TÉCNICAS DE TINCIÓN BUELVAS MONTES, Yaleyvis1. MORALES MOLINA, Laura! ! MEDINA, "e#r$ ! L$%& 'u! SARMIENTO "I(ERES, Ya#ira! SANC)E* CASTILLA, A%#res UNIVERSIDAD DE CARTA+ENA, ACULTAD DE IN+ENIER-A. I%&e%iera #e ali/e%0$s 23421 RESUMEN. El objetivo principal de la práctica desarrollada consiste en identificar de manera correcta y precisa las distintas colonias obtenidas en los medios de cultivos presentes en el laboratorio de microbiología microbiología de la universidad universidad de Cartagena, para ello se realizó realizó como procedimiento procedimiento experimental los métodos propuestos por la técnica diferencial de Cristian Gram la cual se basa en el contenido de peptidoclugano ue tienen ciertas bacterias en su pared celular obteniendo de esta manera la clasificación de Gram positivas o Gram negativas, por otra parte también se desarrolló la tinción t inción selectiva de capsulas, en la cual se buscaba identificar la presencia de esta estructura ue pueden desarrollar algunas bacterias! "as colonias estu estudi diad adas as de E. Coli Coli , Staphy Staphyloc lococc occus us aueres aueres.. Strep Streptoc tococc occus us aureus aureus,, mostra mostraron ron resultados co#erentes con respecto a la información bibliográfica obtenida de ambos en cuanto cuantos s a sus caracter característ ística icas s morfol morfológi ógicas cas microscó microscópic picas, as, por por su parte parte la tinció tinción n de capsulas mostro, la presencia presencia de esa estructura estructura en la colonia tomada tomada a partir de un cultivo de agar nutritivo! $e los resultados se puede concluir ue los cultivos estudiados presentan cierto grado de pureza en el ambiente en cual están siendo incubados, ya ue no mostraron crecimiento contaminante!
"ALABRAS CLAVES. %acterias, tinción, capsula, gram!
ABSTRACT. &#e main objective of t#e developed practice is to correctly and accurately identify different colonies obtained in t#e media of crops present in t#e laboratory of 'icrobiology of t#e (niversity of Cartagena, it conducted as experimental procedure t#e met#ods proposed by t#e differential tec#niue of Cristian Gram )#ic# is based on t#e content of peptidoclugano )#o #ave certain bacteria in t#eir cell )all t#us obtaining t#e classification of Gram positive or Gram negative, on t#e ot#er part also developed t#e selective staining of capsules, in )#ic# )e soug#t to identify t#e presence of t#is structure )#ic# can develop some bacteria! &#e colonies studied in E! Coli, *tap#ylococcus aueres! *treptococcus aureus, s#o)ed consis consisten tentt result results s )it# )it# respe respect ct to t#e bibli bibliogr ograp# ap#ic ic infor informat matio ion n obtai obtained ned bot# bot# in many many micros microscop copic ic morp# morp#olo ologic gical al c#arac c#aracter terist istics ics,, on t#e ot#er ot#er #and #and t#e stain staining ing of capsul capsules es s#o)ed, t#e presence of t#is structure in t#e colony ta+en from a crop of nutrient agar! &#e results it can be concluded t#at crops studied #ave some degree of purity in t#e environment in )#ic# are to be incubated, since t#ey s#o)ed no polluting gro)t#!
5EY6ORDS. %acteria, staining, capsule, gram!
INTRODUCCIÓN
"os microorganismos se encuentran ampliamente distribuidos, pero no reuieren de mayor espacio para su continua reproducción, el principal en microscopio óptico es la falta de contrasté entre la célula en observación y el medio ue la rodea, la manera masa simple de facilitar el contrasté es la utilización de colorantes, revelándola presencia de determinados constituyentes celulares, talles cómo flagelos, esporas, capsulas, paredes celulares, centros de actividad respiratoria, etc! ara bacterias, el proceso de fijación por calor es lo más #abitual, fijación produce #abitualmente el encogimiento de las células- latincito, por el contrario, #ace ue las células parezcan mayores de lo ue son realmente! "a mayoría de los colorantes son compuesto orgánicos ue tienen alguna afinidad por los materiales celulares! .lgunos colorantes te/irán mejor sólo después de ue la célula #aya sido tratada con otra sustancia uímica, ue no es un colorante por sí mismo! Esta sustancia se denomina mordiente- un mordiente #abitual es el ácido tánico! El mordiente se combina con un constituyente celular y lo altera de tal modo ue a#ora sí podrá atacar el colorante!(na técnica de coloración y la más conocida es la tinción de Gram, denominada así por el bacteriólogo danés C#ristian Gr am, uien desarrollo esta técnica en 0122! *obre la base dela tinción de gran, las bacterias se clasifican en dos grupos3 gran
positivos y gran negativos! En cuanto a la tinción de gran la secuencia es la siguiente3 el frotis bacteriano se fija con calor se ti/e con cristal violeta por min, se lava con agua, se la aplica un mordiente por 0 min y se lava nuevamente con agua, después se decolora con una mezcla alco#ol etílico4acetona! Escurrir y cubrir con safranina 5color de contraste6 durante 0min lavar y secar!
