Tinciones

1

TINCIONES Tinciones o Coloraciones Las tinciones tinciones son un conjun conjunto to de proces procesos os que conduce conducen n a la colora coloració ción n de las estructu estructuras ras que componen a las células, bacterias, hongos y parásitos. Esto tiene por objeto el aumentar el contraste entre esas estructuras y el medio que las rodea, y permite por tanto que las células sean visualizadas microscópicamente con mayor facilidad.

Frotis Un frotis de sangre es un mecanismo científico que consiste en el extendido de una gota de sangre en la superficie de un portaobjetos o de un cubreobjetos, con el fin de analizarla posteriormente; es más adecuado emplear sangre que aun no ha estado en contacto con el anticoagulante, pues este podría alterar los resultados (algunos anticoagulantes tienden a deformar las cé lulas de la sangre)

Importancia del Frotis      

La valoración de la estimulación eritropoyetica. Las anomalías en la maduración nuclear y citoplásmica de las células hemáticas. Los trastornos en la arquitectura de las células al formarse en la médula ósea. Las alteraciones singulares en la forma de las células, que son una identificación especifica de algunas enfermedades. Algún indicador de los efectos nocivos de la quimioterapia y de la radioterapia. La diferenciación y recuento de los elementos celulares de la sangre.

TIPOS DE TINCIONES TINCIONES VITALES Y NO VITALES  Las tinciones vitales y supravitales: son aquellas que se practican sobre células que están vivas.  Las tinciones vitales: son aquellas que se efectúan sobre células que están vivas, mediante la  

introducción de un colorante en la circulación de un organismo vivo. Son colorantes vitales, por  ejemplo, el verde Jano y el azul de metileno. Las tinciones supravitales: son aquellas que se realizan sobre células o tejidos vivos, pero que están aislados del organismo del que proceden. Las tinciones no vitales: se realizan sobre células muertas. La coloración de células muertas requiere un proceso previo de fijación, que tiene por objeto el mantener inalterada su estructura y el adherirlas firmemente a la superficie del portaobjetos. La fijación puede realizarse mediante calor, aunque habitualmente se realiza con etanol o metanol.

Coloración panóptica 

 



Hay combin combinaci aciones ones de colora colorante ntess que dan lugar lugar a tincio tinciones nes polícr polícroma omas. s. Una colora coloració ción n es  panóptica cuando se utilizan sucesivamente sustancias colorantes neutras y es pancrómica cuando se aplican todas las sustancias colorantes neutras juntas. El primero que tuvo la idea de realizar una de estas combinaciones fue Romanowsky, y los colorantes hematológicos utilizados en la actualidad suelen derivar del que él preparó. Los colorantes de tipo Romanowsky constan de un colorante ácido (eosina) y de colorantes básicos (tiac (tiacina inas). s). Las tiacin tiacinas as son el azul azul de metile metileno no y sus deriva derivados dos obteni obtenidos dos por desmet desmetila ilació ción n oxidatiya (colorantes tipo azur). Las tinciones realizadas con colorantes de tipo Romanowsky, que más frecuentemente se emplean en el diagnóstico hematológico, son la de Wright y la de Giemsa (utilizada sola o en combinación con la de May-Grünwald).

2

TINCIONES PANÓPTICAS RÁPIDAS Tinciones fluorescentes: emplean colorantes (fluorocromos) que se fijan a las células y que, cuando son estimulados por una luz ultravioleta, emiten una radiación visible, de un color característico. Los fluorocromos más utilizados en esta clase de tinciones son el naranja de acridina y el rojo neutro.

Tinciones citoquimicas: demuestran la presencia, más o menos abundante, o la ausencia de deteminadas sustancias, localizadas en el interior de los gránulos citoplasmáticos de los leucocitos. Sirven para reconocer células leucocitarias (normales o anómalas) y, por tanto, para diferenciar unas clases de leucemias de otras. Por ejemplo, un colorante preparado a base de diaminobenzidina y de agua oxigenada, descubre la presencia de peroxidasa endocelular, y por consiguiente permite atribuir el origen de unas células leucocitarias inmaduras a la línea granulocítica o a la monocítica.

