisicoqu"mica de las
bacterias, ocasionando que la bacteria conserve una estructura lo mas similar a cuando se encontraba viva. %a fiación es utilizada para ad/erir las bacterias al portaobetos formando una pared celular m&s permeable para que impida el paso de colorantes, tambien impide el arrastre de m.o. !ste procedimiento puede ser realizado pasando el portaobetos r&pidamente por la flama de un mec/ero bunsen para que la bacteria no se incinere, esto se revisara poniendo el portaobetos en el dorso de tu mano para determinar que la temperatura de este no sea muy elevada.1abe mencionar que para la fiación tambien se puede utilizar agentes qu"micos tales como$ formol o etanol.
3.-MATERIA • • • • • •
Portaobetos 2ec/ero 3unsen sa de siembra 1ubeta de tinción o similar 1olorantes para tinciones$ 1ristal violeta, %ugol, co/ol-cetona (4$4) y safranina. #ubos con cultivos de bacterias ram-positivas y ram-negativas.
!.- CEPAS MICROBIANAS
tap/ylococus aureus !sc/eric/ia coli ac/aromyces cerevisiae 2o/os que se encuentran disponibles
".- METODOO#IA 4.- Realización del frotis y la fiación de los diferentes cultivos de bacterias$ se proceder& tal y como se /a descrito anteriormente. 5.- #inciones$
A$ TINCI%N SIMPE !s la tinción en que se utiliza un solo colorante. 1omo colorantes utilizaremos el azul de metileno o la safranina, ambos de naturaleza b&sica. %a t+cnica es la siguiente$ 6. 66. 666. 68.
7acer el frotis, secarlo y fiarlo 1ubrir con colorante la preparación y dearlo actuar durante un minuto. %avar suavemente con agua destilada para eliminar el eceso de colorante ecar al aire y observar al microscopio con el obetivo de inmersión (499) empleando el aceite apropiado
!sta t+cnica permite observar la morfolog"a y el tamaño de las bacterias, asi como los tipos de agrupaciones que forman.
B$ TINCION DE #RAM es la tinción diferencial mas utilizada en bacteriolog"a pues permite separar las bacterias en dos grupos, las ram-positivas y las ram-negativas. %a tinción de ram requiere cuatro soluciones$ 4.
Pri&'r (o)ora*t'. !s un colorante b&sico que en contacto con las c+lulas cargadas
negativamente, reacciona con ellas colore&ndolas. !l mas utilizado es el cristal violeta. 5.
So)+(i,* &ori'*t'. :ia las tinciones y aumenta la afinidad entre el colorante y las
c+lulas. %os mordientes empleados suelen ser sales met&licas, &cidos o bases, como, por eemplo, una solución diluida de yodo. ;. A'*t' '(o)ora*t'. !s un disolvente org&nico, por eemplo, alc o/ol-acetona (4$4).
<.
Co)ora*t' (o*trast'. !s un colorante b&sico de distinto color que el primer colorante,
como, por eemplo, la safranina. %os dos grupos bacterianos a los que anteriormente nos refer"amos
difieren en el color con el que finalmente aparecen. %as bacterias ram
positivas se teñir&n de azul por el cristal violeta y no perder&n esta coloración durante los pasos sucesivos. %as bacterias ram negativas perder&n la coloración inicial del cristal violeta en los siguientes pasos y se teñir&n de rosa debido a la safranina. %a diferencia esta determinada por la composición de su envoltura celular. %as bacterias ram positivas poseen una malla de peptidoglicano en su parte m&s eterna, mientras que las bacterias ram negativas, recubriendo en una fina capa de peptidoglicano, presentan una membrana eterna que envuelve toda la c+lula. !l m+todo de tinción es el siguiente$ 4. 5. ;. <.
eparar el frotis, se seca y se fia e cubre con cristal violeta durante un minuto %avar suavemente con agua destilada para eliminar el eceso de colorante acudir un poco y sin dear cubrir el frotis con 5 gotas de lugol por ;9 segundos. !l
lugol acta como mordiente aumentando la afinidad del colorante por la bacteria. =. %avar con agua el eceso de lugol >. e gotea alco/ol-acetona de forma continua /asta que la preparación dee de perder color y se lava enseguida con agua abundante. ?. e cubre la preparación con un colorante de contraste, como la safranina, durante ;9 segundos. @. e lava con agua y se seca al aire, observ&ndose a continuación con el obetivo de inmersión. ;.- Abservación de las tinciones de bacterias al microscopio %as bacterias ram-positivas presentar&n una coloración violeta mientras que las ram-negativas la presentaran roa o rosa. %a identificación de las bacterias ram positivas puede ser problem&tica, solamente cuando las bacterias ram-positivas se encuentren en crecimiento eponencial (cultivos ovenes) la reacción es clara* en fase estacionaria (cultivos vieos) las bacterias ram-positivas pueden ser ramnegativas.