"as bacterias Gram positiva y Gram negativas ti/en de forma distinta debido a las diferencias constitutivas en la estructura de sus paredes celulares! "a pared de la célula bacteriana sirve para definir su tama/o y su forma al organismo así como para prevenir la lisis osmótica! "a pared dela células Gram positivas es gruesa y consiste en varias capas interconectadas de péptido galicano 5cadenas lineales de un polisacárido formado por residuos alternativos de 78acetil glucosamina y 78acetil muriático unidos mediante un enlace6 y un poco de ácido técnico 5forman parte de la gruesa capa de péptido galicana ue rodea a la membrana plasmática y están directamente unidos a él mediante un enlace fosfodiéster! $e este modo pueden conectar varias capas de péptido glicina6, mientras ue las bacterias Gram negativas se componen de una capa delgada de péptido galicana y está rodeada por una capa exterior de "impopo lis acáridos 5forma parte de la pared de la pared celular de l as bacterias Gram8negativas! &ienen carácter antipático, presentan carga negativa, y repelen moléculas #idrofóbicas! *on tóxicos para el #ombre, y también se llaman endotoxinas6
por lo cual estas dos tipos de bacterias se ti/en de diferente c olor y es posibleidentificarlas como Gram positiva o Gram negativa!
gramnegativas se encuentran en la misma situación! *e lleva a cabo después de la decoloración, usando bien alco#ol o bien acetona, sustancias en las ue es soluble el complejo yodo < cristal violeta! .lgunos organismos 5grampositivos6 no se decoloran mientras ue otros 5gramnegativos6 lo #acen! "a diferencia esencial entre esos dos tipos de células está, por lo tanto, en la resistencia a la decoloración! $espués de la decoloración las células grampositivas son todavía azules, pero las gramnegativas son incoloras! ara poner de manifiesto las células gramnegativas se utiliza una coloración de contraste! 9abitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina básica! $espués de la coloración de contraste las células gramnegativas son rojas mientras ue las grampositivas permanecen azules!
MARCO TEÓRICO. Ti%7i8% #e +ra/
&ambién puede utilizarse a menudo un método ue no ti/e igualmente todas las células, un proceso denominado tinción diferencial! "a tinción de este tipo más extensamente utilizada es la tinción de Gram, denominada así por el bacteriólogo danés 9ans C#ristian Gram, uien la desarrollo! *obre la base de su reacción a la tinción de Gram, las bacterias pueden dividirse en dos grupos, grampositivas y gramnegativas!
$ebido a su importancia en taxonomía bacteriana y a ue indica diferencias fundamentales de la pared celular de las distintas bacterias, describiremos auí con cierto detalle la tinción de Gram! "as células fijadas al calor sobre un portaobjetos se ti/en primero con una solución de cristal violeta 5otros colorantes básicos no son tan efectivos6 y son lavadas después para uitar el exceso de colorante! En este estado todas las células, tanto las gramnegativas como las grampositivas, están te/idas de azul! El portaobjetos se cubre entonces con una solución de yodo 5:;6 < yoduro potásico 5=:6! El ingrediente activo es auí el yodo, el yoduro potásico simplemente #ace soluble el yodo en agua! El yodo entra en las células y forma un complejo insoluble en agua con el cristal violeta! $e nuevo tanto las células grampositivas como las
$eben destacarse dos aspectos cruciales de la tinción de Gram3
06 El tratamiento con cristal violeta debe preceder al tratamiento de yodo! El yodo por sí solo tiene poca afinidad con las células!
;6 "a decoloración debe realizarse con poco agua para evitar ue pierdan la tinción las células grampositivas! El proceso de decoloración debe ser corto y es esencial un cálculo preciso del tiempo para obtener resultados satisfactorios!