DENOMINACIÓN DE LAS ESTRUCTURAS COLOREADAS. Estructuras acidófllas u oxifilas: son aquellas que fijan colorantes de naturaleza ácida. Si el colorante ácido que captan es la eosina, se dice que son eosinófilas. Con las tinciones tradicionales adquieren un color rosado.

Estructuras basófllas: son aquellas que fijan colorantes de naturaleza alcalina. Con las tinciones tradicionales adquieren un color azulado. Si se tiñen de lila o púrpura con colorantes de tipo azur, se llaman azurófllas.

CAUSAS DE ERROR EN LAS TINCIONES REALIZADAS A FROTIS SANGUÍNEOS. Si la tinción de una extensión sanguínea es demasiado rosa, probablemente esto se deba a:  Un pH bajo del colorante.  Un tiempo de coloración insuficiente.  Un lavado excesivamente prolongado. Si la tinción es demasiado azul, posiblemente, esto esté causado por: un grosor excesivo de la extensión, o un pH alto del colorante.  Una coloración excesivamente prolongada.  Un lavado insuficiente. Si tras la tinción aparecen artefactos o/y precipitados en la extensión, probablemente esto se deba a:  Un empleo de portaobjetos sucios.  Una falta de filtración del colorante.  Una coloración excesivamente prolongada.  Un secado del colorante durante la tinción.  Un lavado insuficiente. Muchos de estos errores pueden obviarse utilizando teñidores automáticos de las extensiones sanguíneas. Actualmente, no suelen emplearse en la práctica clínica.

3

Tinción de Romanowsky La tinción de Romanowsky es una mezcla que contiene azul de metileno y eosina y que se utiliza para  preparar frotis para análisis sanguíneos como base de diversos colorantes, como los de Wright, Giemsa o Leishman. La tinción de la muestra permite distinguir la forma, tamaño y contorno de los hematíes, leucocitos y  plaquetas y el núcleo, citoplasma y granulaciones de las distintas células ya que adquieren diferentes colores: azul, púrpura, rosa o salmón. Esta separación por colores es el llamado efecto Romanowsky, que tiñe de púrpura a los núcleos y gránulos neutrofílicos y de color rosa a los eritrocitos. Los ácidos nucleicos, las proteínas y el citoplasma se tiñen de azul, delatando a los posibles parásitos.

Tinción de Giemsa La tinción de Giemsa es un método habitual para el examen de frotis sanguíneos, cortes histológicos y otro tipo de muestras biológicas. Este método tiene utilidad sobre todo para poner de manifiesto las ricketsias localizadas dentro de la célula huéspedes. La coloración de giemsa se emplea también para teñir frotis de sangre en el examen para protozoos. Se puede emplear, como variaciones, otras coloraciones como es la técnica de citoconcentración para parásitos sanguíneos, la cual tiene un bajo coste y ofrece la posibilidad de aislar e identificar en el mismo sedimento el parásito principal, con excepción de los trofozoitos jóvenes y el plasmodium falciparum.

Fundamento de la tinción de Giemsa Estos organismos adquieren una coloración diferencial y se ven dentro del citoplasma de la célula huésped. La técnica de Giemsa está formada por varios colorantes: los tintes neutros utilizados combinan el azul de metileno como tinte básico y la eosina como tinte ácido, lo que da una amplia gama de colores. El azul de metileno es un colorante metacromático, de ahí que muchas estructuras se tiñan de púrpura y no de azul. El pH de la solución de coloración es crítico y se debe ajustar idealmente según diversos fijadores. La gama del pH debe estar entre 6.4 y 6.9

Procedimiento    

Realizar el extendido. Fijar con Metanol durante 3 minutos y dejar secar. Cubrir el extendido con colorante y dejar entre 3 y 5 min. Lavar con agua destilada y dejar escurrir hasta secar.