6.-RESUTADOS
%as tinciones que se realizaron fueron de !.coli y de 1ocos, y se observaron al microscopio. %as formas y colores son iguales a las im&genes que se encuentran en internet. %as siguientes im&genes fueron las observadas durante la realización de la practica.
!streptococos tomada en el lab.
!streptococos imagen de internet.
/.-CONCUCI%NES e llego a la conclusión de que el procedimiento de tinción debió ser realizado cuidadosamente debido a que si no es as" el resultado ser& erróneo. Para esto es necesario leer previamente el manual antes de realización el procedimiento tomando en cuenta los conseos del profesor, cabe mencionar que para este procedimiento fue necesario tener a la mano un cronometro para que se tomen los tiempos señalados en la practica con la mayor eactitud posible. !ste procedimiento definió que tipo de bacterias est&n presentan los
medios de cultivo realizados con anterioridad, tales como$ los e. cocos a los cuales se les aplico la tinción de ram para poderse observar en el microscopio estos, tomaron su color caracter"stico (violeta) debido a que son bacterias ram-positivas en forma de racimos de uva. #ambi+n se observaron bacterias del tipo ram-negativas tales como$ esc/eric/ia coli, aplicando el procedimiento de tinción simple. !s importante señalar que dependiendo del tipo de bacteria que se desee observar en el microscopio, le corresponder& su determinada tinción.
0.- CUESTIONARIO 1. R'a)ia ') 's+'&a ' )a r'ara(i,* '* fr's(o ') &o4o o5s'rao. 2. r'a)ia +* 's+'&a ' )o o5s'rao '* ') &i(ros(oio '* )a si+i'*t' ta5)a 3.7C+8)'s so* )os i*(o*'*i'*t's a) r'a)iar +* frotis (o* ra* (ara &i(ro5ia*a9 Porque quedar& un frotis grueso, la luz no pasar& y no observaremos.
!. 7C+8) 's )a fi*a)ia ' o5s'rar +*a &+'stra '* fr's(o9 Para ver el organismo vivo.
". 7Por +: s' (o)o(a +* (+5r'o5j'tos so5r' )a &+'stra9 Para tener una muestra uniforme bien etendida entre el cubreobetos y el portaobetos de lo contrario no se lograr"a un buen enfoque y por consiguiente una buena observación
6. 7C+8) 's ') ro,sito ' fijar )os frotis9 poder aplicar los m+todos /abituales de tinción que permiten la observación al microscopio de las bacterias sin que la muestra sea arrastrada en los sucesivos lavados.
/. 7C,&o af'(ta )a 'a ') (+)tio '* )a t:(*i(a ' #ra&9 e puede correr el riesgo que bacterias gram positivas se tiñan como gram nega tivas
0.7Por +: )a ti*(i,* ' #ra& *o s' '&)'a ara &o4os9
Por que se tiñen con irregularidad, y la tinción de ram es eclusiva para bacterias ram positivas y negativas.
;.7C+8*o 's r'(o&'*a5)' +ti)iar +*a ti*(i,* ' si&)' < +' (o)ora*t' +ti)iar=as9 !s especialmente til para detectar la presencia de bacterias en muestras naturales, puesto que la mayor parte del material no celular no se tiñe. e utiliza el azul de metileno.
1>. 7C+8) 's )a fi*a)ia ' +ti)iar ') 5ar*i ' +?as '* )as r'ara(io*'s '* fr's(o9 Para que la preparación dure mas y se sellen los bordes del cubreobetos.
;.- BIBIO#RA@IA 4.- 1onsultado en$ /ttp$BBes.scribd.comBdocB@9CC@=C