>inalmente, el carácter de grampositivo no es siempre un fenómeno del todo o nada! .lgunos organismos son más grampositivos ue otros y algunos
son gramvariables, es decir, unas veces grampositivos y otras gramnegativos! "a tinción de Gram es uno de los métodos de tinción más importantes en el laboratorio bacteriológico
Ti%7i8% 97i#$ resis0e%7ia
:
rosa mientras ue las endosporas contin?an con su color verde del verde malauita!
al7$;$l
Esta tinción sirve principalmente para clasificar micobacterias y actinomicetos, ue tienen un alto contenido en lípidos y en ácidos micólicos y ue no pueden ser calificadas por la tinción de Gram! ara empezar se #ec#a sobre el portaobjetos una mezcla de fucsina < fenol, en la ue la fucsina #ace de colorante rosa y el fenol de mordiente! "as células se ti/en de rosa, tanto los ácidos < alco#ol sensible como las resistentes! $espués se usa un decolorante orgánico ue #ace ue las bacterias ácido < alco#ol sensibles se decoloren mientras ue las ácido < alco#ol resistentes se uedan rosa! Como en la tinción de Gram se utiliza un colorante de contraste ue en este caso es el azul de metileno ue ti/e las células ácido < alco#ol sensible de color azul uedando las células ácido < alco#ol resistente de color rosa!
MATERIALES Y E=UI"OS •
Ti%7i8% #e es<$ras •
*e utiliza para te/ir las estructuras de resistencia llamadas endosporas bacterianas! *obre el portaobjetos con la preparación se ec#a verde malauita ue ti/e las células de verde! "uego se lava con agua destilada con lo ue las células se uedan incoloras y las endosporas permanecen verde! >inalmente se usa la safranina para obtener bacterias de color
&inción negativa Es el reverso del procedimiento de tinción usual3 las células se dejan sin te/ir pero se colorea un cambio el medio ue las rodea! "o ue se ve, por tanto, es el perfil de las células! "a sustancia utilizada para la tinción negativa es un material opaco ue no tiene afinidad por los constituyentes celulares y ue simplemente rodea las células, tal como la tinta c#ina 5ue es una suspensión de partículas de carbono coloidal6 o la nigrosina 5un colorante negro insoluble en agua6! "a tinción negativa es un modo satisfactorio de aumentar el contraste de las células en microscopia óptica, pero su máxima utilidad está en revelar la presencia de cápsulas alrededor de las células bacterianas!
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lacas con cultivos de bacterias3 lacas de .gar 7utritivo o con %acillius sp! 5bacterias Gram positivas6 lacas de =ing % con o seudomonas fluorescens, Esc#eric#ia coli, *treptococcus sp, *tafilococcus sp 5bacterias Gram negativas6! Cubeta para recoger colorantes! >rasco para desec#ar colorantes! >rasco con decolorante3 agua 50306 para desec#ar preparados! apel absorbente! Colorante de Gram3 cristal violeta, solución de yodo, alco#ol acetona, safranina! .ceite de inmersión! 'icroscopio! "aminas portaobjeto .sa de siembra
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muestro se a/adió el alco#ol cetona con el fin de remover las sustancias mencionadas anteriormente, por ?ltimo se a/adió el colorante de contraste o fucsina, "uego se lavaron con agua las preparaciones te/idas y dejando secar para examinar la preparación en el microscopio con un objetivo de inmersión de 0BBx!
.zul de metileno &inta c#ina
"ROCEDIMIENTOS "r$7e#i/ie%0$ #e >r$0is
*e tomaron porta8objetos limpios, marcado @ de Gram y uno para capsulas por cada grupo! . cada uno se le adiciono una gota de agua, luego se esterilizó el asa en la flama proveniente del mec#ero #asta tener un color rojo vivo! osteriormente se enfrío el asa tocando el borde del medio de cultivo proporcionado para así retirar después una peue/a porción de la colonia de bacterias a emplear, dispersando una gota de esta en el centro de uno de los porta objetos formando una película delgada! 7uevamente se realizó el mismo proceso con las demás colonias, teniendo en cuenta ue se debía esterilizar el asa reiteradamente al realizar cada proceso!
Ti%7i8% sele70iva $ %e&a0iva
.sí mismo se depositó una gota de la suspensión de microorganismos, con el asa previamente esterilizada, sobre un portaobjetos! ./adiendo una solución de tinta c#ina, mezclándola totalmente por la muestra y secándola al aire! or ?ltimo se analizó los distintos microorganismos ue aparecían sin te/ir en contraste con el fondo oscuro, mirando sus características en el microscopio!
DISCUSIÓN DE RESULTADOS. Ti%7i8% #i>ere%7ial #e +ra/.