Tinción de Wright 

La tinción de Wright es una tinción de tipo Romanowsky.  Es extremadamente importante en el laboratorio de hematología este tipo de tinción, ya que puede obtenerse una cantidad abundante de información a partir del examen de un frotis de sangre  periférica bien teñido  Una tinción de Romanowsky consiste en azul de metileno y sus productos de oxidación, así como eosina Y o eosina B  La acción combinada de estos colorantes produce el efecto Romanowsky y da una coloración  púrpura a los núcleos de los leucocitos y a los gránulos neutrofílicos y de color rosado a los eritrocitos. Los componentes de este efecto son el azul B y la eosina Y Las propiedades de tinción de Romanowsky dependen del enlace de los colorantes a las estructuras

4 químicas y de las interacciones del azul B y la eosina Y. Los agrupamientos de ácidos nucleicos, las  proteínas de los núcleos celulares y el citoplasma inmaduro reactivo, fijan el azul B, colorante básico  La eosina Y, colorante ácido, se fija a los agrupamientos básicos de las moléculas de hemoglobina y a las proteínas básicas.

Procedimiento     

Realizar la extensión sin dejar escurrir, secar al aire sin fijar. Cubrir la totalidad del extendido, en cantidad suficiente para evitar la evaporación. Transcurridos 5 – 7 min agregar igual cantidad de solución amortiguadora o en su defecto agua destilada, evitando que se derrame. Transcurridos 20 – 25 min lavar con abundante agua del chorro con cuidado para evitar arrastrar el frotis. La aparición de una espuma verdosa es indicativo del final del tiempo de tinción.

Tinción de Gram La tinción de Gram o coloración Gram es un tipo de tinción diferencial empleado en microbiología  para la visualización de bacterias, sobre todo en muestras clínicas. Debe su nombre al bacteriólogo danés Christian Gram, que desarrolló la técnica en 1884. Se utiliza tanto para poder referirse a la morfología celular bacteriana como para poder realizar una primera aproximación a la diferenciación  bacteriana, considerándose Bacteria Gram positiva a las bacterias que se visualizan de color violeta y Bacteria Gram negativa a las que se visualizan de color rosa.

Fundamento de la tinción de Gram  







El cristal violeta (colorante catiónico) penetra en todas las células bacterianas (tanto Gram positivas como Gram negativas). El lugol está formado por I2 (yodo) en equilibrio con KI (yoduro de potasio), el cual está presente  para solubilizar el yodo. El I2 entra en las células y forma un complejo insoluble en solución acuosa con el cristal violeta. La mezcla de alcohol-acetona que se agrega, sirve para realizar la decoloración, ya que en la misma es soluble el complejo I2/cristal violeta. Los organismos Gram positivos no se decoloran, mientras que los Gram negativos sí lo hacen. Para poner de manifiesto las células Gram negativas se utiliza una coloración de contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina. Después de la coloración de contraste las células Gram negativas son rojas, mientras que las Gram positivas  permanecen azules. La safranina puede o no utilizarse, no es crucial para la técnica. Sirve para hacer una tinción de contraste que pone de manifiesto las bacterias Gram negativas. Al término del protocolo, las Gram  positivas se verán azúl-violáceas y las Gram negativas, se verán rosas (si no se hizo la tinción de contraste) o rojas (si se usó, por ejemplo, safranina)

Tinción de Ziehl-Neelsen La tinción de Ziehl-Neelsen (BAAR) es una técnica de tinción diferencial rápida y económica, para la identificación de microorganismos patógenos, por ejemplo M. tuberculosis. Este método se basa en que las paredes celulares de ciertos parásitos y bacterias contienen ácidos grasos (por ejemplo, el ácido micólico) de cadena larga (50 a 90 átomos de carbono) que les confieren la propiedad de resistir la decoloración con alcohol-ácido, después de la tinción con colorantes básicos. Por esto se denominan ácido-alcohol resistencia|bacilos ácido-alcohol resistentes o BAAR. Las Mycobacterium|micobacterias como Mycobacterium tuberculosis|M. tuberculosis y Mycobacterium

5 marinum|M. marinum y los parásitos con la coloración clásica de Ziehl-Neelsen requiere calentamiento  para que el colorante atraviese la pared bacteriana que contiene ceras.

Procedimiento clásico 1. Hacer un frotis de la muestra de esputo. 2. La fijación al calor asegurará de que el frotis quede adherido al portaobjetos. Un frotis muy delgado   puede darle resultados falsamente negativos y un frotis muy grueso puede desprenderse del  portaobjetos durante la tinción. 3. Utilizando pinzas, coloque los portaobjetos en una gradilla de tinción con los extendidos hacia arriba. Coloque todos los portaobjetos orientados uniformemente, con el frotis hacia arriba. Nunca tiña más de 12 portaobjetos a la vez. 4. Dejar el frotis sobre el puente de tinción. 5. Aplicar fucsina-fenicada. 6. Deje que el colorante permanezca sobre los portaobjetos durante 5 minutos. Mantenga el calor  durante este período. 7. Calentar con un mechero hasta la emisión de vapores (3-5 minutos). 8. Se requiere el tiempo adecuado para que la fucsina fenicada penetre y tiña la pared celular de la  bacteria. No deje que hierva o se seque el colorante. 9. Lave suavemente el colorante de cada portaobjetos con agua corriente fría hasta que toda la tinción libre quede lavada. Lave suavemente de manera que el extendido no se barra del portaobjetos. Retire el exceso de agua. 10. Decolorar con alcohol-ácido. 11. Cubra cada portaobjetos con la solución decolorante, tal como alcohol ácido y manténgalo sobre el  portaobjetos durante 3 minutos. Si no se decolora suficientemente, el contenido del esputo que no son bacilos TBC puede permanecer teñido. Enjuague con agua una vez más los portaobjetos y quite el exceso de agua. Si los portaobjetos aún están rosa, aplique una cantidad adicional de la solución decolorante de 1 a 3 minutos. 12. Aplicar azul de metileno (1 minuto). 13. Aplique la solución de contraste, azul de metileno, durante 1 minuto. 14. Enjuagar con agua 15. Vuelva a enjuagar con un leve chorro de agua e incline cada portaobjetos hasta drenar el exceso de agua. Finalmente, coloque cada portaobjetos en una gradilla a que sequen al aire.

Procedimiento en frío 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.

Hacer un frotis. Dejarlo en el puente de tinción. Aplicar fucsina-fenicada (solución con fenol y mayor concentración de fucsina). Dejar en vasos coplin durante 20 minutos. Decolorar con alcohol acido. Lavar con agua del grifo. Contrastar con azul de metileno

Tinción Negativa Tinción negativa es una técnica de microscopía que permite contrastar las muestras mediante una sustancia opaca a los fotones (microscopía óptica) o a los electrones (microscopía electrónica). En el  primer caso, se emplea nigrosina o tinta china; para el caso de bacterias que esporulan, esta técnica  permite visualizar las esporas como entes refringentes sobre un campo de fondo oscuro.[1] En caso de microscopía electrónica de transmisión, se emplean sustancias de alto número atómico que, por tanto, resultan opacas a los electrones transmitidos. Típicamente, estas sustancias son acetato de uranilo,

6 citrato de plomo o molibdato de amonio. Al eletrónico, esta técnica permite visualizar virus, flagelos,  bacterias y otros entes de escaso tamaño.

Lugol El lugol o solución de Lugol es una solución de yodo diatómico|I2 (1%) en equilibrio con yoduro de  potasio|KI (2%) en agua destilada. Fue nombrada en honor al médico francés Jean Guillaume Auguste Lugol|J. G. A. Lugol. Este producto se emplea frecuentemente como desinfectante y antiséptico, para cubrir deficiencias de yodo, y para la desinfección de agua en emergencias. En microbiología, es empleado en la tinción de Gram para retener el colorante cristal violeta. El I2 entra en las células y forma un complejo insoluble en solución acuosa con el cristal violeta. JHA Este reactivo reacciona con algunos polisacáridos como los almidones, glucógeno y ciertas dextrinas, formando un complejo de inclusión termolábil que se caracteriza por ser colorido, dando color  diferente según las ramificaciones que presente la molécula. El yoduro de potasio es agregado para aumentar la solubilidad del yodo diatómico por formación del anión triatómico I3-. Además se utiliza como antiséptico y en determinación de algunos polisacáridos, como el almidón o el glucógeno. Frente a la presencia de estos, vira al color negro-morado. También es usado para contrastar estructuras parasitarias como huevos y quistes Gracias