"r$7e#i/ie%0$ #e >i?a7i8%@
"os frotis de cultivos se fijaron pasándolo repetida y rápidamente en el interior de la flama del mec#ero! Abservando ue el porta objetos uedara seco!
Ti%7i8% #i>ere%7ial #e &ra/
*e utilizaron dos gotas de cristal violeta para cubrir cada frotis de los porta objetos dejándolo actuar durante @B segundos! "uego e a/adio el lugol el cuales la sustancia necesaria para la fijación de colorante primario, posterior a esto una vez limpiado el lugol de la
i/a&e% 1. Mues0ra #e 7$7$s +ra/ %e&a0iv$s.
para este microorganismo en primera instancia se obtiene ue es una bacteria Gram positiva con forma circular o de cocos, de esta manera mediante su tinción diferencial se puede concluir ue este microorganismo contiene un pared celular una pared gruesa conformado principalmente peptidoglucano, dic#a estructura le confiere la capacidad de retención del primer colorante! "a imagen @, nos muestra una serie de bacillus Gram negativos, los cuales #acen referencia al género E. Coli ! $e los cuales también se puede inferir ue los resultados obtenidos concuerdan con los establecidos por las claves biouímicas de este género de bacteria, de lo ue podemos concluir ue los cultivos de la imagen ; y @, son cultivos ue #an mantenido su pureza durante el tiempo ue llevan en incubación!
I/a&e% . C$7$s +ra/ <$si0iv$s.
Ti%7i8% sele70iva.
I/a&e% . Bacillus +ra/ %e&a0iv$.
"os resultados obtenidos durante el desarrollo de la práctica de tinción diferencial de Gram arrojan los siguientes resultados! "a imagen 0 , estable e una serie de coccos Gram positivos, de lo cual mediante los resultados microscópicos obtenidos no se puede diferenciar o establecer la especie de la muestra o la colonia estudiada presente en el medio! or su parte la imagen ;! 'uestra una ser de coccos Gram positivos, pertenecientes a la especie Staphylococcus areus! $ic#a especie si s toma n cuenta las claves biouímicas establecidas
I/a&e% . Ti%7i8% #e 7a
"a tinción selectiva con tinta c#ina muestra ue la colonia estudiada presenta capsulas, ya ue se evidencia como #ay ciertas regiones la imagen donde la tinta c#ina no logro penetrar la
estructura estudiada, lo ue permite deducir ue el microorganismo puede sobrevivir en condiciones de estrés con el medio ya ue puede producir cápsulas o métodos de protección a ambientes adversos!
CONCLUSIÓN@
Gracias a estas se #ace posible comprender
la
tinción se convierte en una técnica por excelencia para lograr este objetivo porue permite crear un contraste entre la célula y el medio ue la rodea! .demás, tras #aber
•
analizado los distintos tipos de tinción
ue
existen,
podemos
resaltar ue la tinción de Gram
•
aparte de ser una de las técnicas más
usadas,
ofrece
también
•
muc#as ventajas sobre las demás! "ogrando ue se afirme ue sea una de las más importantes debido a su practicidad, entre otras cosas, para
reconocer
bacterias
ue
causan enfermedades o el uso de algunas de ellas en la ciencia y la
industria! or lo tanto, las tinciones en
general
son
de
suma
importancia debido a ue3
ermiten observar el contraste
entre
el
microorganismo
y
su
entorno, lo ue permite apreciar su estructura, clasificarlo!
y
esto
a
su
vez
las
REERENCIAS BIBLIO+RICAS. •
microorganismos,
estudiar
estructuras de la célula analizada!
$ebido a la dificultad a la #ora de observar
y
*.7&.'%A*:A, EduardoA&EG., 'arta- &rabajo práctico nD 2-&inción y observación de microorganismos!F;BB (7:HE*:$.$ &EC7A"AG:C. 7.C:A7." >.C("&.$ EG:A7." A*.:A $E.&.'E7&A $E :7GE7:E:. I(:':C. C.&E$. $E %:A&EC7A"AG:. DARNELL, J., et al. “Biología Celular y Molecular”. Eitorial M!ica "a#a$erica#a, Barcelo#a, %&&'. Cuarta eici(#. L)D*S+ +arey a# Ar#ol Ber-. %&&. Biología Celular y Molecular. eici(# Eitorial "a#a$erica#a Reista colo$/ia#a cie#cia e i#ge#ieria al ia0 1N*2ERS*DAD DE CAR3A4ENA5 CAR3A4ENA6 C)L)MB*A5 e#ero 7ulio e %&8'5 olu$e# 9 N:85 *SSN 8;&&6<=9>
